小反刍兽疫病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的建立

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作者 康新华 韩庆彦 +3 位作者 毋艳萍 牛琼 赵雯 高军军 《中国草食动物科学》 北大核心 2025年第5期27-32,共6页

为建立适用于小反刍兽疫病毒(PPRV)的临床快速检测方法,本研究基于PPRV N基因序列设计并筛选引物与探针,通过优化逆转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)反应体系的温度和时间,联合侧向层析试纸条(LFD)构建RT-RPA-LFD检测方法,并系统评价其性... 为建立适用于小反刍兽疫病毒(PPRV)的临床快速检测方法,本研究基于PPRV N基因序列设计并筛选引物与探针,通过优化逆转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)反应体系的温度和时间,联合侧向层析试纸条(LFD)构建RT-RPA-LFD检测方法,并系统评价其性能。结果表明,该方法在42℃反应15 min即可完成扩增,并可通过LFD实现结果的可视化。其灵敏度为10拷贝/μL,与常规RT-PCR灵敏度相当。对山羊传染性胸膜肺炎、绵羊支原体和丝状支原体山羊亚种等其他病原体无交叉,批间和批内重复试验均呈现出理想的检测结果,且临床样本检测结果与荧光RT-PCR检测结果的符合率达100%。综上所述,本研究建立的RT-RPA-LFD检测方法用时短、操作便捷、兼具高灵敏度与强特异性,且重复性好,适用于小反刍兽疫病毒的现场快速检测。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 重组聚合酶扩增 侧向层析试纸条 快速检测

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葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系的建立 被引量：1

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作者 黄强 张强强 顾沛雯 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第4期89-97,共9页

【目的】建立葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测体系,为快速准确诊断和有效防治葡萄霜霉病提供参考。【方法】依据葡萄霜... 【目的】建立葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测体系,为快速准确诊断和有效防治葡萄霜霉病提供参考。【方法】依据葡萄霜霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计了PF1/PR1、PF2/PR2和PF3/PR3共3对引物及探针RPA-P,对葡萄霜霉病菌DNA的ITS序列进行PCR扩增,建立了葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系,并对其反应条件进行优化,对其特异性和灵敏性进行检测。【结果】建立了葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系,引物PF1/PR1和探针RPA-P对靶标片段具有良好的特异性,检测条件为36℃扩增30 min,对葡萄霜霉病菌具有特异性;最低检测下限为10 pg/μL,灵敏性略低于常规PCR(1 pg/μL)和荧光定量PCR(100 fg/μL);对田间发病叶片的检测结果与常规PCR一致,准确性高。【结论】建立的葡萄霜霉病菌重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测体系,可以对目标物质进行快速、可视化检测,具有操作简单、特异性强、灵敏度高的特点,适宜推广使用。 展开更多

关键词 葡萄霜霉病 葡萄生单轴霉 重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测 病原检测

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弗氏柠檬酸杆菌RPA-LFD快速检测方法的建立及应用 被引量：6

3

作者 王姝然 范厚勇 +3 位作者 徐嘉楠 周天琦 许丹 郑跃平 《大连海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期241-249,共9页

为建立一种针对弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)敏感性高、特异性强的临床快速检测方法,根据该菌定居因子基因cfa的保守序列,设计特异性引物,采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),并结合琼脂糖... 为建立一种针对弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)敏感性高、特异性强的临床快速检测方法,根据该菌定居因子基因cfa的保守序列,设计特异性引物,采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),并结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)方法进行反应条件的优化及特异性与灵敏度的检测。结果表明:本研究中所建立的弗氏柠檬酸杆菌重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条(RPA-LFD)快速检测方法,在38℃条件下扩增20 min后,能特异性地检测到弗氏柠檬酸杆菌,对弗氏柠檬酸杆菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限分别为1.5×102 CFU/mL和200 fg/μL,是常规PCR(cfa引物)检测灵敏度(20 pg/μL)的100倍;利用所建立的RPA-LFD法与常规PCR同时检测杂交鲟攻毒试验样本,两种方法的检测结果一致。研究表明,本研究中建立的弗氏柠檬酸杆菌RPA-LFD方法,操作简便、反应迅速、特异性好、灵敏度高,并且不需要昂贵的仪器,该方法可为未来弗氏柠檬酸杆菌细菌性疾病的早期诊断提供更有效的技术支持。 展开更多

