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siRNAs介导的基因沉默技术和相关应用的研究进展 被引量：3
1
作者 陈长宝 青春 陆树良 《上海第二医科大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第11期1184-1187,共4页
RNA干扰(RNA i)是由双链RNA(doub le-stranded RNA,dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默机制,是一古老的细胞反应通路,其在抵抗病毒感染、抑制转座子活动、调控内源性基因表达等方面发挥重要作用。近年来,短链RNA干扰(siRNAs)已成... RNA干扰(RNA i)是由双链RNA(doub le-stranded RNA,dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默机制,是一古老的细胞反应通路,其在抵抗病毒感染、抑制转座子活动、调控内源性基因表达等方面发挥重要作用。近年来,短链RNA干扰(siRNAs)已成功地应用于哺乳动物中,该文就其介导的基因沉默技术和相关应用的研究进展进行综述。 展开更多
关键词 RNA干扰 双链RNA 转录后基因沉默 短链RNA干扰 基因治疗
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质粒表达型siRNA对SARS-CoV复制与感染干扰的初步研究 被引量：5
2
作者 李阳 倪兵 +6 位作者 石辛甫 王希良 何仰东 肖宇 姜曼 黎万玲 吴玉章 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期91-94,共4页
目的　构建针对SARS CoV的特异性siRNA质粒 ,利用RNA干扰技术抑制该病毒复制与感染。方法　根据SARS CoV的全长基因序列 ,以 4个不同的部位为靶点 ,分别设计、合成含有 19nt干扰序列的一段寡核苷酸 ,将两两互补的寡核苷酸经退火后所形... 目的　构建针对SARS CoV的特异性siRNA质粒 ,利用RNA干扰技术抑制该病毒复制与感染。方法　根据SARS CoV的全长基因序列 ,以 4个不同的部位为靶点 ,分别设计、合成含有 19nt干扰序列的一段寡核苷酸 ,将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSilencer 3 .1 H1载体中 ,构建表达siRNA的质粒。采用脂质体法将质粒转染VeroE6细胞 ,经潮霉素抗性筛选后 ,再对稳定表达的细胞进行细胞病变、病毒空斑形成和MTT实验 ,以观察干扰效应。结果　对所构建的质粒分别测序 ,确定其含有siRNA的序列与预期的特异性干扰序列一致。用不同浓度的SARS CoV感染转染质粒后的细胞 ,与阴性对照相比 ,其细胞病变减轻、活细胞显著增加 ,病毒空斑明显减少。结论　利用RNA干扰能有效的抑制SARS CoV在细胞中的复制 ,并对细胞有保护作用 ,为预防、治疗SARS提供了新的思路和方法。 展开更多
关键词 SARS病毒 RNA干扰 小干扰RNA 基因治疗
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siRNA对HSC结缔组织生长因子的抑制作用 被引量：4
3
作者 李光明 谢青 +2 位作者 史毅 李定国 金由辛 《上海第二医科大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第2期116-119,共4页
目的研究化学合成的小分子干扰RNA (siRNA)对鼠肝星状细胞 (HSC)结缔组织生长因子 (CTGF)基因表达的抑制作用。方法针对大鼠CTGFmRNA 4 83、885和 94 6位点化学合成 3对 2 1核苷酸 (nt)siRNA ,分别以 5 0、10 0、2 0 0nmol/L浓度转染HSC... 目的研究化学合成的小分子干扰RNA (siRNA)对鼠肝星状细胞 (HSC)结缔组织生长因子 (CTGF)基因表达的抑制作用。方法针对大鼠CTGFmRNA 4 83、885和 94 6位点化学合成 3对 2 1核苷酸 (nt)siRNA ,分别以 5 0、10 0、2 0 0nmol/L浓度转染HSCT6 ,以空白及转染非特异siRNA作为对照 ,应用RT PCR检测CTGFmRNA表达 ,筛选出抑制效率最高的siRNA及其浓度 ;再转染HSCT6 ,抽提孵育 2 4、4 8、72h细胞总RNA及蛋白质 ,应用RT PCR和Westernblot检测CTGFmRNA及蛋白质表达。