实时荧光环介导等温扩增快速检测黄曲霉毒素产生菌方法的建立

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作者 陈晨 陶泽 +5 位作者 王可 李晴晴 安红玉 卢增慧 李拖平 李苏红 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第4期335-344,共10页

黄曲霉毒素是一种具备强致肝损伤性、致癌性和致畸性的微生物毒素。根据产黄曲霉毒素调节基因aflR、柄曲霉素转甲基酶基因omt-1、杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1分别对实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP... 黄曲霉毒素是一种具备强致肝损伤性、致癌性和致畸性的微生物毒素。根据产黄曲霉毒素调节基因aflR、柄曲霉素转甲基酶基因omt-1、杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1分别对实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物进行设计,对其建立并优化LAMP体系。结果显示,该文所建立的方法针对aflR、omt-1、ver-1基因设计的引物,黄曲霉菌DNA的检出限分别是1.0×10^(-2)、1.0×10^(-3)、1.0×10^(-4) ng/μL。此体系与黄曲霉及寄生曲霉反应成阳性,与其他菌体反应皆为阴性,该方法耗时短、设备要求低,借助恒温荧光读取设备或根据显色剂颜色变化可在60 min内迅速判定待检菌株是否为黄曲霉毒素产生菌,可满足各机构现场快速高效检测的需要。 展开更多

关键词 黄曲霉毒素产生菌 实时荧光环介导等温扩增 快速检测 黄曲霉毒素调节基因aflR 柄曲霉素转甲基酶基因omt-1 杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1

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实时荧光环介导等温扩增快速分型致泻大肠埃希氏菌方法的建立 被引量：2

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作者 李芮 黄艳梅 +5 位作者 童晓钰 山珊 刘成伟 谭俣宬 陈芳 刘道峰 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期233-240,I0005,I0006,共10页

致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)是一种重要的食源性致病菌,该研究立足DEC目前流行率高、基层分型困难的现状,建立了快速分型5种DEC的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法... 致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)是一种重要的食源性致病菌,该研究立足DEC目前流行率高、基层分型困难的现状,建立了快速分型5种DEC的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对DEC的8段特征性毒力基因pic、aggR、lt、st、stx 1、stx2、escV、invE及大肠埃希氏菌属特异性基因uidA设计LAMP引物,优化反应体系,并对方法的分析性能及临床菌株分型效果进行了评价。结果显示,所建立的方法对pic和escV的检出限是1 ng/μL,对aggR、stx 1、invE和uidA的检出限是100 pg/μL,对lt、st和stx 2的检出限是10 pg/μL,该方法灵敏度与特异度均为100%,DEC型别间无交叉反应,对临床菌株的分型与实际结果完全一致。方法快速简便、设备要求低,借助恒温荧光读取设备可在40 min内迅速判定待检菌株是否为DEC及其致病类型,可满足各机构现场快速检测的需求。 展开更多

关键词 致泻大肠埃希氏菌 实时荧光环介导等温扩增 快速检测 毒力基因 分型 食品安全

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恒温实时荧光法快速检测不同样品中的单增李斯特菌 被引量：5

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作者 张文敏 石育娇 +8 位作者 戚成 田明胜 朱智 殷荣永 钟少水 王大鹏 何更生 冯元琦 董庆利 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期44-50,共7页

