基于RT-RPA-微流控芯片的牛副流感病毒3型可视化快速检测方法

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作者 张铁男 侯梦媛 毛晓庆 《福建农业学报》 北大核心 2025年第3期245-252,共8页

【目的】采用逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA)、磁捕获和微流控芯片相结合的技术,建立一种牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3, BPIV3)快速可视化分子检... 【目的】采用逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA)、磁捕获和微流控芯片相结合的技术,建立一种牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3, BPIV3)快速可视化分子检测方法。【方法】根据BPIV3 gp3基因设计特异性引物和探针,以牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛腺病毒3型(bovineadenovirustype3,BADV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectiousbovine rhinotracheitis virus, IBRV)为对照组,分析该方法的特异性。通过BPIV3标准菌(毒)株的RNA提取液进行10倍稀释确定该方法的灵敏度。收集56份疑似感染BPIV3急性期病牛的血清和鼻拭子样本,血清样本利用该方法检测,鼻拭子样本经过分离后,通过对比分析反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)检测法和该方法检测结果,以评估其应用价值。【结果】BPIV3标准菌(毒)株的RNA提取液RT-RPA扩增子大小为404 bp,对照组无扩增子,扩增子测序结果显示与BPIV3的高度保守区gp3基因(NC_002161.1)同源性为100%。对不同浓度BPIV3标准菌(毒)株的RNA提取液进行检测,结果显示本检测方法的最低检测限为2.26×10^(3) copies·μL^(-1)。对56份疑似感染BPIV3急性期病牛血清样本进行检测时,发现编号为SD0078、SD0114、SD0319、SD0601、SD0714和SD0755的牛均已感染了BPIV3,与RT-PCR和该方法对鼻拭子分离样本的检测结果一致。本检测方法从样本处理到获得检测结果全流程时长为92 min。【结论】本研究将RT-RPA、磁捕获和微流控芯片技术相结合,建立了一种BPIV3快速可视化分子检测的方法,具有良好的特异性、灵敏度和适用性。 展开更多

关键词 牛副流感病毒3 逆转录重组酶聚合酶扩增技术 磁捕获 微流控芯片技术

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RT-RAA-CRISPR/Cas12a试纸条法快速检测苹果坏死花叶病毒方法的建立

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作者 王思元 侯雨萌 +4 位作者 董铮 赵振兴 王金国 周涛 张永江 《西南农业学报》 北大核心 2025年第5期920-926,共7页

【目的】苹果花叶病是苹果最重要的病害之一,苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus, ApNMV)是引起我国苹果花叶病的主要病原物。针对苹果坏死花叶病毒建立快速、灵敏的检测技术,旨在实现该病毒的早期鉴定和防控。【方法】将反... 【目的】苹果花叶病是苹果最重要的病害之一,苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus, ApNMV)是引起我国苹果花叶病的主要病原物。针对苹果坏死花叶病毒建立快速、灵敏的检测技术,旨在实现该病毒的早期鉴定和防控。【方法】将反转录重组酶等温扩增(Reverse transcription-recombinase aided amplification, RT-RAA)技术与CRISPR/Cas系统相结合,基于CRISPR/Cas12a系统的设计原则,设计特异性识别ApNMV RT-RAA扩增产物的crRNA,通过优化反应体系的报告分子浓度、反应温度和反应时间,获得最佳反应体系和反应条件,并利用侧流层析试纸条展示检测结果。【结果】RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的检测灵敏度是实时荧光定量RT-PCR方法的10倍,对苹果样品RNA的检测极限达到500 fg/μL,并且对其他常见苹果病毒没有交叉反应。使用该方法检测田间采集样品的阳性率高于普通RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法。【结论】基于RT-RAA-CRISPR/Cas12a建立的苹果坏死花叶病毒试纸条检测方法具有强特异性、高灵敏度。本研究为苹果坏死花叶病毒的田间现场诊断提供了新手段。 展开更多