结果与对照相比 ,转染siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA表达水平明显降低 ,siRNA抑制效率在 5 0 ～2 0 0nmol/L范围呈浓度依赖性增高 ,以 4 83siRNA 2 0 0nmol/L最显著 ,转染非特异siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA表达水平无明显变化 ;转染 4 83siRNA的HSCT6细胞 2 4　 4 8、72hCTGFmRNA分别下调 (91± 2 ) %、(6 5± 3) % (P均 <0 .0 1)和 (10± 7) % (P =0 .0 6 34) ,蛋白分别下调 (86± 5 ) %、(94± 4 ) %和 (4 2± 9) % (P均 <0 .0 1)。结论化学合成 4 83siRNA能高效抑制HSC的CTGF基因表达 ,有效阻抑时间达 72h。 展开更多
关键词 mRNA表达 CTGF 转染 HSCT 结缔组织生长因子 化学合成 细胞 阻抑 小分子 总RNA
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Bcl-2 siRNA抑制HL-60细胞bcl-2基因表达 被引量：3
4
作者 雷小勇 燕春艳 +3 位作者 涂玉林 钟苗 冯兰芳 廖端芳 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期1445-1450,共6页
目的应用RNA干扰技术观察Bcl2siRNA对白血病细胞HL60中bcl2基因表达的影响,探讨siRNA技术在白血病治疗中的作用。方法利用化学合成法体外化学合成Bcl2siRNA,将Bcl2siRNA与HL60细胞共孵育,用MTT法、荧光染色观察细胞增殖及凋亡情况,用RT... 目的应用RNA干扰技术观察Bcl2siRNA对白血病细胞HL60中bcl2基因表达的影响,探讨siRNA技术在白血病治疗中的作用。方法利用化学合成法体外化学合成Bcl2siRNA,将Bcl2siRNA与HL60细胞共孵育,用MTT法、荧光染色观察细胞增殖及凋亡情况,用RTPCR检测Bcl2mRNA水平,用荧光染色测Bcl2蛋白水平。结果Bcl2siRNA与HL60细胞共孵育48h后,HL60细胞凋亡率增加,Bcl2mRNA水平下调,Bcl2蛋白表达水平降低。转染GAPDHsiRNA组的细胞对Bcl2表达无影响。结论Bcl2siRNA能够特异性降低Bcl2mRNA水平及蛋白质的表达,促进HL60细胞凋亡。 展开更多
关键词 RNA干扰 BCL-2 sirna HL-60
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C-erbB2基因siRNA质粒的构建、鉴定及转染 被引量：4
5
作者 赵东利 党诚学 隋燕霞 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期1870-1873,共4页
目的构建人C-erbB2干扰载体pGenesil-erbB2,并稳定转染入CerbB-2高表达的人结肠癌细胞株HT-29细胞,观察其对人结肠癌HT-29细胞从转录后水平对Her-2蛋白表达的影响。方法利用免疫组化方法筛选出CerbB-2高表达细胞株HT-29,以人C-erbB2cDN... 目的构建人C-erbB2干扰载体pGenesil-erbB2,并稳定转染入CerbB-2高表达的人结肠癌细胞株HT-29细胞,观察其对人结肠癌HT-29细胞从转录后水平对Her-2蛋白表达的影响。方法利用免疫组化方法筛选出CerbB-2高表达细胞株HT-29,以人C-erbB2cDNA基因为靶标设计RNA干扰片段和阴性对照片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-erbB,进行鉴定及测序,并稳定转染至HT-29细胞。结果测序证明人C-erbB2siRNA表达载体质粒pGenesil-erbB构建成功,pGenesil-erbB稳定转染入人结肠癌HT-29细胞,采用Westernblot实验证明pGenesil-erbB可显著抑制Her-2蛋白的表达。结论成功构建了人CerbB2干扰载体质粒pGenesil-erbB,稳定转染至结肠癌HT-29细胞株,并能抑制HT-29细胞的Her-2蛋白的表达,为靶向CerbB2的siRNA对结肠癌的放射增敏研究奠定了基础。 展开更多
关键词 载体构建 质粒 RNA干扰 CERBB2 sirna
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PCR扩增的shRNA表达盒快速筛选PRRSV有效siRNA序列 被引量：3
