IN-1重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

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作者 郑伟 王勇 +1 位作者 吴安华 王运杰 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期329-331,共3页

目的 :设计并人工合成IN 1重组单链抗体 (recombinantIN 1single chainantibody)的cDNA克隆 ,构建其表达载体 ,在原核系统中实现初步表达。方法 :根据 genebank中发表的IN 1抗体的轻链重链序列 ,重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片... 目的 :设计并人工合成IN 1重组单链抗体 (recombinantIN 1single chainantibody)的cDNA克隆 ,构建其表达载体 ,在原核系统中实现初步表达。方法 :根据 genebank中发表的IN 1抗体的轻链重链序列 ,重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段 ,该基因双链分 35个小片段合成 ,经退火、复性连接成目的片段后 ,克隆到克隆载体 pUC 18中 ,经全自动序列分析仪测序证实后 ,再亚克隆至表达载体pET 2 8a(+) ,转化大肠杆菌BL2 1,诱导表达。结果 :测序结果合成的基因序列与设计的仅差一个碱基 ;SDS PAGE检测显示 ,表达出相对分子量 31kd的融合蛋白。结论 :IN 1重组单链抗体基因表达载体的构建和表达 ,为深入研究其生物活性奠定了基础。 展开更多

关键词 in-1重组单链抗体 原核表达 融合蛋白

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新型抗HIV-1重组导向制剂SL41在毕赤酵母中的表达及活性实验 被引量：8

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作者 李昌 王宏 +5 位作者 金宁一 金洪涛 刘玉生 于芳 李子健 张立树 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2007年第8期1493-1496,共4页

以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础,通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxinA,SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41,线性化后,采用电转化法整合入巴... 以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础,通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxinA,SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41,线性化后,采用电转化法整合入巴斯德菌毕赤酵母GS115中,经His+MutS表型鉴定、PCR分析以及G418筛选获得高拷贝重组转化子.摇瓶培养、甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,目的蛋白得到良好表达,表达量最高可达到47.9 mg/L.目的蛋白经初步纯化后,用于制备的HIV-1感染靶细胞复制模型进行抗体亲和力测定、细胞结合活性测定和细胞杀伤活性研究,结果显示,目的蛋白能够很好地与靶细胞模型中的HIV-1外膜蛋白gp160发生结合反应,并可介导特异的CTL反应,对靶细胞具有明显的杀伤活性,表明获得了具有生物活性的抗HIV-1重组导向制剂. 展开更多

关键词 HIV-1 重组导向制剂 单链抗体 金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA) 分泌表达 毕赤酵母

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整合PD-L1单链抗体的融合蛋白制备及其抗肿瘤活性的验证 被引量：1

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作者 谈燚 秦中强 +5 位作者 周万飞 李红俊 刘明珠 许文青 李正红 李永海 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期202-206,共5页

目的:利用酵母表面递呈技术,分泌表达抗PD-L1单链抗体(sc Fv),纯化后得到能特异性结合PD-L1抗原的小分子抗体片段(sc Fv)。根据单链抗体基因序列,合成sc Fv抗体基因序列。选用sc Fv-mFc融合蛋白的方式,并采用p Fuse真核表达载体来表达此... 目的:利用酵母表面递呈技术,分泌表达抗PD-L1单链抗体(sc Fv),纯化后得到能特异性结合PD-L1抗原的小分子抗体片段(sc Fv)。根据单链抗体基因序列,合成sc Fv抗体基因序列。选用sc Fv-mFc融合蛋白的方式,并采用p Fuse真核表达载体来表达此sc Fv-mFc融合蛋白,研究其对肺腺癌细胞(A549)的亲和力和体内外抑制作用。方法:采用基因工程的方法构建重组质粒p Fuse-scFv,通过真核转染至293F(人胚肾细胞),使用无血清Pro 293a-CDM培养72 h,收集培养液中分泌的融合蛋白,运用免疫组化检测sc Fv-mFc融合蛋白与肿瘤细胞的结合;流式细胞术分析融合蛋白和肿瘤细胞的亲和力; ADCC(抗体介导的细胞毒实验)测定融合蛋白对肿瘤细胞体外杀伤作用;利用接种肺腺癌细胞的荷瘤小鼠对融合蛋白的体内抗肿瘤效应进行研究。结果:通过重组质粒转染至293F细胞的方法,sc Fv-mFc融合蛋白被分泌到无血清的培养液中;免疫组化和流式结果显示,融合蛋白与表面高表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞有较强的结合能力; ADCC实验结果示融合蛋白在体外对肿瘤细胞的杀伤作用;荷瘤小鼠实验结果示融合蛋白对肿瘤的生长起到抑制作用,在5 mg/kg的药物剂量下,荷瘤小鼠瘤体体积平均增长率从14. 90%降低至3. 72%,两独立样本t检验P<0. 05,差异具有统计学意义。结论:成功制备了含单链抗体的融合蛋白,其对A549细胞具有良好的结合能力,在体内外均对肿瘤细胞的增殖产生抑制作用,为研制靶向抗肿瘤药物提供实验室基础依据。 展开更多

