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利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选敲除AcMNPV lef-10基因
被引量：
1
1
作者
白玉
许晓东
《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
CSCD
北大核心
2015年第12期181-190,198,共11页
【目的】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10点突变载体,为进一步研究AcMNPVlef-10的功能奠定基础。【方法】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选BAC修饰系统对AcMNPV lef-10进行点突...
【目的】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10点突变载体,为进一步研究AcMNPVlef-10的功能奠定基础。【方法】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选BAC修饰系统对AcMNPV lef-10进行点突变,由于lef-10和必需基因vp1054有重叠,所以在敲除lef-10时只能通过引进点突变使lef-10失活,避免影响vp1054的正常表达。首先,构建rpsL-AMP筛选盒,然后在野生型AcBacmid中引进点突变(方法是通过2次Red/ET重组:第1次重组在野生型AcBacmid lef-10中引进rpsL-AMP抗性筛选标记,形成一次重组Bacmid,第2次重组是在一次重组Bacmid中引进含点突变的lef-10片段),再利用链霉素反向筛选去除rpsL-AMP抗性筛选标记,同时引入相应的点突变。将从lef-10基因点突变重组菌中提取得到的AcBacmid与质粒pTriEx1.1和pTriEx-innateP-lef10分别共转染草地贪夜蛾Sf9细胞,同时用野生型AcBacmid与质粒pTriEx1.1共转染Sf9细胞作为对照,显微镜下观察病毒的复制情况,确定lef-10基因是否为AcMNPV的必需基因。【结果】通过对重组Bacmid的PCR鉴定和点突变序列的测定,证明AcMNPVlef-10基因已经发生点突变;通过共转染试验发现,随着转染时间的延长,lef-10补回型病毒和野生型病毒一样,均能在Sf9细胞中复制产生具有感染性的子代病毒粒子BV,从而对邻近细胞造成二次感染,使得细胞死亡,且lef-10补回型重组病毒产生感染性病毒粒子的能力与野生型基本一致;而由于lef-10缺失型重组病毒不能产生有感染性的病毒粒子,所以在被lef-10缺失型重组病毒转染的细胞中,细胞数目不会随着转染时间的增加而发生明显改变。【结论】利用Red/ET重组系统结合rpsL反向筛选系统可以在Ac MNPVlef-10基因中引入点突变,且lef-10是杆状病毒生活周期中的一个必需基因,其缺失会影响杆状病毒的复制。
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关键词
苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)
lef-10
Red/ET重组
系统
rpsl反向筛选系统
基因敲除
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职称材料
表达绿色荧光蛋白重组猪塞内卡病毒的构建及初步应用
被引量：
5
2
作者
张晓战
杨磊
+8 位作者
邓同炜
赵攀登
彭志锋
陈露露
郭懿文
夏艳勋
乔宏兴
边传周
王增
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第10期2978-2985,共8页
塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在...
塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在实验室前期对SVA研究的基础上建立稳定表达绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒,为体外高通量筛选具有抗SVA活性药物提供一种简单快速有效的工具。本研究在pEGFP-C1载体EGFP基因末端引入猪捷申病毒1型的2A基因,构建EGFP-P2A融合基因过度质粒,随后分别设计带有同源臂的克隆引物,通过同源重组技术将EGFP-P2A基因插入SVA毒株CH/HeN-2018基因组2A和2B基因间,并经测序鉴定,成功构建重组载体pSVA-EGFP。将pSVA-EGFP转染PK-15细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的重组SVA荧光毒rCH/HeN-2018-EGFP。通过绿色荧光观察、RT-PCR和生长曲线测定,评估了重组毒株rCH/HeN-2018-EGFP和亲本毒株生长特性。并进一步通过药物细胞毒性试验和病毒感染试验对rCH/HeN-2018-EGFP作为潜在抗SVA药物筛选工具进行评价。结果表明,rCH/HeN-2018-EGFP与亲本毒株wtCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018在PK-15细胞中具有相似的生长特性,且遗传稳定,在P10代能够稳定表达绿色荧光,插入的EGFP-P2A基因没有出现突变现象。抗SVA病毒感染试验结果表明,用终浓度20μmol·L^(-1)的姜黄素和110μmol·L^(-1)黄芩苷预处理PK-15细胞2 h,通过观察荧光细胞的数量直观判断两种药物均能够抑制rCH/HeN-2018-EGFP在细胞中的复制,其中黄芩苷抑制效果极显著。随后在亲本毒株wtCH/HeN-2018感染试验进一步证实了黄芩苷对SVA病毒复制抑制的效果。本研究所构建的携带EGFP基因的重组SVA毒株能够高效稳定地表达绿色荧光蛋白,可以作为一种工具报告病毒应用于抗SVA药物和蛋白的筛选过程。
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关键词
塞内卡病毒
反向
遗传操作
系统
报告病毒
绿色荧光蛋白
抗病毒药物
筛选
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职称材料
题名
利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选敲除AcMNPV lef-10基因
被引量：
1
1
作者
白玉
许晓东
机构
西北农林科技大学生命科学学院
出处
《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
CSCD
北大核心
2015年第12期181-190,198,共11页
基金