6
作者 贺云霞 华荣虹 +4 位作者 周艳君 安同庆 仇华吉 王云峰 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期376-380,共5页
有效siRNA的筛选是RNAi研究的关键点之一。本研究选取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N)作为靶基因,使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具,选取4个siRNA序列(siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294),利用一步... 有效siRNA的筛选是RNAi研究的关键点之一。本研究选取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N)作为靶基因,使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具,选取4个siRNA序列(siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294),利用一步PCR法产生包含U6启动子的短发夹RNA表达盒技术快速筛选高效siRNA,PCR法制备的shRNA表达盒(PCR-shRNA95、PCR-shRNA179、PCR-shRNA218和PCR-shRNA294)分别与表达N-EGFP融合蛋白的重组质粒pEN-ORF7共转染至293T细胞,48 h后荧光显微镜下检测细胞表达EGFP阳性率,筛选有效siRNA片段,将筛选的PCR-shRNA179的PCR产物转染N-EGFP融合蛋白稳定表达293T细胞系和PRRSV感染的Marc-145细胞,结果表明PCR-shRNA179可明显减少N蛋白的表达、有效减轻PRRSV引起的细胞病变及减少感染PRRSV的Marc-145细胞中的N蛋白阳性细胞。本研究证明一步PCR扩增shRNA表达盒法可用于筛选特异性基因表达抑制的siRNA。 展开更多
关键词 RNA干扰 sirna 短发夹RNA(shRNA) 猪繁殖与呼吸综合征病毒
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乙酰肝素酶基因siRNA表达载体的构建及其沉寂作用 被引量：2
7
作者 刘晓艳 方红 +3 位作者 羊正纲 张妤 阮黎明 蒋筱凌 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2007年第6期581-587,共7页
目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质... 目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人恶性黑素瘤细胞A375,采用半定量PCR测定HPSE基因RNA水平变化,Western blot检测HPSE蛋白表达的变化。结果:将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pRNATU6.1载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染A375细胞后,半定量PCR和Western blot检测显示,HPSE基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制HPSE的表达。 展开更多
关键词 寡核苷酸类 反义 葡糖醛酸糖苷酶 RNA 小分子干扰 RNA干扰 乙酰肝素酶 基因表达 黑色素瘤
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特异性针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因SiRNA表达载体的构建、鉴定及对高糖状态下INS-1细胞周期的影响 被引量：3
8
作者 梁华晟 薛耀明 钟宇华 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期2093-2096,共4页