为实现乳制品中、临床病人腹泻物中单增李斯特菌的快速检测,选用外引物F3和B3、内引物FIP和BIP作为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,采用便携式荧光恒温扩增仪作为检测平台,选取单增李斯特菌... 为实现乳制品中、临床病人腹泻物中单增李斯特菌的快速检测,选用外引物F3和B3、内引物FIP和BIP作为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,采用便携式荧光恒温扩增仪作为检测平台,选取单增李斯特菌标准菌株进行基因组DNA灵敏度和最低检测限测定;选用人工污染的15份乳制品样品和20份腹泻样品进行适用性实验;以上样品同时利用国标法GB4789.30-2010进行菌落计数。结果表明:恒温实时荧光法对纯培养的单增李斯特菌基因组DNA、乳制品和腹泻样品中的单增李斯特菌基因组DNA灵敏度均达到10~2CFU/mL、检测限均达到10~3 CFU/mL;阴性样本出现假阳性的概率分别为0、0.03%和0;单增李斯特菌污染浓度在检出限以上的阳性样本检出率分别为100%、99%和92%。研究表明恒温实时荧光法的检测结果与传统国标培养结果基本一致,恒温实时荧光法适用于乳制品中和临床腹泻样本中单增李斯特菌的快速检测。 展开更多

关键词 恒温实时荧光法 快速检测 单增李斯特菌

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新城疫病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立 被引量：7

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作者 陈兵 胡运发 +12 位作者 孙洁 陈书琨 刘建利 曾少灵 曹琛福 张彩虹 阮周曦 林庆燕 吕建强 杨俊兴 花群义 卢体康 秦智锋 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第7期11-14,共4页

新城疫是影响家禽养殖业的重大动物疫病,建立现场快速分子学检测方法是其防控关键。借助热裂解法抽提病毒RNA,在筛选出最佳核酸染料Calcein的基础上,建立新城疫病毒(NDV)实时荧光反转录环介导等温扩增(rRT-LAMP)检测法,并对该法进行特... 新城疫是影响家禽养殖业的重大动物疫病,建立现场快速分子学检测方法是其防控关键。借助热裂解法抽提病毒RNA,在筛选出最佳核酸染料Calcein的基础上,建立新城疫病毒(NDV)实时荧光反转录环介导等温扩增(rRT-LAMP)检测法,并对该法进行特异性、敏感性及准确性分析。试验结果显示,本试验所建立的NDV-rRT-LAMP方法可有效鉴别NDV,其敏感性可检测至50个基因拷贝,与国家标准实时荧光定量RT-PCR检测法一致;该法特异性强,与AIV、IBV等常见禽呼吸道传染病病原无交叉反应。小规模田间试验显示,该法用于NDV的普查监测,结果可靠。结果表明,建立的NDV-rRT-LAMP检测法可满足NDV现场快速分子检测需求。 展开更多

关键词 新城疫病毒 实时荧光反转录环介导等温扩增 现场检测

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实时荧光HDA法快速检测单核细胞增生李斯特菌 被引量：4

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作者 张明如 饶丽 +3 位作者 王建光 结莉 丁洪流 沈晓芳 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第10期206-210,共5页

目的:建立一种用于单核细胞增生李斯特菌的实时荧光赖解旋酶恒温核酸扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计引物对,基于荧光定量聚合酶链式反应(polym... 目的:建立一种用于单核细胞增生李斯特菌的实时荧光赖解旋酶恒温核酸扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计引物对,基于荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪的平台,提取单核细胞增生李斯特菌基因组DNA,以此作为模板,优化反应温度、反应时间及引物浓度。利用单核细胞增生李斯特菌及10株对照菌株,并与实时荧光PCR对比,来验证实时荧光HDA方法的特异性和灵敏度,并初步用于样品检测。结果:实时荧光HDA体系的最适引物浓度为0.075μmol/L,反应温度及反应时间为65℃、80 min(40个循环),具有良好的特异性和灵敏度。结论:建立了一种特异性强、灵敏度高的实时荧光HDA检测单核细胞增生李斯特菌的方法。 展开更多

关键词 单核细胞增生李斯菌 hly基因 赖解旋酶恒温扩增 实时荧光HDA 快速检测

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牛源性成分LAMP检测方法的建立 被引量：14

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作者 徐淑菲 孔繁德 +3 位作者 苗丽 蔡振鸿 林振基 赵冉 《中国动物检疫》 CAS 2016年第12期94-99,共6页