关键词 重组质粒 PD-L1 单链抗体 融合蛋白 免疫抑制

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噬菌体展示库筛选构建血管细胞黏附分子-1单链抗体及其效价检测 被引量：1

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作者 刘纯宝 宋夷龄 张永学 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期390-394,共5页

目的从噬菌体重组抗体库中筛选获得靶向血管细胞黏附分子-1（Vcam-1）的单链抗体,纯化浓缩后进行亲和性鉴定,并与单克隆抗体效价进行比较。方法扩增Vcam-1基因克隆质粒并转入真核细胞中表达获得Vcam-1抗原蛋白,纯化后包被免疫管,通过4... 目的从噬菌体重组抗体库中筛选获得靶向血管细胞黏附分子-1（Vcam-1）的单链抗体,纯化浓缩后进行亲和性鉴定,并与单克隆抗体效价进行比较。方法扩增Vcam-1基因克隆质粒并转入真核细胞中表达获得Vcam-1抗原蛋白,纯化后包被免疫管,通过4轮压力逐渐增大的＂吸附-洗脱-扩增＂过程筛选获得阳性克隆。对阳性克隆进行ELISA检测,选取效价高的克隆送予测序并转入大肠埃希菌进行表达,认定高表达的样品为最终的阳性克隆。将该阳性克隆转染入感受态细胞表达单链抗体,纯化后经ELISA检测并评价其抗原亲和性。结果真核细胞表达的Vcam-1抗原蛋白的分子量为85~90kD。以Vcam-1抗原蛋白为免疫原筛选4轮所得的阳性克隆进行单噬菌体ELISA检测,从检测结果中选取9个效价高的克隆经基因测序共获得3个序列,其中1个序列对应的克隆高表达。表达的单链抗体分子量约30kD,ELISA检测其对Vcam-1抗原蛋白有较高亲和性,效价较单克隆抗体低。结论利用噬菌体展示技术获得了靶向Vcam-1的单链抗体,为随后的诊断和治疗应用奠定了基础。 展开更多

关键词 噬菌体展示 单链抗体 血管细胞黏附分子-1 重组抗体

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超抗原葡萄球菌肠毒素与抗人大肠癌单链抗体ND-1 scFv融合基因的构建、表达及活性分析

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作者 陈航 李莉 方瑾 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期400-403,共4页

目的:构建并表达超抗原葡萄(SEA)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,以提高SEA的靶向杀伤作用。方法:构建超抗原SEA和鼠抗人大肠癌单链抗ND-1scFv的融合基因ND-1 scFv/SEA的表达载体,转化到大肠杆菌E.coli M15中进行诱导表达。N... 目的:构建并表达超抗原葡萄(SEA)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,以提高SEA的靶向杀伤作用。方法:构建超抗原SEA和鼠抗人大肠癌单链抗ND-1scFv的融合基因ND-1 scFv/SEA的表达载体,转化到大肠杆菌E.coli M15中进行诱导表达。Ni-NTA亲和层析对表达产物进行分离、纯化。间接免疫荧光法检测融合蛋白的靶向结合活性,MTT法检测靶向杀伤效率。结果:成功构建了融合基因ND-1scFv/SEA,实现功能性表达,纯化的ND-1scFv/SEA融合蛋白与表达有ND-1相应抗原的大肠癌细胞CCL-187有高度亲和活性,通过激活外周血单核细胞,可特异性杀伤靶细胞,在4μg/mL浓度下对CCL-187的杀伤率达到91%,明显优于SEA的杀伤活性。结论:融合蛋白ND-1 scFv/SEA对大肠癌细胞CCL-187具有靶向结合和杀伤活性,为SEA用于靶向性的大肠癌治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 ND-1单克隆抗体 单链抗体Fv 葡萄球菌肠毒素A 大肠癌