目的构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响。方法根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pS... 目的构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响。方法根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro-GFP/Neo,并用RT-PCR和测序鉴定,将其转染至INS-1细胞中,Westernblotting观察PTH1R表达,鉴定其转染效率,筛选出最佳抑制基因后,应用流式细胞仪检测25mmol/LD-葡萄糖处理INS-1细胞周期。结果菌落RT-PCR及基因测序鉴定结果表明序列正确。并能成功转染到INS-1细胞株中,Westernblot筛选最佳抑制基因。细胞周期检测提示PTH1R沉默后抑制INS-1细胞从G0/G1期进入S期。结论成功构建并筛选出特异性沉默大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体,高糖状态下PTH1R表达可能为INS-1细胞自我保护的一种作用。 展开更多
关键词 甲状旁腺激素受体1基因 小干扰RNA 小发卡结构RNA 转染 RNA干扰 细胞周期
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siRNA对SARS冠状病毒复制的抑制作用 被引量：9
9
作者 赵慧 陈水平 +9 位作者 段鸿元 邓永强 姜涛 赵卓 于曼 康晓平 杨保安 李晓萸 秦成峰 秦鄂德 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期397-402,共6页
为探讨siRNA在哺乳动物细胞中对SARS冠状病毒复制的抑制作用,针对BJ0 1株SARS冠状病毒复制酶基因(Pol)和刺突蛋白基因(S) ,设计4个siRNA ,并构建相应的siRNA表达载体及克隆细胞系.利用间接免疫荧光法及实时定量反转录PCR法,检测所设计的... 为探讨siRNA在哺乳动物细胞中对SARS冠状病毒复制的抑制作用,针对BJ0 1株SARS冠状病毒复制酶基因(Pol)和刺突蛋白基因(S) ,设计4个siRNA ,并构建相应的siRNA表达载体及克隆细胞系.利用间接免疫荧光法及实时定量反转录PCR法,检测所设计的siRNA对SARS冠状病毒复制的抑制作用.结果表明,针对Pol基因的siRNA(psOe)在Vero细胞中可阻断BJ0 1株SARS病毒RNA的复制及其蛋白的表达.该结果为深入阐明SARS冠状病毒的致病机理及探讨SARS病毒防治新途径奠定了基础. 展开更多
关键词 SARS冠状病毒 RNAi sirna
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siRNA沉默E2F3基因对人膀胱癌细胞的增殖抑制作用 被引量：2
10
作者 洪泉 张文岚 +3 位作者 赵军 傅耀文 胡海龙 韩瑞发 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期523-526,608,F0003,共6页
目的:探讨siRNA干扰E2F3基因对膀胱癌细胞(5637细胞)增殖的抑制作用,阐明E2F3基因沉默对5637细胞增殖抑制作用的生物学机制。方法:化学合成3对编码短发夹RNA序列的、靶向E2F3基因的寡核苷酸链,经BamHⅠ、HindⅢ双酶切克隆至pRNAT-U6.1/... 目的:探讨siRNA干扰E2F3基因对膀胱癌细胞(5637细胞)增殖的抑制作用,阐明E2F3基因沉默对5637细胞增殖抑制作用的生物学机制。方法:化学合成3对编码短发夹RNA序列的、靶向E2F3基因的寡核苷酸链,经BamHⅠ、HindⅢ双酶切克隆至pRNAT-U6.1/Neo系统,重组构建E2F3siRNA的RNAi质粒,以质粒转染DH5α菌株筛选得到稳定表达siRNA的细胞,转染5637细胞E2F3基因沉默,RT-PCR及Western blotting检测E2F3表达,流式细胞术检测5637细胞周期,采用Annexin-V/PS双染法检测细胞凋亡率。结果:RT-PCR及Western blotting检测干扰后5637细胞E2F3基因表达抑制,3条干扰序列对5637细胞周期抑制且G1期细胞比例增高,与阴性转染对照组比较差异有显著性(P<0.05和P<0.001);细胞凋亡率增加,与空白对照组及阴性转染对照组比较差异有显著性(P<0.001)。结论:siRNA干扰E2F3基因对膀胱癌5637细胞具有明显增殖抑制和促进凋亡的作用。 展开更多
关键词 RNA干扰 小分子干扰 E2F3 膀胱肿瘤 细胞增殖抑制
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MicroRNA特征与功能 被引量：9
11