关键词 弗氏柠檬酸杆菌 快速检测 重组酶聚合酶扩增技术 侧向流动试纸条

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鳗鲡疱疹病毒基础RPA及RPA-LFD检测方法的比较 被引量：3

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作者 林而舒 《渔业研究》 2024年第4期367-374,共8页

【目的】鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)是鳗鲡“脱黏败血综合征”的主要病原,对鳗鲡养殖产业造成了严重的经济损失。为达到早期预警和防止病毒扩增蔓延的目的,建立一套AngHV快速检测技术对中国鳗鲡养殖疾病防控具有重要意... 【目的】鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)是鳗鲡“脱黏败血综合征”的主要病原,对鳗鲡养殖产业造成了严重的经济损失。为达到早期预警和防止病毒扩增蔓延的目的,建立一套AngHV快速检测技术对中国鳗鲡养殖疾病防控具有重要意义。【方法】本研究根据AngHV ORF55设计了扩增引物和探针,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)的基础RPA及RPA侧向流层析试纸条法(RPA-LFD)检测方法,探究了不同时间和温度对基础RPA和RPA-LFD扩增效果的影响,并比较了2种方法的灵敏度、特异性和临床应用效果。【结果】本研究建立的AngHV基础RPA及RPA-LFD快速检测方法扩增产物大小为394 bp;2种检测方法都仅需20~40 min即可完成检测过程;温度的变化对检测方法的影响不大,37~43℃范围内均能得到较好的扩增效果;2种检测方法均与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)和鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus)无交叉反应,表现出良好的特异性;RPA-LFD检测方法具有更高的检测灵敏度,检出限至1.32×10^(0)copies/mL,基础RPA检出限至1.32×10^(3)copies/mL;检测实验室保存的20份鳗鲡病料DNA,2种方法检测的结果一致,阳性率均为30%,表明AngHV基础RPA和RPALFD检测方法均具有良好的临床应用潜力。【结论】AngHV基础RPA和RPA-LFD检测方法十分适用于基层科研单位、鳗鲡产品加工场及养殖场的病毒检测,丰富了AngHV检测手段的可选性。 展开更多

关键词 鳗鲡 鳗鲡疱疹病毒(AngHV) 重组酶聚合酶等温扩增(rpa) 重组酶聚合酶等温扩增-侧向流层析试纸条法(rpa-LFD)

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绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法的特异性试验 被引量：3

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作者 豆玲 周峰 +3 位作者 高军军 王雪莹 王志宇 康文彪 《畜牧兽医杂志》 2023年第3期21-22,共2页

应用我们建立的绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法,通过对口蹄疫病毒、传染性脓疱皮炎病毒、鸡痘病毒、绵羊痘病毒、羊痘疫苗和羊痘重组质粒样本的检测,验证绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法对绵羊痘/山羊痘病毒检测的特异... 应用我们建立的绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法,通过对口蹄疫病毒、传染性脓疱皮炎病毒、鸡痘病毒、绵羊痘病毒、羊痘疫苗和羊痘重组质粒样本的检测,验证绵羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA检测方法对绵羊痘/山羊痘病毒检测的特异性。结果显示该方法对羊痘疫苗、羊痘重组质粒、绵羊痘病毒核酸和山羊痘病毒核酸阳性样品能够在试纸条上显示出阳性条带,而对其他样品不显示阳性条带。表明该方法具有良好的特异性,在绵羊痘/山羊痘病毒检测中应用前景广阔。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶扩增技术(rpa) 山羊痘病毒 试纸条 绵羊痘病毒

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烟草靶斑病LFD-RPA快速检测方法的建立 被引量：2

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作者 黎妍妍 邱梦娟 +7 位作者 李锡宏 张艺千 徐婷婷 许汝冰 马畔 郑露 李伦安 黄俊斌 《中国烟草科学》 CSCD 北大核心 2023年第5期62-69,共8页