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HIF1α特异性人源喉癌噬菌体单链抗体的制备及其对放疗增敏的实验研究

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作者 周寒静 刘静姝 +2 位作者 隆姝孜 唐翠萍 张涛 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第16期1625-1630,共6页

目的利用噬菌体肽库技术,构建HIF1α人源喉癌单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),研究其对放疗敏感性的影响。方法提取喉癌患者癌旁阳性淋巴结总RNA,通过RTPCR和重叠延伸PCR扩增得到可变区基因scFv,将其重组到载体pCANTAB5E... 目的利用噬菌体肽库技术,构建HIF1α人源喉癌单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),研究其对放疗敏感性的影响。方法提取喉癌患者癌旁阳性淋巴结总RNA,通过RTPCR和重叠延伸PCR扩增得到可变区基因scFv,将其重组到载体pCANTAB5E中,转化至TG1大肠杆菌,以制备初级抗体库。以HEP2细胞及HIF1α纯化抗原对抗体库进行淘选。SDS-PAGE电泳检测scFv的可溶性表达,Western blot检测其对HIF1α蛋白表达的影响,ELISA和细胞免疫化学鉴定其特异性,CCK-8检测scFv联合X线照射后HEP2细胞的存活率,克隆形成实验分析scFv处理后HEP2细胞放疗存活曲线。结果成功制备HIF1α人源喉癌单链抗体scFv,SDS-PAGE电泳证实其可溶性表达且相对分子质量约为34×10~3,Western blot表明其能下调HIF1α蛋白的表达。ELISA检测到该抗体对HIF1α抗原的识别率高达79%,细胞免疫化学显示该抗体与HEP2细胞特异性结合。CCK-8检测结果显示scFv联合X线照射后,较单纯X线照射组明显降低了HEP2细胞的存活率(P<0.05),克隆形成实验结果显示scFv对放射的增敏比为1.89。结论成功构建了HIF1α人源喉癌单链抗体,且其能增加HEP2细胞对放疗的敏感性。 展开更多

关键词 噬菌体单链抗体scFv 喉癌 HIF1Α 放疗增敏

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抗Ⅰ型鸭肝炎病毒RdRp蛋白噬菌体单链抗体库构建及单链抗体的淘选 被引量：5

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作者 王永娟 李碧春 +2 位作者 沈明君 洪伟鸣 左伟勇 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期334-338,共5页

为构建抗1型鸭肝炎病毒(DHV-1)RdRp蛋白的单链抗体(scFv)库,并淘选特异性scFv,本研究采用RT-PCR方法从DHV-1基因组中扩增Rd Rp基因,将其克隆于pET-32a载体中进行重组RdRp蛋白原核表达。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,以提取的免疫鼠脾脏总RN... 为构建抗1型鸭肝炎病毒(DHV-1)RdRp蛋白的单链抗体(scFv)库,并淘选特异性scFv,本研究采用RT-PCR方法从DHV-1基因组中扩增Rd Rp基因,将其克隆于pET-32a载体中进行重组RdRp蛋白原核表达。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,以提取的免疫鼠脾脏总RNA为模板,利用抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)简并引物,经RT-PCR扩增抗体的VL和VH编码序列,由Linker序列连接,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)扩增完整的sc Fv基因(VL-Linker-VH)。将扩增的scFv基因克隆于pCANTAB5E载体中构建噬菌体scFv文库,利用纯化的重组RdRp蛋白开展4轮吸附-洗脱-富集以淘选抗RdRp的ScFv;最后对淘选到的阳性ScFv进行可溶性表达,以ELISA方法检测其免疫结合活性。结果显示,获得了7株具有良好抗原结合活性的ScFv。淘选到的DHV-1 RdRp特异的基因工程ScFv,为鸭病毒性肝炎防制新策略研究奠定了基础。 展开更多

关键词 Ⅰ型鸭肝炎病毒 RDRP 噬菌体抗体库 单链抗体

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抗诺氟沙星噬菌体单链抗体库的构建与筛选 被引量：11

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作者 郑志明 金社胜 +1 位作者 肖希龙 候晓林 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第S1期36-41,共6页