关键词 苹果坏死花叶病毒 反转录重组酶等温扩增 CRISPR/Cas12a 现场检测

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基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法

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作者 侯雨萌 赵振兴 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第2期268-275,共8页

玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有... 玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有试剂集中在一个试管中进行反应,并通过侧向流动试纸条(LFD)检测反应结果。本研究筛选得到的最佳反应条件为,引物添加量2.8μL、FB报告分子浓度100 nmol/L、RT-RAA系统反应时间20 min、CRISPR/Cas12a系统反应时间20 min。本研究构建的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法特异性强、灵敏度高,且所用试验材料方便携带和运输,适用于现场检测。 展开更多

关键词 玉米矮花叶病毒 反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术 CRISPR/Cas12a 侧向流动试纸条

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基于RT-RAA的苹果坏死花叶病毒快速检测方法的建立

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作者 侯雨萌 赵振兴 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《植物保护》 北大核心 2025年第4期314-319,共6页

苹果是我国重要的园艺作物,具有较高的经济地位。病毒是引起苹果病害的重要因素,苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是引起苹果坏死和花叶症状的病原之一。为了有效预防ApNMV的侵染,本研究基于反转录重组酶介导恒温扩... 苹果是我国重要的园艺作物,具有较高的经济地位。病毒是引起苹果病害的重要因素,苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是引起苹果坏死和花叶症状的病原之一。为了有效预防ApNMV的侵染,本研究基于反转录重组酶介导恒温扩增(reverse transcription-recombinase aided amplification,RT-RAA)技术,建立ApNMV的快速检测方法。根据ApNMV外壳蛋白编码基因的保守序列设计4对RAA引物,筛选最佳引物序列,并进行反应体系的优化。结果表明,RAA的最佳反应条件为:引物终浓度0.8μmol/L,反应温度42℃,反应时间20 min。该方法能够特异性检测ApNMV。对携带ApNMV样品的RNA进行检测,RT-RAA检测体系的检测极限为5 pg/μL,普通RT-PCR检测体系的检测极限为50 pg/μL,RT-RAA检测体系灵敏度是普通RT-PCR体系的10倍。该检测方法具有快速、简便、灵敏度高等优点。 展开更多

关键词 苹果坏死花叶病毒(ApNMV) 反转录重组酶介导恒温扩增 快速检测

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基于RT-RAPID和CRISPR-Cas12a的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸检测方法的建立

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作者 冉红志 樊成 +4 位作者 王雪飞 刘静 康婕 钱卫东 王婷 《动物医学进展》 北大核心 2023年第9期44-50,共7页

为建立一种特异性强、灵敏度高且简单方便的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法,下载诺如病毒GⅡ.6基因组序列,用Mega7.0对基因组进行比对分析获得高度保守序列;基于保守序列设计诺如病毒GⅡ.6的反转录重组酶和聚合酶等温检测(RT-RAPID)技... 为建立一种特异性强、灵敏度高且简单方便的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法,下载诺如病毒GⅡ.6基因组序列,用Mega7.0对基因组进行比对分析获得高度保守序列;基于保守序列设计诺如病毒GⅡ.6的反转录重组酶和聚合酶等温检测(RT-RAPID)技术扩增引物、荧光探针、crRNA和报告分子;优化RT-RAPID的反应引物、反应温度和反应时间及Cas12a检测用的crRNA,并分析RT-RAPID-Cas12a方法的特异性和灵敏度。基于RT-RAPID荧光法和RT-RAPID-Cas12a荧光法的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸快速检测方法能在1 h内完成检测并得出结果,灵敏度分别为10 copies/μL和0.5 copies/μL,且两个方法均与诺如病毒GⅡ.17型、鼻病毒、偏肺病毒和博卡病毒无交叉反应。2个检测方法与RT-qPCR阳性样本一致率均为90%,阴性样本一致率均为100%。论文建立的基于RT-RAPID和Cas12a的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法均可高效快速地检测出诺如病毒GⅡ.6,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷且快速等特点。 展开更多