作者 石夏荣 俞吉安 《上海交通大学学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2004年第5期829-833,共5页
通过分析总结现代分子生物学国际前沿microRNA(miRNA)领域的研究文献,整理出miRNA研究的基本脉络和走向.miRNA是一类长度～22nt的非编码小分子RNA,在包括线虫、果绳、家鼠、人体以及拟南芥等生物中普遍存在;它在调节基因转录与表达,调... 通过分析总结现代分子生物学国际前沿microRNA(miRNA)领域的研究文献,整理出miRNA研究的基本脉络和走向.miRNA是一类长度～22nt的非编码小分子RNA,在包括线虫、果绳、家鼠、人体以及拟南芥等生物中普遍存在;它在调节基因转录与表达,调控生物体正常发育等生理过程中扮演重要角色.从比较的角度出发,揭示了miRNA与小干扰RNA在其代谢与功能方面共用某些途径,相互交叉与替代,可能同属一个更广范围的小分子RNA介导的生理调控机制.miRNA的研究可能对新一代基因药物的开发具有深远意义. 展开更多
关键词 MICRorNA 小干扰RNA DICER 基因表达调控
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siRNA对肺癌细胞株NCI-H460 bcl-2基因表达的影响 被引量：6
12
作者 胡海燕 张洹 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期174-179,共6页
目的:研究siRNA (smallinterferenceRNA)对大细胞肺癌细胞株NCI -H4 6 0bcl- 2基因表达的影响。方法:利用Ambion公司提供的设计软件和试剂盒,设计合成以bcl - 2基因为靶标的siRNA ,通过脂质体将合成的siRNA转入NCI-H4 6 0细胞株,设置转... 目的:研究siRNA (smallinterferenceRNA)对大细胞肺癌细胞株NCI -H4 6 0bcl- 2基因表达的影响。方法:利用Ambion公司提供的设计软件和试剂盒,设计合成以bcl - 2基因为靶标的siRNA ,通过脂质体将合成的siRNA转入NCI-H4 6 0细胞株,设置转染bcl- 2反义药物G3139和空白两对照组。用MTT法检测siRNA对细胞生长的作用;流式细胞仪检测细胞周期的改变和Bcl- 2蛋白表达;RT -PCR检测bcl- 2mRNA水平。结果:siRNA组与对照组细胞存活率均有显著性差异(P <0 0 5 ) ;siRNA组bcl- 2的mRNA明显低于对照组和反义组(P <0 0 5 ) ;siRNA组Bcl- 2蛋白阳性率明显低于对照组和反义组,siRNA组以及反义组细胞阻滞于S期。结论:体外转录合成的siRNA可抑制NCI-H4 6 0细胞bcl- 2基因的表达,抑制率可达5 0 %以上。 展开更多
关键词 小干扰RNA BCL-2基因 大细胞肺癌细胞株 NCI—H460
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siRNA干扰CHRNA5基因的表达抑制尼古丁对人肺癌细胞的促增殖作用 被引量：2
13
作者 赵云 马晓丽 +4 位作者 汪运山 郏雁飞 张雪萍 郑燕 肖东杰 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期604-608,共5页
目的:研究siRNA干扰尼古丁乙酰胆碱受体α5(cholinergic receptor nicotinic alpha5,CHRNA5)基因表达后对尼古丁促人肺癌A549细胞增殖作用的影响。方法:设计并合成CHRNA5-siRNA片段,并经脂质体介导转染A549细胞。荧光定量PCR、Western b... 目的:研究siRNA干扰尼古丁乙酰胆碱受体α5(cholinergic receptor nicotinic alpha5,CHRNA5)基因表达后对尼古丁促人肺癌A549细胞增殖作用的影响。方法:设计并合成CHRNA5-siRNA片段,并经脂质体介导转染A549细胞。荧光定量PCR、Western blotting检测转染后A549细胞中CHRNA5 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测CHRNA5-siRNA对尼古丁促A549细胞增殖作用的影响。结果:成功构建了CHRNA5-siRNA并成功转染A549细胞。CHRNA5-siRNA转染组A549细胞的CHRNA5mRNA表达量明显低于si-NC转染对照组(0.196±0.044vs0.944±0.027,P<0.01),CHRNA5-siRNA转染组A549细胞的CHRNA5蛋白表达量明显低于si-NC转染组(0.267±0.031vs0.745±0.035,P<0.01)。在无尼古丁作用时,CHRNA5-siRNA的转染不能抑制A549细胞的增殖。在尼古丁作用下,A549细胞增殖显著增加(P<0.01),CHRNA5-siRNA转染可明显抑制尼古丁的促增殖作用(P<0.01)。结论:siRNA下调肺癌A549细胞中CHRNA5的表达可以抑制尼古丁促细胞增殖作用,CHRNA5可能是肺癌治疗的潜在靶点之一。 展开更多