应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗诺氟沙星(NFLX)单链抗体库,筛选获得抗NFLX高特异性、高亲和力的单链抗体scFv。将NFLX与BSA化学偶联获得的免疫源,免疫Balb/C小鼠,提取脾细胞RNA,反转录获得cDNA。以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可... 应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗诺氟沙星(NFLX)单链抗体库,筛选获得抗NFLX高特异性、高亲和力的单链抗体scFv。将NFLX与BSA化学偶联获得的免疫源,免疫Balb/C小鼠,提取脾细胞RNA,反转录获得cDNA。以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的特异性引物,扩增获得VH基因和VL基因。通过SOE-PCR法将VH基因和VL基因通过柔性多肽Linker((Gly4Ser)3)拼接成VH-Linker-VL片段,酶切(sfiⅠ+NotⅠ)处理后,插入噬粒载体pCANTAB5E,并转化宿主菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建抗NFLX噬菌体单链抗体库。以包被抗原NFLX-OVA包被96孔板,亲和富集法,经三轮淘筛,间接Elisa初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。成功构建噬菌体单链抗体库,获得鼠源抗NFLX特异性的scFv,噬菌体中scFv插入率为90%,获得库容约为1.3×106的抗NFLX噬菌体单链抗体库,筛选得到5株抗NFLX的scFv。为运用噬菌体展示抗体技术制备特异性抗药物单抗及进一步建立药残检测新技术奠定了基础。 展开更多

关键词 诺氟沙星 噬菌体展示技术 单链抗体

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抗肿瘤侵袭与转移单链抗体scFv-M97基因克隆及分泌性表达 被引量：8

9

作者 周春水 江敏 +1 位作者 徐琳娜 甄永苏 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第2期81-88,共8页

目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体。方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×10~9pfu/ml单链抗体库。... 目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体。方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×10~9pfu/ml单链抗体库。对抗体库进行一轮抗原固相化亲和富集与ELISA筛选鉴定,得到30株阳性噬菌体。结果 DNA序列分析表明,抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv-M97基因全长732bp。其中V_H351bp,编码117个氨基酸;V_L336bp,编码112个氨基酸,两者以连接肽(Gl_(y_4)Ser)_3相连。阳性噬菌体转染HB2151细胞,经1 mmol/L IPTG诱导培养20h,培养液上清中有2μg/ml可溶性单链抗体。免疫印迹证实所表达产物保留了原亲本抗体的特异性和亲合力。结论单链抗体scFv-M97可分泌性表达,为以Ⅳ型胶原酶为靶点的抗肿瘤侵袭与转移的治疗及新型导向药物的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 单链Fv抗体 基因克隆 表达 肿瘤侵袭 肿瘤转移

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抗HBsAg单链抗体的等电点测定和结构模拟 被引量：2

10

作者 熊盛 王一飞 +5 位作者 钱垂文 罗勇 陈文吟 饶桂荣 粟宽源 余宙耀 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2003年第11期73-76,共4页

应用实验生物学和计算生物学方法对重组人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)的部分理化性质和空间结构进行分析 .首先应用蛋白质分析软件包Antheprot预测HB scFv等电点 ,然后等电聚焦测定HBscFv等电点 ,在此基础上 ,用神经网络法预测HB scFv... 应用实验生物学和计算生物学方法对重组人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)的部分理化性质和空间结构进行分析 .首先应用蛋白质分析软件包Antheprot预测HB scFv等电点 ,然后等电聚焦测定HBscFv等电点 ,在此基础上 ,用神经网络法预测HB scFv二级结构 ,然后用同源建模的方法 ,获得HBscFv三级结构 .结果发现 ,HBscFv等电点理论值为 8.5 1,实验值为 7.3～ 8.1;PHDsec结果表明 ,HBscFv是一种全β蛋白质 ;三级结构建模表明 ,HBscFv的VH 结构域由 9个片层组成 ,VL 结构域由 8个片层组成 ;由于单链抗体的特殊性 ,三级结构建模无法给出VH 与VL 结构域之间进一步折叠后形成的结构 . 展开更多

关键词 乙肝表面抗原 单链抗体 等电点 结构预测 重组人源抗体

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一种导向性溶栓剂的基因构建及其在大肠杆菌中的表达 被引量：4

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作者 杨嘉树 蒋朋宸 茹炳根 《北京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 1999年第4期487-495,共9页