根据牛cytB基因设计3对特异性引物,运用GenieⅡ等温扩增荧光检测系统,以环介导等温扩增(LAMP)荧光检测方法为基础,建立了牛源性成分LAMP检测方法,并对该方法进行了反应体系和条件的优化。试验结果表明:该方法操作简单、特异性好;灵敏度... 根据牛cytB基因设计3对特异性引物,运用GenieⅡ等温扩增荧光检测系统,以环介导等温扩增(LAMP)荧光检测方法为基础,建立了牛源性成分LAMP检测方法,并对该方法进行了反应体系和条件的优化。试验结果表明:该方法操作简单、特异性好;灵敏度比普通PCR方法高100倍,达到5.408×10^(-2)μg/μL;反应时间短,最快的10分钟内即可完成反应。 展开更多

关键词 牛源性成分 环介导等温扩增法 特异性引物 等温扩增荧光检测系统

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3种单增李斯特氏菌快速检测方法的比较 被引量：4

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作者 周阳 祝长青 +8 位作者 郭桂萍 徐幸莲 徐宝才 薛建丽 蒋原 杨军 郭云昌 刘秀梅 付瑞燕 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2014年第8期119-124,共6页

【目的】确定适用于不同条件下快速检测单增李斯特氏菌的方法。【方法】以单增李斯特氏菌标准菌株CMCC54004和市售盐水鸭、凉拌菜为研究对象,按照国家食品安全标准(GB 4789.30-2010)对检测样品进行选择性增菌培养,选择阴性样品进行人工... 【目的】确定适用于不同条件下快速检测单增李斯特氏菌的方法。【方法】以单增李斯特氏菌标准菌株CMCC54004和市售盐水鸭、凉拌菜为研究对象,按照国家食品安全标准(GB 4789.30-2010)对检测样品进行选择性增菌培养,选择阴性样品进行人工布菌,比较单增李斯特氏菌蛋白条检测法、CPA恒温扩增法以及实时荧光PCR方法的检测效果,并以传统平板分离法进行验证。【结果】蛋白条检测法操作简单但灵敏度低,最低检测限为106cfu/mL;实时荧光PCR方法灵敏度高,最低检测限为101 cfu/mL,但操作繁琐,对操作技术及实验室条件要求较高;CPA恒温扩增方法灵敏度相对较高,最低检测限为105 cfu/mL,操作相对简单。【结论】实时荧光PCR方法适合灵敏度要求高、且具备良好实验条件时使用;CPA恒温扩增法适于对灵敏度要求不高、实验室条件简单的基层实验室使用。 展开更多

关键词 单增李斯特氏菌 检测方法比较 蛋白条检测法 CPA恒温扩增法 实时荧光PCR方法

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传染性造血器官坏死病毒的新型环介导等温扩增(LAMP)荧光检测技术 被引量：8

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作者 何俊强 史秀杰 +6 位作者 卢体康 贾鹏 郑晓聪 于力 兰文升 王津津 刘荭 《中国动物检疫》 CAS 2014年第6期68-73,共6页

本研究建立了一种检测传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的新型荧光环介导等温扩增法,为实验室及现场检测IHNV提供特异性强、灵敏度高、快速、能实时观察扩增荧光信号的检测技术。针对IHNV全基因组序列设计了一组6条LAMP特异性引物,对4株... 本研究建立了一种检测传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的新型荧光环介导等温扩增法,为实验室及现场检测IHNV提供特异性强、灵敏度高、快速、能实时观察扩增荧光信号的检测技术。针对IHNV全基因组序列设计了一组6条LAMP特异性引物,对4株不同来源的IHNV和8株不同的病毒进行特异性实验和灵敏度实验,结果表明该方法具有高度特异性,检测灵敏度可达3.64×10^-7μg/μL,比常规RT-PCR高1000倍,与荧光RT-PCR方法相当。通过环介导等温扩增技术（LAMP）和荧光检测技术相结合,使其检测时间能缩短至15～20分钟内完成检测,并可杜绝由于开盖加染料而导致的假阳性率偏高问题,在鱼病快速检测上具有重要意义。 展开更多