关键词 α5-尼古丁乙酰胆碱受体(CHRNA5) sirna 肺癌 尼古丁 增殖
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大鼠ERK1/2基因siRNA片段的设计、合成与筛选 被引量：2
14
作者 李建文 黄胜超 +5 位作者 陈小东 丁洪飞 张远起 黄水传 张智 肖雄升 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2012年第2期202-205,共4页
目的:设计合成干扰细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)基因表达的不同型小干扰RNA(siRNA),筛选出能高效抑制ERK1/2基因表达的siRNA。方法:根据大鼠ERK1/2mRNA的序列,设计合成针对ERK1基因和ERK2... 目的:设计合成干扰细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)基因表达的不同型小干扰RNA(siRNA),筛选出能高效抑制ERK1/2基因表达的siRNA。方法:根据大鼠ERK1/2mRNA的序列,设计合成针对ERK1基因和ERK2基因的siRNA序列各3对,利用脂质体将siRNA转染入大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs),实时荧光定量RT-PCR检测ERK1/2mRNA表达水平以确定干扰效果。结果:设计合成的3对ERK1siRNA和3对ERK2siRNA对ERK1/2基因均有一定的抑制作用,ERK1-siRNA1和ERK2-siRNA2在低转染浓度组中的抑制率最高,分别为95.77%和93.23%。结论:成功设计合成了针对ERK1/2基因的siRNA,并从中筛选出能特异且高效抑制ERK1/2表达的siRNA。 展开更多
关键词 细胞外信号调节激酶 RNA干扰 小干扰RNA 血管平滑肌细胞 基因治疗
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siRNA及其在哺乳动物中的应用 被引量：3
15
作者 孙岩 马用信 《四川动物》 CSCD 2003年第4期281-285,共5页
RNA干扰现象已经在多种生物中发现 ,但是在多数哺乳动物中尚未发现自然存在RNA干扰的证据。因此最初RNA干扰技术在哺乳动物细胞中的应用受到很大的限制。直到对RNA干扰作用机制有了较深入的了解以后 ,主要是小干扰RNA的发现使RNA干扰技... RNA干扰现象已经在多种生物中发现 ,但是在多数哺乳动物中尚未发现自然存在RNA干扰的证据。因此最初RNA干扰技术在哺乳动物细胞中的应用受到很大的限制。直到对RNA干扰作用机制有了较深入的了解以后 ,主要是小干扰RNA的发现使RNA干扰技术在哺乳动物中的应用得以推广。本文介绍了RNA干扰 ,重点描述了小干扰RNA的发现、特点。 展开更多
关键词 sirna 哺乳动物 小干扰RNA RNA干扰
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siRNA CD31沉默PECAM-1对鼠源血管内皮瘤细胞VEGF表达的影响 被引量：2
16
作者 欧阳金生 陈成水 +4 位作者 李玉苹 蔡畅 叶民 林全 陈俊杰 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期160-164,共5页