以针对人活化血小板表面糖蛋白ＧＭＰ１４０的单克隆抗体ＳＺ５１的单链抗体作为导向分子，以单链尿激酶３２ｋｄ变体（ｓｃｕＰＡ３２ｋ）作为效应分子，构建了一种新型的导向性溶栓剂。通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ），分别从ＳＺ... 以针对人活化血小板表面糖蛋白ＧＭＰ１４０的单克隆抗体ＳＺ５１的单链抗体作为导向分子，以单链尿激酶３２ｋｄ变体（ｓｃｕＰＡ３２ｋ）作为效应分子，构建了一种新型的导向性溶栓剂。通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ），分别从ＳＺ５１的Ｆａｂ片段基因中扩增出ＶＫ和ＶＨ区；从尿激酶原基因中扩增出ｓｃｕＰＡ３２ｋ基因。通过合适的ｌｉｎｋｅｒ及酶切位点，将ＶＫ，ＶＨ及ｓｃｕＰＡ３２ｋ基因相连接并装入表达载体ｐＥＴ５ａ中的ＮｄｅＩ位点，在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了重组蛋白。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ检测到在８ｍｏｌ／Ｌ尿素存在下，该重组蛋白与抗尿激酶的多克隆抗体之间仍有弱的结合反应。表达产物经变复性处理和部分分离纯化后，在纤维蛋白平板上表现有较好的纤溶活性，且这种活性是通过激活纤维蛋白溶酶原为纤溶酶而实现的。重组蛋白纤溶活性的比活达到１７５００ＩＵ／ｍｇ，较好地保留了尿激酶的纤溶活性，重组蛋白的产率约每１００ｇ湿菌为１５ｍｇ。 展开更多

关键词 单克隆抗体 导向性溶栓剂 基因构建 基因表达

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用于“野生小家鼠来源一号染色体替换系”构建的PCR-LDR分型系统 被引量：8

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作者 晁天柱 陈国强 +3 位作者 赵莹 李凯 周宇荀 肖君华 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2011年第5期372-376,共5页

目的建立用于"野生小家鼠来源一号染色体替换系"构建的PCR-LDR(polymerase chain reactionand ligase detection reaction,PCR-LDR)分型系统。方法采用易于判断的二元性遗传标记单核苷酸多态性位点(single nuclear polymorphi... 目的建立用于"野生小家鼠来源一号染色体替换系"构建的PCR-LDR(polymerase chain reactionand ligase detection reaction,PCR-LDR)分型系统。方法采用易于判断的二元性遗传标记单核苷酸多态性位点(single nuclear polymorphism point,SNP),应用连接酶检测技术(ligase detection reaction,LDR),建立PCR-LDR分型方案。结果三组多重PCR-LDR分型方案适用于覆盖整条一号染色体的29个SNP遗传位标的分型,位点间平均遗传距离在6.25厘摩(centimorgan,cM)。结论实现了后代小鼠快速、高通量的基因分型,可准确检测1号染色体各区段的重组事件。 展开更多

关键词 野生小家鼠来源的一号染色体替换系 PCR-LDR分型系统 重组

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CEA单链抗体表达质粒构建及产物纯化 被引量：1

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作者 李彪 朱承谟 吴祥甫 《上海第二医科大学学报》 CSCD 2000年第3期203-206,共4页

目的单链抗体基因的构建并在大肠杆菌中进行表达以及表达产物的纯化研究。　方法采用重组PCR技术将已获得的抗癌胚抗原 (CEA)鼠源单克隆抗体E7B10 重、轻链可变区基因 (VH、Vk)经 (Gly4 Ser) 3 编码的寡核苷酸拼接成单链抗体基因 ,并在... 目的单链抗体基因的构建并在大肠杆菌中进行表达以及表达产物的纯化研究。　方法采用重组PCR技术将已获得的抗癌胚抗原 (CEA)鼠源单克隆抗体E7B10 重、轻链可变区基因 (VH、Vk)经 (Gly4 Ser) 3 编码的寡核苷酸拼接成单链抗体基因 ,并在大肠杆菌中表达了单链抗体C端融合 6×His蛋白 ,表达产物经Ni2 +-IDASepharose 6B亲和柱纯化。　 结果表达的融合蛋白在胞内主要以可溶性存在 ,其表达量达到菌体总蛋白的 10 % ,SDS -PAGE和Western印迹图谱显示表达产物分子量为 2 7kd ,与其基因编码蛋白的理论推算值相符。表达产物经Ni2 +-IDASepharose 6B亲和柱纯化 ,纯度可达 90 %以上 ,得率为 0 .8mg/ 10 0ml。　 结论纯化后的融合蛋白具有CEA结合活力 ,其亲和常数为 5 .4× 10 7/M(抗体结合浓度 ) ,略低于其亲本单抗E7B10 2 .7× 10 9/M。 展开更多