关键词 诺如病毒GⅡ.6亚型 反转录重组酶聚合酶扩增 规律间隔成簇短回文重复序列的/相关蛋白12a 核酸检测

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鸡星状病毒实时荧光逆转录重组酶介导核酸等温扩增检测方法的建立

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作者 赵俊柯 余丹 +4 位作者 喻华英 尹文巧 张艳芳 谢志勤 谢芝勋 《动物医学进展》 北大核心 2025年第9期22-27,共6页

为建立针对鸡星状病毒(CAstV)的实时荧光逆转录重组酶介导核酸等温扩增(RT-RAA)检测方法,基于CAstV的ORF1b基因序列设计引物和探针。通过试验筛选,确定最优的引物和探针组合,并对反应条件进行优化。利用优化好的反应条件进行特异性、敏... 为建立针对鸡星状病毒(CAstV)的实时荧光逆转录重组酶介导核酸等温扩增(RT-RAA)检测方法,基于CAstV的ORF1b基因序列设计引物和探针。通过试验筛选,确定最优的引物和探针组合,并对反应条件进行优化。利用优化好的反应条件进行特异性、敏感性和重复性测试。针对从广西南宁不同地区采集的200份临床样品进行检测,并将结果与RT-PCR和RT-qPCR进行对比。结果显示,建立的实时荧光RT-RAA方法能在20 min内完成反应,最佳反应温度为41℃,显示出极高的灵敏度,最低检测限达到1.4×10^(1)copies/μL,比普通RT-PCR高100倍。所设计的引物特异性高,仅能扩增出CAstV病毒,而对其他病原体无交叉反应。重复性试验结果表明该方法具有良好的稳定性。与RT-qPCR相比,实时荧光RT-RAA的检测结果符合率高达98.27%,而普通RT-PCR与RT-RAA相比符合率仅为82.45%。建立了一种高效、快速、准确、灵敏且特异性强的实时荧光RT-RAA方法,适用于CAstV的临床大规模鉴别检测,为CAstV感染的监控提供了技术支持。 展开更多

关键词 鸡星状病毒 逆转录重组酶介导核酸等温扩增 快速检测 ORF1b基因

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齿兰环斑病毒RT-RPA荧光实时检测体系的构建与应用

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作者 吴洁秋 庄华才 +4 位作者 谭志勇 李早文 范俊强 傅海平 徐匆 《热带作物学报》 北大核心 2025年第7期1745-1753,共9页

齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是危害兰花的主要致病病毒之一,该病毒导致兰花叶片黄化、出现斑块,花朵畸形,对兰花的观赏性和商业价值影响极大。为实现ORSV的早期快速检测,本研究根据Gen Bank数据库中兰花齿兰环斑... 齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是危害兰花的主要致病病毒之一,该病毒导致兰花叶片黄化、出现斑块,花朵畸形,对兰花的观赏性和商业价值影响极大。为实现ORSV的早期快速检测,本研究根据Gen Bank数据库中兰花齿兰环斑病毒外壳蛋白cp基因的保守区域设计、筛选RT-RPA引物和探针,优化扩增条件,建立基于RPA的ORSV快速检测技术;对RT-RPA特异性和灵敏性进行测定,并通过开展田间样品检测试验,以验证该检测技术在生产上的应用可行性。结果表明:RT-RPA的最佳扩增引物组合为F1/R1,荧光探针为P1,最佳扩增温度为41℃,扩增时间为20 min;特异性良好,对建兰花叶病毒、黄瓜花叶病毒无交叉反应;灵敏度较高,ORSV核酸最低检测浓度达到2.8×10^(–5 )ng/μL。田间样品检测中,采用齿兰环斑病毒为阳性对照,dd H_(2)O为阴性对照,20份蝴蝶兰样本均检出ORSV,与Taq Man探针RT-q PCR (real time quantitative PCR)检测结果一致。本研究建立的ORSV RT-RPA荧光实时检测技术,具有快速、灵敏、准确和简便的优点,且适用于田间样品检测,为兰花病害预防、切断感染源和控制ORSV的传播提供有效方法,有助于兰花产业的健康发展。 展开更多