陕西省自然科学基础研究计划项目(2011JM3002)
文摘
【目的】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10点突变载体,为进一步研究AcMNPVlef-10的功能奠定基础。【方法】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选BAC修饰系统对AcMNPV lef-10进行点突变,由于lef-10和必需基因vp1054有重叠,所以在敲除lef-10时只能通过引进点突变使lef-10失活,避免影响vp1054的正常表达。首先,构建rpsL-AMP筛选盒,然后在野生型AcBacmid中引进点突变(方法是通过2次Red/ET重组:第1次重组在野生型AcBacmid lef-10中引进rpsL-AMP抗性筛选标记,形成一次重组Bacmid,第2次重组是在一次重组Bacmid中引进含点突变的lef-10片段),再利用链霉素反向筛选去除rpsL-AMP抗性筛选标记,同时引入相应的点突变。将从lef-10基因点突变重组菌中提取得到的AcBacmid与质粒pTriEx1.1和pTriEx-innateP-lef10分别共转染草地贪夜蛾Sf9细胞,同时用野生型AcBacmid与质粒pTriEx1.1共转染Sf9细胞作为对照,显微镜下观察病毒的复制情况,确定lef-10基因是否为AcMNPV的必需基因。【结果】通过对重组Bacmid的PCR鉴定和点突变序列的测定,证明AcMNPVlef-10基因已经发生点突变;通过共转染试验发现,随着转染时间的延长,lef-10补回型病毒和野生型病毒一样,均能在Sf9细胞中复制产生具有感染性的子代病毒粒子BV,从而对邻近细胞造成二次感染,使得细胞死亡,且lef-10补回型重组病毒产生感染性病毒粒子的能力与野生型基本一致;而由于lef-10缺失型重组病毒不能产生有感染性的病毒粒子,所以在被lef-10缺失型重组病毒转染的细胞中,细胞数目不会随着转染时间的增加而发生明显改变。【结论】利用Red/ET重组系统结合rpsL反向筛选系统可以在Ac MNPVlef-10基因中引入点突变,且lef-10是杆状病毒生活周期中的一个必需基因,其缺失会影响杆状病毒的复制。
关键词
苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)
lef-10
Red/ET重组
系统
rpsl反向筛选系统
基因敲除
Keywords
Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus（AcMNPV）
lef-10
RedET recombination system
rpsl
counter-selection BAC modification system
gene disruption
分类号
Q786 [生物学—分子生物学]
在线阅读
下载PDF
职称材料
题名
表达绿色荧光蛋白重组猪塞内卡病毒的构建及初步应用
被引量：
5
2
作者
张晓战
杨磊
邓同炜
赵攀登
彭志锋
陈露露
郭懿文
夏艳勋
乔宏兴
边传周
王增
机构
河南牧业经济学院动物医药学院
河南农业大学动物医学院
出处
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第10期2978-2985,共8页
基金
国家自然科学基金(32002264)
河南省科技攻关项目(192102110186)
+2 种基金
河南省高等学校重点科研项目(21A230006)
河南牧业经济学院青年博士启动基金(2019HNUAHEDF008)
国家级大学生创新创业训练计划项目(202010469018)。
文摘
塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在实验室前期对SVA研究的基础上建立稳定表达绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒,为体外高通量筛选具有抗SVA活性药物提供一种简单快速有效的工具。本研究在pEGFP-C1载体EGFP基因末端引入猪捷申病毒1型的2A基因,构建EGFP-P2A融合基因过度质粒,随后分别设计带有同源臂的克隆引物,通过同源重组技术将EGFP-P2A基因插入SVA毒株CH/HeN-2018基因组2A和2B基因间,并经测序鉴定,成功构建重组载体pSVA-EGFP。将pSVA-EGFP转染PK-15细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的重组SVA荧光毒rCH/HeN-2018-EGFP。通过绿色荧光观察、RT-PCR和生长曲线测定,评估了重组毒株rCH/HeN-2018-EGFP和亲本毒株生长特性。并进一步通过药物细胞毒性试验和病毒感染试验对rCH/HeN-2018-EGFP作为潜在抗SVA药物筛选工具进行评价。结果表明,rCH/HeN-2018-EGFP与亲本毒株wtCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018在PK-15细胞中具有相似的生长特性,且遗传稳定,在P10代能够稳定表达绿色荧光,插入的EGFP-P2A基因没有出现突变现象。抗SVA病毒感染试验结果表明,用终浓度20μmol·L^(-1)的姜黄素和110μmol·L^(-1)黄芩苷预处理PK-15细胞2 h,通过观察荧光细胞的数量直观判断两种药物均能够抑制rCH/HeN-2018-EGFP在细胞中的复制,其中黄芩苷抑制效果极显著。随后在亲本毒株wtCH/HeN-2018感染试验进一步证实了黄芩苷对SVA病毒复制抑制的效果。本研究所构建的携带EGFP基因的重组SVA毒株能够高效稳定地表达绿色荧光蛋白,可以作为一种工具报告病毒应用于抗SVA药物和蛋白的筛选过程。
关键词
塞内卡病毒
反向
遗传操作
系统
报告病毒
绿色荧光蛋白
抗病毒药物
筛选
Keywords
Senecavirus A
reverse genetics system
reporter virus
green fluorescent protein
antiviral drug screen
分类号
S852.659.6 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选敲除AcMNPV lef-10基因
白玉
许晓东
《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
CSCD
北大核心
2015
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
表达绿色荧光蛋白重组猪塞内卡病毒的构建及初步应用
张晓战
杨磊
邓同炜
赵攀登
彭志锋
陈露露
郭懿文
夏艳勋
乔宏兴
边传周
王增
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021
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