关键词 单链抗体 CEA 质粒 结直肠肿瘤 放射免疫显像

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抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

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作者 孙涛 王勇 +2 位作者 王运杰 吴安华 公茂青 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期398-400,425,共4页

目的 :重新设计并人工合成抗NI 35重组单链抗体 (anti NI 35 scFv)的cDNA克隆 ,构建其表达载体 ,在原核系统中实现初步表达。方法 :根据抗NI 35抗体的轻链重链序列 ,重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段 ,经退火、复性连接成目的... 目的 :重新设计并人工合成抗NI 35重组单链抗体 (anti NI 35 scFv)的cDNA克隆 ,构建其表达载体 ,在原核系统中实现初步表达。方法 :根据抗NI 35抗体的轻链重链序列 ,重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段 ,经退火、复性连接成目的片段后 ,克隆到克隆载体 pUC 18中 ,经全自动序列分析仪测序证实 ,再亚克隆至表达载体 pET 2 8a(+) ,转化大肠杆菌BL2 1,诱导表达。 结果 :合成的基因序列与设计的仅差一个碱基 ,目的基因连接方向及阅读框架正确 ;SDS PAGE检测显示 ,表达出相对分子量 31kDa的融合蛋白 ,并得到了良好的生物活性。结论 :抗NI 35重组单链抗体基因表达载体的构建和表达 。 展开更多

关键词 抗NI-35重组单链抗体 基因合成 表达

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抗克百威单链抗体的可溶性表达载体的构建及鉴定

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作者 邓龙 王弘 +2 位作者 周思 冼燕萍 郭新东 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2015年第16期178-182,共5页

为构建克百威(carbofuran,CBF)单链抗体(sc Fv)可溶性表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以p CANTAB5E-sc Fv质粒为模板扩增CBF的重链(VH)及轻链(VL)片段,通过引物设计引入由15个氨基酸组成的连接肽(Gly4Ser)3,经重叠延伸拼接重链及... 为构建克百威(carbofuran,CBF)单链抗体(sc Fv)可溶性表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以p CANTAB5E-sc Fv质粒为模板扩增CBF的重链(VH)及轻链(VL)片段,通过引物设计引入由15个氨基酸组成的连接肽(Gly4Ser)3,经重叠延伸拼接重链及轻链片段,并通过PCR扩增得到sc Fv基因,再与载体p LIP6/GN连接,转化大肠杆菌BL21,阳性克隆质粒经PCR鉴定并测序。重组菌经0.6μmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)及低温诱导表达重组单链抗体,并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用ELISA法检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒p LIP6/GN-sc Fv含有插入片段,sc Fv与碱性磷酸酶(AP)相连得到重组蛋白的分子量接近78 ku,可被游离的CBF竞争性抑制,IC50值为26.80 ng/m L。这说明成功构建了重组质粒p LIP6/GN-sc Fv并实现了其在大肠杆菌中的可溶性表达,为研究其在免疫分析方法中的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 克百威 重组单链抗体 可溶性表达

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抗B7-H4单链抗体库的构建和筛选及抗体特异性鉴定 被引量：2

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作者 邵峦峦 徐超超 +4 位作者 纪洪帅 毛伟平 王盈盈 刘小綪 朱岩岩 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1260-1266,共7页

目的构建小鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示单链抗体(sc Fv)库,并筛选出特异性高的抗体。方法从A549细胞的c DNA中扩增B7-H4胞外区基因,将其插入原核表达载体p ET-28 a(+)中表达,获得B7-H4胞外区重组蛋白后纯化并免疫BALB/c小鼠。从免疫小鼠... 目的构建小鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示单链抗体(sc Fv)库,并筛选出特异性高的抗体。方法从A549细胞的c DNA中扩增B7-H4胞外区基因,将其插入原核表达载体p ET-28 a(+)中表达,获得B7-H4胞外区重组蛋白后纯化并免疫BALB/c小鼠。从免疫小鼠脾脏中提取总RNA,并利用反转录PCR、重叠延伸PCR(SOE-PCR)等技术扩增出重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)、VH接头(VH-linker)序列和Vκ接头(Vκ-linker)序列,得到重轻链可变区基因的连接产物VH/Vκ。VH/Vκ与p UM19-T载体连接并转化至E.coli DH5α感受态菌株中,利用菌落PCR技术鉴定并测序。使用TNTT7 Quick for PCR DNA试剂盒对构建出的抗体库进行体外翻译与筛选,采用Western blot法和间接ELISA对得到的抗体进行特异性鉴定。结果经生物公司测序分析,得到序列正确的重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)及二者连接产物(VH/Vκ),大小分别为439 bp、680 bp及1098 bp。经特异性实验分析,从得到的抗体库中筛选出的抗体与B7-H4具有高特异性结合能力。结论成功构建出鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示sc Fv库,并筛选出与B7-H4胞外区重组蛋白高特异性结合的目标sc Fv。 展开更多