关键词 兰花 齿兰环斑病毒 反转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA) 检测

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基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立 被引量：4

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作者 于晶雪 韦珊珊 +9 位作者 覃绍敏 吴健敏 杨丽华 陈凤莲 许力士 秦树英 华俊 韦珏 方芳 刘金凤 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3237-3246,共10页

[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]... [目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA) CRISPR/Cas12系统

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NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

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作者 樊成 曾昊 +6 位作者 卢星月 康婕 雷兰兰 刘静 郑玉红 钱卫东 王婷 《中国动物检疫》 CAS 2024年第8期90-97,共8页

近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计... 近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计引物、crRNA,经优化反应条件后,建立了NoV GⅡ.2亚型RTRPA-CRISPR/Cas12a检测方法。结果显示:利用引物NoV-GⅡ.2-F1B和NoV-GⅡ.2-R1对NoV GⅡ.2标准RNA进行RT-RPA扩增,结合crRNA1介导的CRISPR/Cas12a报告体系,能在40 min内完成NoV GⅡ.2核酸检测;该方法检测灵敏度为10 copies/μL,且与轮状病毒、腺病毒、星形病毒、人副肠孤病毒、博卡病毒和札如病毒无交叉反应;应用该方法和qRT-PCR法,分别对30份临床模拟样本进行检测,发现总符合率达96.67%。结果表明,本研究建立的NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法无需依赖昂贵设备,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷快速等特点,为NoV GⅡ.2感染的现场检测和防控提供了新方法。 展开更多

关键词 NoV GⅡ.2亚型 反转录重组酶聚合酶扩增 CRISPR/Cas12a系统 快速检测

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猪传染性胃肠炎病毒分子检测方法研究进展 被引量：1

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作者 申秋平 黄子惠 +2 位作者 王冉 刘晓明 庄林林 《中国猪业》 2024年第5期56-67,共12页

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种高度接触性肠道传染病,给全球养猪业造成了重大损失。精准检测传染性胃肠炎病毒对科学防控猪传染性胃肠炎具有重要的理论及现实意义。鉴于此,作者综述了近10年来猪传染性胃肠炎病毒分子... 猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种高度接触性肠道传染病,给全球养猪业造成了重大损失。精准检测传染性胃肠炎病毒对科学防控猪传染性胃肠炎具有重要的理论及现实意义。鉴于此,作者综述了近10年来猪传染性胃肠炎病毒分子检测方法的研究进展,主要包括免疫学检测技术(酶联免疫吸附试验、免疫荧光方法、免疫酶组织化学法、免疫传感器系统)、基于逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的检测技术(常规RT-PCR、巢式RT-PCR、多重RT-PCR、荧光RT-PCR、多重荧光RT-PCR、纳米PCR)、核酸等温扩增技术(环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增、重组酶介导核酸等温扩增、恒温隔绝式RT-PCR)、芯片检测技术(液相芯片检测方法、多重液相芯片方法、cDNA芯片)等。此外,对这些方法的优缺点和传染性胃肠炎病毒分子检测方法未来发展方向进行了展望,以期为猪传染性胃肠炎的早期诊断和科学防控提供参考依据。 展开更多

关键词 猪 传染性胃肠炎 病毒 免疫学 逆转录聚合酶 链式反应 等温扩增技术 芯片技术

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马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立 被引量：11

11

作者 高彦萍 吕和平 +3 位作者 张武 王国祥 吴雁斌 梁宏杰 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1943-1950,共8页

为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度... 为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR GreenⅠ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR GreenΙ为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。 展开更多