关键词 传染性造血器官坏死病毒(IHNV) 环介导等温扩增(LAMP) 荧光检测

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恒温实时荧光法快速检测简单异尖线虫方法的建立 被引量：3

9

作者 张森 邓艳 +5 位作者 黄燕琼 何淑华 戴金 赵尚志 石磊 柏建山 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2016年第24期53-57,共5页

为了快速鉴定简单异尖线虫,本研究建立了一套检测简单异尖线虫DNA的恒温实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,根据LAMP方法原理,针对简单异尖线虫ITS2区域设计引物特异性识别靶标基因。进行了特... 为了快速鉴定简单异尖线虫,本研究建立了一套检测简单异尖线虫DNA的恒温实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,根据LAMP方法原理,针对简单异尖线虫ITS2区域设计引物特异性识别靶标基因。进行了特异性、灵敏度、重复性和实际样品的测试,并与传统的PCR方法进行比较。结果表明,该方法能够特异性扩增简单异尖线虫DNA,对含有简单异尖线虫ITS2目的基因片段的质粒DNA检测限为1 fg/μL,灵敏度比传统的PCR方法高100倍,重复性良好,对实际样品进行检测,与传统的PCR测序方法结果相符。本研究建立的恒温实时荧光快速检测方法适用于特异性检测简单异尖线虫。 展开更多

关键词 恒温实时荧光法 简单异尖线虫 快速检测

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金属离子指示剂介导的核酸扩增技术检测食品中的副溶血弧菌

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作者 王丽 钟青萍 李月 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期407-410,共4页

建立了金属离子指示剂介导的核酸扩增技术用于水产品中副溶血弧菌的检测,同时将检测结果与PCR方法进行比较。结果表明,金属离子指示剂介导的核酸扩增技术能够在恒温65℃、60min内完成对副溶血弧菌tlh基因的特异性检测,检出限达到1.35CFU... 建立了金属离子指示剂介导的核酸扩增技术用于水产品中副溶血弧菌的检测,同时将检测结果与PCR方法进行比较。结果表明,金属离子指示剂介导的核酸扩增技术能够在恒温65℃、60min内完成对副溶血弧菌tlh基因的特异性检测,检出限达到1.35CFU/mL,是PCR检测限的10倍;阳性检测结果呈亮绿色,明显区别于阴性橘黄色,通过目视颜色的改变即可判断;检测48份样品过程中,金属离子指示剂介导核酸扩增方法检出45份,PCR方法检出34份阳性样品,灵敏度分别为93.8%和70.8%,阴性预测率分别为76.9%和41.7%。金属离子指示剂介导恒核酸扩增法具有高效、高特异性、高灵敏度特性,可满足实地检测需要。 展开更多

关键词 金属离子指示剂 核酸扩增 副溶血弧菌 检测

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实时荧光环介导等温扩增技术检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌 被引量：25

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作者 贾雅菁 付博宇 +4 位作者 王羽 马晓燕 张先舟 苑宁 张伟 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第6期184-189,共6页