目的:研究siRNA CD31靶向沉默血管内皮细胞中血小板内皮细胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1,PECAM-1)基因对鼠源性血管内皮瘤(murine hemangioendothelioma,EOMA)细胞增殖及其VEGF表达的影响。方法:实验分为... 目的:研究siRNA CD31靶向沉默血管内皮细胞中血小板内皮细胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1,PECAM-1)基因对鼠源性血管内皮瘤(murine hemangioendothelioma,EOMA)细胞增殖及其VEGF表达的影响。方法:实验分为裸siRNA CD31组、siRNA CD31-FAM组、稳定阴性对照(SNC)组、空白对照(Opti-Med)组,以阳离子脂质体(RNAi-mate)为载体将化学合成的2'-O-甲基修饰的siRNA CD31转染体外培养的EOMA细胞,以激光共聚焦显微镜观察siRNA CD31的转染效果,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测siRNA CD31对EOMA细胞增殖的影响,以RT-PCR、Western blotting分别检测EOMA细胞中PECAM-1、VEGF的表达水平。结果:与SNC组和空白对照组比较,裸siRNA CD31和siRNA CD31-FAM转染的EOMA细胞中的PECAM-1 mRNA和蛋白、VEGF mRNA和蛋白的表达量均显著降低(均P<0.01)。与SNC组比较,裸siRNA CD31组、siRNA CD31-FAM组的EOMA细胞增殖抑制率明显上升[(18.82±1.46)%、(18.91±2.21)%vs(0.61±1.06)%,均P<0.01]。结论:采用siRNA CD31-脂质体复合物沉默EOMA细胞中的PECAM-1基因可抑制VEGF mRNA和蛋白的表达,从而抑制EOMA细胞的增殖。 展开更多
关键词 小分子干扰RNA 血小板内皮细胞黏附分子 血管内皮细胞生长因子 血管内皮瘤 细胞增殖
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采用蛋白组学技术分析质粒介导siRNA的“Off-target”效应 被引量：1
17
作者 周昌华 章崇杰 +2 位作者 彭晓东 魏大鹏 王光迪 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期170-180,共11页
siRNA的"脱靶效应"(off-target effects)是RNA干扰应用研究领域的热点问题.采用蛋白组学技术对质粒介导的siRNA稳定沉默原癌基因c-myc可能存在的"off-target"效应进行初步研究,为siRNA靶向特异性的系统评价奠定理... siRNA的"脱靶效应"(off-target effects)是RNA干扰应用研究领域的热点问题.采用蛋白组学技术对质粒介导的siRNA稳定沉默原癌基因c-myc可能存在的"off-target"效应进行初步研究,为siRNA靶向特异性的系统评价奠定理论与实验基础.构建靶向c-myc的siRNA真核表达质粒p-Mat01-1及其错配质粒p-Mis09-1,空质粒pEGFP-C1为对照,并稳定转染MCF-7人乳腺癌细胞.通过RT-PCR和Western印迹分析结果显示p-Mat01-1稳定转染克隆中c-myc/c-MYC的表达降低.采用2-DE及LC-ESI-MS/MS等方法,研究了p-Mat01-1与pEGFP-C1稳定转染克隆的蛋白组表达差异.结果显示,p-Mat01-1稳定转染克隆中有47个c-myc非调控蛋白点表达升高或降低,约占423个随机检测蛋白点的11.1%.这些蛋白涉及细胞骨架、代谢、增殖、信号传导、分子伴侣、氧化还原等多条途径.实验结果表明,质粒介导靶向c-myc的siRNA在MCF-7细胞中存在明显的"off-target"效应,提示在设计siRNA实验及应用研究时应系统考察其靶向特异性. 展开更多
关键词 C-MYC RNA干扰 小干扰RNA 脱靶效应 蛋白组学
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基于PCR的siRNA表达框的制备 被引量：1
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作者 郭秋野 马文丽 +3 位作者 张宝 吴清华 严律 郑文岭 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期483-485,489,共4页
目的改进目前基于PCR的方法制备siRNA表达框,转染细胞后产生高效的RNA干扰作用。方法从K562细胞中提取基因组DNA,以此为模板,PCR扩增U6启动子序列并克隆至pMD18-T载体中,用载体上的引物进行扩增,所得产物即制成作为扩增siRNA表达框的模... 目的改进目前基于PCR的方法制备siRNA表达框,转染细胞后产生高效的RNA干扰作用。方法从K562细胞中提取基因组DNA,以此为模板,PCR扩增U6启动子序列并克隆至pMD18-T载体中,用载体上的引物进行扩增,所得产物即制成作为扩增siRNA表达框的模板。选择p53为靶基因,扩增制备siRNA表达框,测序验证后,转染SH-SY5Y 细胞48h后提取RNA进行RT-PCR,检测RNA干扰的效应。结果测序结果表明所克隆的U6启动子序列正确。细胞转染表达框,在mRNA水平上,p53基因的表达明显受到了抑制。结论本实验所制作的基于PCR的方法制备siRNA表达框可以很好地应用于RNAi作用研究。 展开更多