关键词 马铃薯卷叶病毒 反转录环介导等温扩增 反转录聚合酶链式扩增 检测

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小鼠肝炎病毒逆转录环介导等温扩增检测技术的建立 被引量：7

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作者 袁文 刘忠华 +2 位作者 张钰 刘香梅 黄韧 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2009年第5期354-359,I0007,I0008,共8页

目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因... 目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因组RNA为模板,进行RT-LAMP反应。扩增产物通过浊度、SYBR green I荧光染料显色及电泳三种方法观察结果。同时,用限制性内切酶AluI对扩增产物进行酶切鉴定。进行RT-LAMP特异性和敏感性试验。最后用建立的RT-LAMP方法检测55份小鼠临床样本。结果RT-LAMP技术简单快速,等温条件下(65℃)一个小时内即可完成反应。酶切结果证明RT-LAMP产物正确。该技术具有很高的特异性和敏感性,可检测到的MHV RNA最低浓度为0.1 pg/μL,比逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)灵敏10倍。临床样本检测结果显示,与RT-PCR比较RT-LAMP方法的敏感性和特异性分别为100%和83.3%。结论RT-LAMP技术是一种快速、简便诊断方法,该方法检测特异性强、敏感性高,可以成为快速准确检测MHV的有效手段。 展开更多

关键词 小鼠肝炎病毒 逆转录环介导等温扩增 逆转录聚合酶链式反应

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克隆与序列分析中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)HSP70基因全长ORF的RACE 被引量：3

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作者 袁嘉恩 许忠能 +3 位作者 雷腊梅 李慕婵 韩博平 谢数涛 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期516-521,共6页

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)的Hsp70基因并进行序列分析.以中华绒螯蟹卵组织cDNA为模板,克隆测序后拼接得到一条长2 429 bp的cDNA序列,序列分析表明其覆盖了完整编码... 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)的Hsp70基因并进行序列分析.以中华绒螯蟹卵组织cDNA为模板,克隆测序后拼接得到一条长2 429 bp的cDNA序列,序列分析表明其覆盖了完整编码区,编码649个氨基酸.经antheprot分析发现2个Hsp70基因的签名序列:IFDLGGGTFDVSIL,IVLVGGSTRIPKIQK;Dnak特征基序DLGTT-S-V;非细胞器基序:RARFEEL;核定位信号标签:KKDPSESKRALRRL;胞质Hsp70特征基序GPTIEEVD.经BLASTn和BLASTx软件分析,该编码区核苷酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)的相似性分别为85.30%和84.89%.根据核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列,其与斑节对虾、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的相似性分别为93.23%和93.40%.本研究克隆了中华绒螯蟹的Hsp70基因,为进一步深入研究锯缘青蟹的抗逆机理及其遗传改良奠定了基础. 展开更多

关键词 HSP70基因 CDNA末端快速扩增 逆转录聚合酶链反应 中华绒螯蟹

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上皮性卵巢肿瘤端粒酶活性及其各亚单位基因表达的研究 被引量：2

14

作者 刘敏 纪新强 +1 位作者 罗兵 刘付敏 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2003年第7期461-465,共5页