建立牛乳中蜡样芽孢杆菌便捷可靠的检测方法,根据已公布的蜡样芽孢杆菌hbl A基因序列设计内外引物,并向反应体系中加入荧光染料SYBRGreenⅠ,利用实时荧光监测仪,建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated i... 建立牛乳中蜡样芽孢杆菌便捷可靠的检测方法,根据已公布的蜡样芽孢杆菌hbl A基因序列设计内外引物,并向反应体系中加入荧光染料SYBRGreenⅠ,利用实时荧光监测仪,建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,Real Amp)检测蜡样芽孢杆菌的方法,扩增产物经电泳和酶切鉴定。通过21株致病菌验证RealAmp特异性,并比较了Real Amp与普通环介导等温扩增技术的敏感性,对人工污染的检出限进行了测定。结果表明对21 株致病菌进行特异性实验,4株蜡样芽胞杆菌呈阳性结果,17株非蜡样芽胞杆菌均呈阴性结果。RealAmp检测纯菌的灵敏度为8.2 CFU/m L,比普通环介导等温扩增技术的灵敏度高10倍,人工污染牛乳RealAmp的检出限为8.2 CFU/m L。并且在20 min左右即可判定结果。该方法快速、准确、灵敏度高、操作便捷、可实时监控检测蜡样芽孢杆菌,有望成为快速检测蜡样芽孢杆菌的有效方法。 展开更多

关键词 实时荧光环介导等温扩增检测技术 蜡样芽胞杆菌 检测 牛乳

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斑点叉尾鮰病毒实时荧光LAMP检测方法的建立 被引量：3

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作者 郝凯 刘洪岩 +4 位作者 陈校辉 袁军法 李莉娟 边文冀 赵哲 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期541-546,共6页

斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus, CCV)属于大DNA病毒,是一种能引起斑点叉尾鮰(Letalurus punetaus)病毒性疾病的重要病原。研究以编码产物为磷酸激酶的CCV ORF77基因为靶标,设计了能识别靶基因上的8个独立区域的6条特异引物,利... 斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus, CCV)属于大DNA病毒,是一种能引起斑点叉尾鮰(Letalurus punetaus)病毒性疾病的重要病原。研究以编码产物为磷酸激酶的CCV ORF77基因为靶标,设计了能识别靶基因上的8个独立区域的6条特异引物,利用基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立了用于CCV的实时荧光LAMP快速检测方法。结果显示,建立的实时荧光LAMP检测方法在63℃恒温反应45min条件下,反应大约12min后出现明显的峰值,最低检测限度为100个拷贝的病毒质粒DNA,检出时间为35min;并且具有良好的特异性,与白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)等常见水生动物病原DNA均没有交叉反应;同一样品于试验内及试验间重复性试验发现,20个平行样品的扩增曲线基本重合,表现出良好的重复性。通过对实际样品的检测结果显示,实时荧光LAMP检测方法能够特异性的检出CCV。因此,研究建立的CCV实时荧光LAMP检测方法操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高、结果可靠,能为斑点叉尾鮰养殖现场和实验室的斑点叉尾鮰疱疹病毒病病原的快速诊断和实时监测方面提供技术支撑。 展开更多

关键词 斑点叉尾鮰病毒 环介导等温扩增技术 实时荧光LAMP 快速诊断

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荧光环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)技术在病毒性出血性败血症(VHS)诊断中的应用 被引量：10

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作者 安元龙 吴斌 +1 位作者 林长军 肇慧君 《中国动物检疫》 CAS 2012年第12期23-25,38,共4页

运用GenieII实时荧光等温扩增检测系统,以LAMP法荧光检测为基础,建立了对病毒性出血性败血症病毒进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法。根据对VHSV病毒N基因序列的分析,针对病毒的高保守区域的6个特异性序列,设计了3对特异性引物... 运用GenieII实时荧光等温扩增检测系统,以LAMP法荧光检测为基础,建立了对病毒性出血性败血症病毒进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法。根据对VHSV病毒N基因序列的分析,针对病毒的高保守区域的6个特异性序列,设计了3对特异性引物,同时加入dsDNA混合染料,对核酸扩增过程进行实时荧光监控。该方法的特异性良好,与其他鱼类弹状病毒无交叉反应。敏感度高,检测限为20fgRNA模板。实验结果表明该方法是一种操作简单、快速高效、高特异性高灵敏度的病毒检测方法。 展开更多

