为建立一种重复性好、灵敏度高、特异性好的西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)检测方法,以WNV保守区域NS2A序列为模板,设计引物和探针,建立了检测WNV的数字RT-PCR方法。对该方法引物浓度梯度、扩增反应温度梯度、模板梯度以及灵敏度和模...为建立一种重复性好、灵敏度高、特异性好的西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)检测方法,以WNV保守区域NS2A序列为模板,设计引物和探针,建立了检测WNV的数字RT-PCR方法。对该方法引物浓度梯度、扩增反应温度梯度、模板梯度以及灵敏度和模拟样品检测效果进行评估。结果显示:本方法在引物终浓度900 nmol/L、探针浓度250 nmol/L、退火温度60℃时效率最高;方法的特异性较好,对弓形虫、布鲁氏菌、禽流感病毒、H3N8亚型马流感病毒、尼帕病毒、马疱疹病毒、马动脉炎病毒等病原无交叉反应;对WNV的检测灵敏度可达4 copies/μL,对强阳性及临界阳性模拟样品全部检出。结果表明,建立的WNV数字RT-PCR方法高效、特异、灵敏,较适用于低病毒浓度样品或感染初期动物的检测,对WNV感染防控和口岸检测具有重要意义,具有广阔的应用前景。展开更多
为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38....为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。展开更多
文摘为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。