目的:探讨端粒酶及其亚单位(hTERT、TP1、hTR)在卵巢癌发生和发展中的作用,研究端粒酶活性与各亚单位表达的相关性。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测66例卵巢上皮性肿瘤及1... 目的:探讨端粒酶及其亚单位(hTERT、TP1、hTR)在卵巢癌发生和发展中的作用,研究端粒酶活性与各亚单位表达的相关性。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测66例卵巢上皮性肿瘤及10例正常卵巢组织端粒酶不同亚单位基因的表达情况,应用端粒重复序列扩增技术(telomeraserepeatamplificationprotocol,TRAP)检测其中45例卵巢上皮性肿瘤及9例正常卵巢组织端粒酶活性。结果:1)恶性、交界性卵巢肿瘤组织中端粒酶阳性检出率分别为83.33%(25/30)、71.43%(5/7),两组间无显著性差异(P>0.05),而良性上皮性卵巢肿瘤及正常卵巢上皮中未检测到端粒酶活性,与前两组之间均有显著差异(P<0.001);2)RT-PCR定性检测发现hTR和TP1mRNA在检测的各组组织中均有表达,而hTERTmRNA主要在上皮性卵巢癌和交界性卵巢肿瘤中表达,二者间hTERTmRNA表达的差别无统计学意义(P>0.05),而与良性及正常组织hTERT表达有显著差异(P<0.001);3)端粒酶活性与hTERT亚单位表达明显相关(P<0.001),而与hTR和TP1亚单位表达无明显相关性(P>0.05)。结论:端粒酶与卵巢癌发生发展过程密切相关;hTERT表达与端粒酶活性密切相关,并可能参与端粒酶的活性调节,hTERT的表达有望成为上皮性卵巢癌的诊断指标。 展开更多

关键词 上皮性卵巢肿瘤 端粒酶 端粒酶亚单位 逆转录-聚合酶链反应 RT—PCR 端粒重复序列扩增技术 TRAP

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L-甲状腺素诱导心肌肥厚模型下电压依赖性钾通道信使核糖核酸的表达 被引量：3

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作者 曹文 孙胜利 +2 位作者 凌树森 戴德哉 王自正 《中国循环杂志》 CSCD 北大核心 2000年第3期182-183,共2页

目的 :探讨心肌肥厚易致心律失常的机制。　　方法 :SD大鼠实验组 9只 ,对照组 7只 ,用 L -甲状腺素诱导法制备大鼠心肌肥厚模型 ,用逆转录多聚酶链反应方法(RT- PCR)半定量分析肥厚心肌内电压依赖性 K+ 通道信使核糖核酸 (m RNA)水平... 目的 :探讨心肌肥厚易致心律失常的机制。　　方法 :SD大鼠实验组 9只 ,对照组 7只 ,用 L -甲状腺素诱导法制备大鼠心肌肥厚模型 ,用逆转录多聚酶链反应方法(RT- PCR)半定量分析肥厚心肌内电压依赖性 K+ 通道信使核糖核酸 (m RNA)水平。　　结果 :实验组与对照组相比 ,实验组即肥厚心肌内电压依赖性 K+ 通道 m RNA的表达水平显著下降 (P<0 .0 5 )。　　结论 :电压依赖性 K+ 通道是心肌电活动的主要离子通道 ,心肌肥厚时电压依赖性 K+ 通道基因表达水平下降 ,可能会导致动作电位复极化时间延长 。 展开更多

关键词 心肌肥厚 电压依赖性钾通道 RT-PCR mRNA

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虹鳟Ndufb2基因全长cDNA序列的克隆与分析 被引量：1

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作者 王家庆 边佳 +3 位作者 李代宗 马爽 王亮 那广宁 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期600-606,共7页

从虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的脑组织中提取RNA,经逆转录-聚合酶链反应及cDNA末端快速扩增技术克隆出Ndufb2基因全长cDNA序列(GenBank登录号:FJ534641),并对其序列进行分析.扩增结果表明:Ndufb2基因的cDNA序列全长899bp,其中5′端非... 从虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的脑组织中提取RNA,经逆转录-聚合酶链反应及cDNA末端快速扩增技术克隆出Ndufb2基因全长cDNA序列(GenBank登录号:FJ534641),并对其序列进行分析.扩增结果表明:Ndufb2基因的cDNA序列全长899bp,其中5′端非翻译区长152bp,3′端非翻译区长441bp,开放阅读框长306bp,编码101个氨基酸;其N端前50个氨基酸为线粒体靶序列.将翻译的虹鳟Ndufb2蛋白序列与大西洋鲑(Salmo salar)的Ndufb2蛋白序列比对发现,其同源性高达98%,且虹鳟Ndufb2蛋白序列与已报道的哺乳动物的Ndufb2蛋白序列同源性均在55%以上.表明Ndufb2基因在进化过程中是高度保守的,推测其在线粒体呼吸链组成中发挥着重要作用. 展开更多