关键词 病毒性出血性败血症病毒 荧光逆转录LAMP法 诊断

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基于恒温指数扩增反应高灵敏度检测端粒酶活性

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作者 周晓毓 张佳玉 +1 位作者 周曼 贾红霞 《河北大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2016年第2期155-161,共7页

端粒酶延伸产物是具有(ggttag)n重复序列的DNA.设计1条与2个重复序列相匹配的特异性的DNA探针-(ctaacc)2使其与端粒酶延伸产物杂交,形成双链DNA.过量的DNA探针被磁性石墨烯吸附,通过磁分离去除.利用恒温指数扩增反应(IEXPAR)对端粒酶延... 端粒酶延伸产物是具有(ggttag)n重复序列的DNA.设计1条与2个重复序列相匹配的特异性的DNA探针-(ctaacc)2使其与端粒酶延伸产物杂交,形成双链DNA.过量的DNA探针被磁性石墨烯吸附,通过磁分离去除.利用恒温指数扩增反应(IEXPAR)对端粒酶延伸产物捕捉的DNA探针进行快速的扩增.用与双链DNA特异性结合的SYBR Green I染料对扩增产物进行实时荧光检测.在优化条件下,可以检测到低至50个癌细胞中的端粒酶活性.实现了恒温扩增条件下端粒酶活性的高灵敏度检测. 展开更多

关键词 端粒酶活性 恒温指数扩增反应 磁性石墨烯 实时荧光检测

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贝类奥尔森派琴虫可视化LAMP检测技术的建立与应用 被引量：3

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作者 庞耀珊 谢芝勋 +5 位作者 谢丽基 谢志勤 邓显文 刘加波 彭宜 范晴 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第1期302-305,F0003,共5页

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建... 根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg。用该项LAMP技术与OIE公布的派琴虫PCR检测技术分别对50份分别来自华东及华南沿海地区的牡蛎样品进行检测,同时对PCR阳性样品进行测序分析。结果 LAMP检测到2份奥尔森派琴虫,PCR方法检测到9份派琴虫。测序分析结果表明,PCR方法检测到的9份派琴虫阳性样品中有2份为奥尔森派琴虫,其结果与LAMP检测结果相符,说明该技术适用于贝类样品奥尔森派琴虫的检测。 展开更多

关键词 派琴虫 贝类 LAMP 荧光反应 检测

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香蕉细菌性枯萎病菌荧光LAMP检测体系的建立 被引量：5

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作者 杨雷亮 管维 +4 位作者 孙丽霞 吴颖儿 单振菊 王章根 陈定虎 《广东农业科学》 CAS 2020年第5期66-73,共8页

【目的】基于香蕉细菌性枯萎病病原(Ralstonia solanacearum)2号生理小种的特异保守引物和LAMP技术建立一种实时荧光定性检测方法,解决常规PCR定性检测特异性低、灵敏度低、耗时长等问题,实现在1 h内能进行准确高效的定性检测,为加强该... 【目的】基于香蕉细菌性枯萎病病原(Ralstonia solanacearum)2号生理小种的特异保守引物和LAMP技术建立一种实时荧光定性检测方法,解决常规PCR定性检测特异性低、灵敏度低、耗时长等问题,实现在1 h内能进行准确高效的定性检测,为加强该病害防控检测和检疫工作提供技术支持。【方法】确定被测基因靶序列,利用Primer软件设计两对内外引物。由两对引物、具有链置换特性的DNA聚合酶、模板DNA、甜菜碱、Mg2SO4、反应缓冲液、荧光染料等组成LAMP反应体系,采用不必在反应完开管盖检测的实时荧光LAMP方法,针对该方法对于样品DNA定性检测的灵敏度、特异性及可重复性进行试验。【结果】设计的引物能顺利扩增目标基因,实时荧光LAMP检测体系对于香蕉细菌性枯萎病病原生理2号小种有良好的灵敏度、特异性,该方法可重复性强,灵敏度比普通PCR高10倍以上。【结论】香蕉细菌性枯萎病菌荧光LAMP检测体系检测特异性强、灵敏度高、耗时短、不易污染,效果较好。 展开更多