关键词 B7-H4 胞外区 单链抗体 核糖体展示 重组蛋白

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人源性促甲状腺激素受体单链抗体Fc融合蛋白的制备及鉴定 被引量：3

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作者 吴黎黎 贾健安 +1 位作者 邵璇璇 黄保军(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第14期1720-1723,共4页

目的:构建含有促甲状腺激素受体抗体(TRAb)单链抗体的重组载体pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc,通过Bac-to-Bac表达系统实现单链抗体融合蛋白的高效表达,并检测目的蛋白表达和免疫学活性。方法:TRAb抗体的重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)的序列... 目的:构建含有促甲状腺激素受体抗体(TRAb)单链抗体的重组载体pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc,通过Bac-to-Bac表达系统实现单链抗体融合蛋白的高效表达,并检测目的蛋白表达和免疫学活性。方法:TRAb抗体的重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)的序列以linker(G4S)连接,构建ScFv;Genbank检索人IgG1Fc序列,SnapGene软件分析上述序列和载体pFastBacTM1,以基因合成方式构建重组质粒pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc;pFastBacTM1-ScFv-IgG1Fc转化感受态大肠杆菌DH10Bac生成重组杆粒,pUC/M13正向和反向引物进行PCR分析确认目的基因的序列;重组杆粒采用Cellfectin®Ⅱ试剂转染昆虫细胞Sf9生成P1病毒储液,继续感染Sf9生成高滴度的P2和P3病毒储液;P3病毒储液感染High FiveTM细胞,收集上清通过SPA-Sepharose CL-4B亲和层析纯化获得较纯的单链抗体融合蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白;化学发光和免疫组化检测目的蛋白抗原结合力。结果:PCR扩增得到约3747 bp的基因序列,重组杆粒中目的基因正确插入;目的蛋白位于55 kDa附近且无杂带,纯度较高;目的蛋白浓度为248 U/L,单链抗体融合蛋白的结合力较好。结论:Bac-to-Bac表达系统成功构建并表达了TRAb单链抗体融合蛋白,抗原亲和力良好。 展开更多

关键词 促甲状腺激素受体抗体 单链抗体 昆虫细胞 重组质粒 重组杆粒

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抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重组免疫毒素的表达和功能性检测 被引量：2

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作者 纪洪帅 郭锦瑞 +1 位作者 杨颖 毛伟平 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期354-361,366,共9页

目的:构建基于抗B7-H4单链抗体(sc Fv)的重组毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,检测毒素蛋白的抗肿瘤作用。方法:通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将anti-B7-H4-scFv基因和毒素PE38KDEL基因进行连接,重组基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中表... 目的:构建基于抗B7-H4单链抗体(sc Fv)的重组毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,检测毒素蛋白的抗肿瘤作用。方法:通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将anti-B7-H4-scFv基因和毒素PE38KDEL基因进行连接,重组基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达,蛋白经变复性和镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化后进行Western blot鉴定;间接ELISA和流式分析技术进行特异性鉴定。利用MTT法和皮下移植瘤模型实验,检测毒素对体外、内肿瘤细胞的抑制作用,并对肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。结果:酶联后得到重组表达载体pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,纯化后的毒素蛋白对肿瘤细胞具有一定杀伤力,并且在肿瘤模型实验中能抑制体内肿瘤的生长。结论:成功构建了基于抗B7-H4单链抗体的重组毒素表达体系,经鉴定重组毒素蛋白有良好的生物学功能活性和抗肿瘤活性。 展开更多

关键词 B7-H4 单链抗体 绿脓杆菌外毒素PE38KDEL 重组免疫毒素 靶向治疗

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