关键词 虹鳟鱼 Ndufb2基因 逆转-聚合酶链反应 CDNA末端快速扩增

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人偏肺病毒的逆转录重组酶介导等温扩增荧光检测方法的建立

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作者 焦素黎 谢蕾 +2 位作者 毛洋 倪红霞 李永东 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期780-783,共4页

目的建立一种基于逆转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)方法的人偏肺病毒快速分子诊断技术,并对其检测效果进行初步分析。方法从NCBI数据库中下载人偏病毒基因组序列... 目的建立一种基于逆转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)方法的人偏肺病毒快速分子诊断技术,并对其检测效果进行初步分析。方法从NCBI数据库中下载人偏病毒基因组序列,利用Mega软件比对分析基因组序列,确定高度保守序列作为分子检测靶标。以人偏肺病毒N蛋白基因保守序列作为靶序列,设计引物和荧光探针。并以宁波地区人偏肺病毒基因组RNA为模板,利用实时荧光定量PCR对荧光RT-RAA检测体系进行评价。以构建含有N蛋白基因序列的不同浓度重组质粒为模板进行RT-RAA荧光扩增,分析其检测灵敏性;利用建立的RT-RAA荧光法分析检测人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和博卡病毒基因组,评价其检测特异性。结果成功建立了人偏肺病毒RT-RAA扩增荧光检测方法,可在30 min内完成偏肺病毒的特异性扩增检测。以重组质粒为检测模板,RT-RAA荧光检测法的最低检出限为102拷贝/μL重组质粒,且均在15 min内出现阳性特异性扩增。与实时荧光定量PCR检测一致性达98.6%,且与其他3种病毒无交叉反应特性。结论成功建立了一种基于RT-RAA扩增的人偏肺病毒荧光检测方法,该方法灵敏度高、特异性好,在人偏病毒快速现场检测中具有潜在应用价值。 展开更多

关键词 人偏肺病毒 重组酶介导的等温扩增 分子检测 检测效果

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cDNA末端快速扩增法克隆高山离子芥原叶绿酸酯氧化还原酶基因及其表达特异性分析

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作者 李玉华 邓培渊 +1 位作者 赵奇 雷志华 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期374-379,410,共7页

用cDNA末端快速扩增技术从高山离子芥中克隆得到完整的原叶绿酸酯氧化还原酶(POR,EC:1.3.1.33)基因,命名为CbPORB,DNAMAN软件分析CbPORB和其他几种植物的POR基因,有很高的同源性,将其cDNA序列提交到NCBI数据库(序列接受号为FJ390503)。C... 用cDNA末端快速扩增技术从高山离子芥中克隆得到完整的原叶绿酸酯氧化还原酶(POR,EC:1.3.1.33)基因,命名为CbPORB,DNAMAN软件分析CbPORB和其他几种植物的POR基因,有很高的同源性,将其cDNA序列提交到NCBI数据库(序列接受号为FJ390503)。CbPORB基因全长1444bp,包含1个1209bp的开放阅读框(ORF),编码402个氨基酸的蛋白CbPORB(序列号为ACJ12925)。NCBI数据库在线软件计算高山离子芥CbPORB蛋白的等电点为9.43,推测其相对分子量为43.37kD。组织特异性表达分析显示:CbPORB在叶、茎中表达,根中不表达,具有器官特异性;干旱胁迫处理抑制CbPORB的转录水平;而表油菜素内酯(24-epibrassinolide;EBR)处理提高了CbPORB的转录水平。 展开更多

关键词 CDNA末端快速扩增 CbPORB 半定量RT-PCR 高山离子芥

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双重荧光RT-ERA技术快速检测贝类食品中诺如病毒 被引量：5