烟草靶斑病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的烟草叶部病害,近年来在我国部分省份发生严重,危害烟草生产。为开发烟草靶斑病的早期快速诊断方法,本研究根据该病原菌的内转录间隔区(ITS),设计了重组酶聚合酶扩增... 烟草靶斑病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的烟草叶部病害,近年来在我国部分省份发生严重,危害烟草生产。为开发烟草靶斑病的早期快速诊断方法,本研究根据该病原菌的内转录间隔区(ITS),设计了重组酶聚合酶扩增技术相关引物RsRPA-F3/R3,建立了一种靶斑病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。该方法能够在37℃,15 min内特异性地检测到R.solani(1.40×10^(2) copies/µL)质粒DNA,与常规PCR灵敏度一致。在田间烟草靶斑病实时检测中,准确率达95.83%。本方法具有快速、简单、可视化等特点,为烟草靶斑病菌的田间快速诊断提供了技术支撑。 展开更多

关键词 烟草靶斑病 立枯丝核菌 重组酶聚合酶扩增技术 侧流层析试纸条

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动物A型流感病毒RPA-LFD可视化检测方法的建立 被引量：4

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作者 刘文俊 阳佑天 +5 位作者 易华东 邓汝森 杨培洁 付新亮 黄运茂 田允波 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期474-478,共5页

为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,... 为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,与新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒等无交叉反应,特异性强;反应时间短、敏感性高,可以在35℃,20 min内检测到最低浓度为10拷贝/μL的重组质粒标准品。利用该方法对从化某活禽市场分离的鸭咽拭子样品共50份进行检测,结果3份为阳性,其余均为阴性,与PCR及病毒分离结果一致,准确性高。本研究首次建立了检测动物A型IV的可视化RPA-LFD检测方法,该方法不依赖任何仪器设备,操作简单、快速,可为基层实验室临床快速检测和流行病学研究提供帮助。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶扩增 侧流层析试纸条 A型流感病毒

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重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌方法的建立与应用 被引量：1

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作者 季拓 高玉芝 +1 位作者 王彦 高绪柱 《南京医科大学学报（自然科学版）》 北大核心 2024年第1期24-31,共8页

目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引... 目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引物。通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳,根据候选引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最佳引物对。根据最佳引物对,设计探针和修饰引物。在引物和探针中引入碱基错配以消除假阳性信号,建立RPA-LFS反应体系。根据检测线的显色情况,优化RPA-LFS的最佳反应条件。使用临床常见的12种致病菌和12个临床来源的嗜麦芽窄食单胞菌检测该方法的特异性。以10倍梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板,检测该方法的灵敏度。收集108例临床样本,将该方法与qPCR检测法和生化培养法对比,对RPA-LFS检测法进行kappa一致性检验及临床应用评价。结果:RPA-LFS检测法在37℃恒温条件下8 min即可完成扩增反应,1 min内可在LFS上观察到结果。该方法灵敏度高,最低检出限为1.107 CFU,并且与其他病原菌无交叉反应,特异性强。应用于临床样本检测时,该方法与qPCR相比,检测结果准确性一致。与生化培养方法的符合率为99.07%,kappa指数值为0.972,具有良好的一致性。结论:本研究建立了一种不依赖于精密仪器和专业技术人员的RPA-LFS检测方法,能够短时间内精准鉴定嗜麦芽窄食单胞菌。该方法的建立可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息,具有较大的临床应用潜力。 展开更多

关键词 嗜麦芽窄食单胞菌 重组酶聚合酶扩增 侧向流动试纸条

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基于RPA-侧向流试纸条技术的单核细胞增生李斯特氏菌快检技术

9

作者 曹悦 李龙 +5 位作者 索一平 李庆尧 王青龙 张爽 邢超 宋丽萍 《分析测试学报》 2025年第11期2223-2228,共6页

基于重组聚合酶扩增(RPA)-侧向流试纸条技术(LFS),开发了针对单核细胞增生李斯特氏菌(单增李斯特氏菌)的快速检测技术,并对该方法的特异性、灵敏度和检出限等性能指标进行了系统评估。结果显示,RPA扩增15 min后,侧向流试纸条的检测灵敏... 基于重组聚合酶扩增(RPA)-侧向流试纸条技术(LFS),开发了针对单核细胞增生李斯特氏菌(单增李斯特氏菌)的快速检测技术,并对该方法的特异性、灵敏度和检出限等性能指标进行了系统评估。结果显示,RPA扩增15 min后,侧向流试纸条的检测灵敏度为6.5×10^(2)CFU/mL;对人工污染样品进行8 h增菌后,检出限可达1 CFU/mL。所建立的快检方法无需大型实验设备、操作简单,检测人员进行简单培训即可在20 min内完成单增李斯特氏菌的检测工作,为食品生产企业从源头加强生产环境中单增李斯特氏菌的监控提供了技术支持,有助于提升整个行业食品安全质量控制水平。 展开更多