关键词 香蕉枯萎病 细菌 青枯菌 检测 环介导等温扩增(LAMP) 实时荧光

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基于非对称杂交诱导的恒温指数扩增策略用于microRNA高灵敏检测

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作者 刘引霞 彭晶 +5 位作者 刘思敏 邹旗霞 张璐茵 邱子玥 谢宝平 陈俊 《分析测试学报》 2025年第11期2391-2396,共6页

传统指数扩增中,目标核酸与对称扩增模板的两端能量相同,然而,当目标核酸与模板5’端杂交时扩增将难以触发,限制了方法对痕量目标核酸的分析。该文发展了一个非对称杂交诱导的恒温指数扩增(AEXPRA)策略用于microRNA的高灵敏、快速分析。... 传统指数扩增中,目标核酸与对称扩增模板的两端能量相同,然而,当目标核酸与模板5’端杂交时扩增将难以触发,限制了方法对痕量目标核酸的分析。该文发展了一个非对称杂交诱导的恒温指数扩增(AEXPRA)策略用于microRNA的高灵敏、快速分析。以miR-196b为靶标,基于设计的非对称扩增模板,由于目标物与扩增模板3’端完全互补但与模板5’端部分互补,miR-196b能够完全杂交到扩增模板的3’端。方法具有灵敏度高、特异性强以及速度快的优势。该策略整个反应时间在30 min以内,可检测低至0.42 amol/L的miR-196b。为了验证方法的实用性,将其用于血清提取物中miR-196b的分析,方法可有效区分非小细胞癌患者和正常人血清中miR-196b的表达,结果与实时定量PCR(RT-qPCR)一致。该法具有高准确度和可靠性,有望在miRNA的临床诊断和病理研究中发挥重要作用。 展开更多

关键词 恒温指数扩增 微小核糖核酸 荧光检测 疾病诊断

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等温链置换扩增反应/CRISPR-Cas12a系统结合反向荧光增强试纸条检测唾液中microRNA-31的研究

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作者 王佳讯 徐一 +1 位作者 赵爽 宫晓群 《分析测试学报》 2025年第11期2346-2353,共8页

构建了基于核酸等温链置换扩增反应(ISDA)及CRISPR-Cas12a系统协同放大检测microRNA-31(miRNA-31)的方法,以反向荧光增强试纸条(rLFTS)为信号展示平台,实现可视化检测。通过优化ISDA反应的引物序列设计及反应缓冲液,实现了miRNA-31特异... 构建了基于核酸等温链置换扩增反应(ISDA)及CRISPR-Cas12a系统协同放大检测microRNA-31(miRNA-31)的方法,以反向荧光增强试纸条(rLFTS)为信号展示平台,实现可视化检测。通过优化ISDA反应的引物序列设计及反应缓冲液,实现了miRNA-31特异性识别和第一次信号放大,输出双链DNA产物并激活CRISPR-Cas12a切割游离单链DNA(ssDNA)报告分子的反式切割活性,同时阻碍金纳米探针通过结合ssD⁃NA与检测线上的Cy5荧光探针形成夹心结构,进而恢复Cy5荧光,以此作为定量信号,实现了对miRNA-31的高灵敏和高特异性检测。该方法对唾液样本中miRNA-31的检出限低至57.9 amol/L,加标回收率为91.6%~111%,检测结果与定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)定量结果具有良好的一致性,且检测时间仅需90 min。实验结果表明该方法具有操作简单、灵敏度高、检测时间短等优点,能够满足对唾液样本中miR⁃NA-31的超灵敏检测需求。 展开更多

关键词 等温链置换扩增 CRISPR-Cas12a 反向荧光增强试纸条 miRNA-31 核酸检测

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