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作者 吴占文 王帅 +6 位作者 康婕 李涛 李红娜 蔡杰 张昊 杨艳歌 袁飞 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第18期355-363,共9页

目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别... 目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别将GI、GII NoV参考靶序列克隆到带有T7启动子的载体中,通过体外转录的方式获得高纯度NoV RNA参考样品。以设计的MS2噬菌体引物探针,与实验室前期筛选的GI、GII NoV引物探针进行双重荧光RT-ERA实验,并对反应体系和反应程序进行优化,分析方法的灵敏度。最后,采用建立的方法开展真实样本检测,以GB 4789.42-2016《食品微生物学检验诺如病毒检验》为参比方法进行检测结果对比,确定方法的准确性和可行性。结果:建立MS2与GI、MS2与GII两组双重荧光RT-ERA检测方法,最佳引物及探针体积分别为4.1μL与1.8μL,检测时间可缩短至10 min左右,且最低可检出102拷贝/μL的NoV核酸样品。应用所建立的方法对29份真实样品进行检测,检测结果与GB 4789.42-2016一致。结论:本研究建立的双重荧光RT-ERA检测方法可实现对MS2、GI和GII NoV的同时检测,且灵敏度高、准确性强,为今后NoV现场快速检测提供一定基础。 展开更多

关键词 诺如病毒 逆转录-酶促重组等温扩增技术 双重荧光 快速检测 贝类

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转录介导扩增技术检测慢性丙型肝炎患者血清中HCV RNA及与RT-PCR的比较 被引量：9

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作者 吴大先 刘菲 +2 位作者 刘洪波 戴立忠 谭德明 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期664-672,共9页

目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HCV RNA,并与实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)进行比较,探讨TMA系统的稳定性及其与RT... 目的:利用转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)扩增HCV RNA,并与实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)进行比较,探讨TMA系统的稳定性及其与RT-PCR的灵敏性差异和相关性,以及TMA临床应用的意义。方法:利用鼠白血病反转录酶(moloney murine leukemia virus,MMLV)、T7 RNA聚合酶及2条特异性引物等建立TMA扩增体系;通过HCV RNA的扩增曲线的相关性变化,评价不同储存温度对TMA扩增体系的稳定性和重复性的影响;通过扩增一组10倍梯度稀释的HCV RNA体外转录样本,评价TMA体系与RT-PCR的灵敏性差异。收集101份临床诊断为慢性丙型肝炎患者的血清,同时采用TMA试剂和RT-PCR试剂进行检测,比较两种方法的阳性检出率,并利用直线相关和回归探讨两种方法检测血清HCV RNA的相关性。结果:成功地建立了TMA扩增体系,该体系在室温下放置24 h,结果影响较大,但在4℃储存6 d,-20℃下储存6个月内扩增效果不受影响,稳定性良好。与湖南圣湘生物技术公司RT-PCR试剂检测结果的比较显示:31份血清标本TMA及RT-PCR均检测到阳性20例,阴性11例,检测一致率为100%。选取其中20例阳性标本进行定量分析,发现两种技术有很好的相关性(r=0.91,P<0.01)。与上海科华公司的RT-PCR试剂检测结果比较,发现在70份血清标本中,TMA检出RNA阳性标本数为34例,阴性标本数为36例,PCR检出RNA阳性标本数为32例,阴性标本数为38例,检测一致率为97.1%,两种检测方法阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。对其中29例PCR检测和TMA检测均有定量结果的血清进行分析,两种技术也有很好的相关性(r=0.96,P<0.01)。结论:TMA检测试剂在-20℃下储存,6个月内稳定性和重复性良好。TMA与RT-PCR均能很好地检出血清中HCV RNA,两种技术有很好的相关性,定量检测有很好的可比性。 展开更多

关键词 转录介导的扩增技术 丙型肝炎 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 丙型肝炎病毒核糖核酸

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