关键词 食源性致病菌 重组聚合酶扩增(rpa)-侧向流试纸条 单核细胞增生李斯特氏菌 食品安全质量控制水平

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猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用 被引量：9

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作者 张森豪 王雪莹 +12 位作者 蔡李萌 解伟纯 匡虹迪 王晓娜 李佳璇 崔文 姜艳平 周晗 单智夫 王丽 乔薪瑗 李一经 唐丽杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2498-2508,共11页

旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶... 旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL^(-1),且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对仪器、场地和检测环境的要求更低,为今后PEDV的临床诊断及快速检测提供了更多的选择和更有效的技术支持。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 重组酶聚合酶扩增(rpa) 侧流层析(LFD) 快速诊断方法

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重组酶等温扩增试纸条快速检测阪崎克罗诺杆菌 被引量：12

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作者 陈纯阳 张宸宁 +2 位作者 史爱莹 杜欣军 王硕 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第24期306-312,共7页

将重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与免疫层析试纸条(lateral flowstrip,LF)相结合,建立一种阪崎克罗诺杆菌快速检测方法(RPA-LF)。将引物分别用生物素和地高辛修饰后进行RPA,产生生物素和地高辛标记... 将重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与免疫层析试纸条(lateral flowstrip,LF)相结合,建立一种阪崎克罗诺杆菌快速检测方法(RPA-LF)。将引物分别用生物素和地高辛修饰后进行RPA,产生生物素和地高辛标记的双链DNA产物,扩增产物与胶体金标记的地高辛抗体及试纸条上固定的链霉亲和素发生特异性结合,最终在试纸条上呈现肉眼可见的结果。灵敏度分析结果显示,该方法对纯培养目标菌的检测限为1.7×102 CFU/mL,特异性分析结果显示RPA-LF方法与其他常见病原菌无交叉反应。利用人工污染的食物样品评估RPA-LF检测效果,结果显示不同样品增菌4 h或6 h后,检测限达到1.7×100 CFU/g。利用20 种实际样品作为检测对象、利用国标方法作为对照,评估方法的检测效果,结果显示本研究所建立的方法与国家标准检测方法获得一致的检测结果。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶等温扩增技术 免疫层析试纸条 阪崎克罗诺杆菌 快速检测

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杀鲑气单胞菌可视化重组酶聚合酶扩增检测技术的建立 被引量：1

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作者 谷庆花 李铭远 +1 位作者 司鑫鑫 高嵩 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2022年第1期52-57,共6页

本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips,LFS)相结合的... 本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips,LFS)相结合的可视化快速检测杀鲑气单胞菌的方法。结果显示:本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法在37℃孵育25 min即可完成,特异性良好,与其他致病菌无交叉反应;灵敏度实验结果显示,该菌的纯培养物和人工污染的鲤鱼组织中的最低检测限均为单次反应1 CFU(colony forming unit)。本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,检测结果可通过肉眼直接观察,操作简单,不依赖昂贵的仪器设备,适用于养殖业中杀鲑气单胞菌的现场检测。 展开更多

关键词 杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida) 重组酶聚合酶扩增 侧向流试纸条 现场检测

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基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测鲤疱疹病毒2型的方法研究

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作者 韩进刚 王菁 +3 位作者 徐赟霞 刘群 罗璋 冯守明 《河北渔业》 2022年第6期29-34,共6页

为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法... 为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法,并将样品简易处理方法运用于该方法对实验室保存的鲫组织样品进行检测。结果显示,该RPA-LFD检测方法最佳反应条件为40℃20 min,最低检出限为6×10^(0) copies/μL,与荧光PCR的灵敏度相当,与其他鲤疱疹病毒等无交叉反应;运用该方法并结合待检样品简易处理方法(直接RPA法)对50份鲫组织样品进行处理和检测,其结果与运用国家标准(GB/T 36194-2018)中荧光PCR方法检测结果一致。本文建立的RPA-LFD检测方法具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强的优点,适于在水产养殖场和基层部门用于鲤疱疹病毒病的辅助诊断和监测。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒2型(CyHV-2) 重组酶聚合酶扩增(rpa) 侧流层析试剂条(LFD) 直接rpa法

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