关键词 RNAI sirna U6启动子 PCR表达框架:SH-SY5Y细胞
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骨形成发生蛋白9的siRNA筛选及功能检测 被引量：1
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作者 毕杨 文巍 +1 位作者 何昀 冯涛 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期659-663,共5页
目的筛选特异性沉默小鼠BMP9基因的siRNA序列,在BNLCL.2胚胎肝细胞及C3H10细胞进行功能鉴定。方法体外退火获得4组simBMP9双链DNA序列,克隆至含有BMP9靶基因的pSOS-BMP9质粒中获得pSOS-simBMP9质粒,脂质体转染HEK293细胞,GFP检测筛选有... 目的筛选特异性沉默小鼠BMP9基因的siRNA序列,在BNLCL.2胚胎肝细胞及C3H10细胞进行功能鉴定。方法体外退火获得4组simBMP9双链DNA序列,克隆至含有BMP9靶基因的pSOS-BMP9质粒中获得pSOS-simBMP9质粒,脂质体转染HEK293细胞,GFP检测筛选有功能的simBMP9片段,将筛选出的simBMP9构建腺病毒,感染BNLCL.2胚胎肝细胞,通过RT-PCR,Westernblotting检测BMP9的表达,simBMP9与BMP9腺病毒共感染C3H10细胞,碱性磷酸酶活性检测simBMP9对BMP9成骨诱导的抑制作用。结果在HEK293细胞中,四组simBMP9中有两组的GFP表达明显降低,同时,腺病毒介导的这两对simBMP9均能抑制胚胎肝细胞中内源性的BMP9表达,抑制率为50%～70%,BMP9能诱导C3H10细胞的成骨分化,碱性磷酸酶的活性明显高于对照组(P<0.01),而两组simBMP9与BMP9共感染组C3H10细胞的ALP活性均明显的低于BMP9组(P<0.01)。结论成功筛选出两对特异性沉默BMP9基因的siRNA片段,能有效抑制内源性和外源性的BMP9表达,为研究BMP9在肝细胞成熟分化中的作用及具体机制提供重要的分子手段。 展开更多
关键词 骨形态发生蛋白9 RNA干扰 小干扰RNA
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siRNA干扰对乳腺癌(MCF-7)ATX表达和侵袭力的影响 被引量：1
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作者 顾海涛 王继见 +1 位作者 李洋 杨成 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期554-557,共4页
目的:研究针对自分泌运动因子(Autotaxin,ATX)的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)对人乳腺癌细胞ATX基因表达的影响,探讨RNA干扰技术治疗乳腺癌的前景。方法:参考人黑色素瘤ENPP2基因序列,设计合成ATX-siRNA及随机阴性对照。在... 目的:研究针对自分泌运动因子(Autotaxin,ATX)的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)对人乳腺癌细胞ATX基因表达的影响,探讨RNA干扰技术治疗乳腺癌的前景。方法:参考人黑色素瘤ENPP2基因序列,设计合成ATX-siRNA及随机阴性对照。在阳离子脂质体的介导下转染人乳腺癌细胞MCF-7,转染后48h收集细胞,用半定量RT-PCR和western blot检测转染后ATX mRNA和ATX蛋白的表达,体外实验测定肿瘤细胞穿透matrigel的能力。结果:体外合成的siRNA在转染乳腺癌细胞48h后ATX mRNA和蛋白表达降低,转染48h后测定乳腺癌MCF-7细胞的侵袭力明显降低(P<0.01)。结论:ATX-siRNA能有效抑制人乳腺癌细胞株ATX基因和蛋白的表达,降低人乳腺癌细胞的侵袭力。 展开更多
关键词 小干扰RNA 人乳腺癌细胞MCF-7 自分泌运动因子 乳腺肿瘤
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