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利用qRT-PCR技术对PVY重组株系的鉴定 被引量:4
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作者 尚慧 韩树鑫 +6 位作者 高艳玲 张威 范国权 申宇 聂先舟 吕文河 白艳菊 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第2期238-244,共7页
【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)作为制约马铃薯生产的重要病毒之一,株系分化繁杂。近年被科学家研究分离的PVY^(N-Wi)和PVY^(NTN-NW)株系而言,其基因组结构极为相似但致病性差异较大。【方法】本研究利用qRT-PCR方法,方便快... 【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)作为制约马铃薯生产的重要病毒之一,株系分化繁杂。近年被科学家研究分离的PVY^(N-Wi)和PVY^(NTN-NW)株系而言,其基因组结构极为相似但致病性差异较大。【方法】本研究利用qRT-PCR方法,方便快捷的检测出马铃薯Y病毒的这2种不同株系,同时并使之可成功且稳定的应用于马铃薯生产中。通过查找Gen Bank已公布的PVY^(N-Wi)和PVY^(NTN-NW)株系的全基因组序列,设计用于qRT-PCR检测,扩增目的片段大小为150 bp左右的特异性引物,应用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)进行检测。【结果】通过设计的引物对保存的试管苗毒源进行检测,可以成功的精准鉴别出PVY^(N-Wi)和PVY^(NTN-NW)株系;同时对100份田间采集的叶片样品进行检测,成功的检测出100份样品中32份样品,受到PVY^(N-Wi)株系侵染;27份样品,受到PVY^(NTN-NW)株系侵染;同时存在9份样品,可能同时受到PVY^(N-Wi)、PVY^(NTN-NW)株系的侵染。【结论】实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)可适用于马铃薯叶片样品的检测,为株系的快速鉴定提供了可靠的方法,可用于生产中大规模样品的检测,有利于及时采取防控措施,降低损失。 展开更多
关键词 马铃薯Y病毒(PVY) 株系分化 实时荧光定量pcr技术(qrt-pcr)
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黄花大苞姜花药发育qRT-PCR内参基因筛选 被引量:2
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作者 张俊平 王英强 《广西植物》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期76-83,共8页
qRT-PCR技术具有定量准确、灵敏度高、重复性好等特点,被广泛用于基因表达分析。内参基因的稳定性对于准确分析实验结果非常重要。该研究以黄花大苞姜(Caulokaempferia coenobialis)花粉母细胞时期(PMC)、四分体时期(TET)、成熟花粉时期... qRT-PCR技术具有定量准确、灵敏度高、重复性好等特点,被广泛用于基因表达分析。内参基因的稳定性对于准确分析实验结果非常重要。该研究以黄花大苞姜(Caulokaempferia coenobialis)花粉母细胞时期(PMC)、四分体时期(TET)、成熟花粉时期(MP)的花药组织为材料,基于3个阶段花药转录组表达谱数据以及常用传统内参基因,筛选出Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、Malate dehydrogenase(MDH)、α-tubulin3(TUA3)、β-tubulin7(TUB7)和Actin6(ACT6)作为候选内参基因,进行qRT-PCR分析;并运用BestKeeper、geNorm和Normfinder软件综合分析5个候选内参基因在黄花大苞姜花药发育过程中的表达稳定性。结果表明:MDH和TUB7的表达最稳定,ACT6的稳定性最差;分别以MDH和TUB7作为内参,分析GBE1在黄花大苞姜花药发育中的表达模式,并与该基因在花药转录组中的表达模式做相关系数分析,3种表达模式结果一致,进一步验证了MDH和TUB7的表达稳定性。这说明MDH和TUB7适合作为qRTPCR分析黄花大苞姜花药发育过程中相关基因表达模式的内参基因。该研究结果为黄花大苞姜花药发育分子机制相关研究奠定了基础,也为姜科花药发育相关内参基因的选择提供了参考。 展开更多
关键词 黄花大苞姜 花药 内参基因 qrt-pcr BestKeeper GENORM NORMFINDER
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藜科植物藜和灰绿藜实时荧光定量PCR内参基因的选择 被引量:8
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作者 刘艳霞 兰欣欣 +2 位作者 曹婧 张晶华 兰海燕 《广西植物》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1511-1518,1459,共9页
选择合适的内参基因是实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究的关键,目前对藜科耐盐(盐生)植物胁迫相关基因的表达分析中所用内参基因的报道较为有限。该研究利用Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3个内参基因分析软件,对已选择过的β-TUBULI... 选择合适的内参基因是实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究的关键,目前对藜科耐盐(盐生)植物胁迫相关基因的表达分析中所用内参基因的报道较为有限。该研究利用Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3个内参基因分析软件,对已选择过的β-TUBULIN、β-ACTIN、GAPDH 3个常用候选内参基因进行了比较分析,筛选出在Na Cl和PEG胁迫下藜和灰绿藜中表达相对稳定的内参基因。结果表明:Ge Norm、Norm Finder内参软件分析在Na Cl和PEG胁迫下,GAPDH是藜和灰绿藜中均共同稳定表达的内参基因,同时在藜和灰绿藜中也有各自表达较稳定的内参基因,β-ACTIN在藜中稳定表达,β-TUBULIN则在灰绿藜中稳定表达。对相同科不同种的植物内参基因表达差异进行比较,内参基因在相同科中具有相同稳定表达的内参;对相同胁迫下两种不同植物内参基因表达稳定性进行分析,内参基因的选择需根据实际的实验材料和实验条件而定。基于3个分析软件对以上3个常用内参基因的分析结果,初步确定了在藜科植物藜和灰绿藜中相对稳定的内参基因,为藜和灰绿藜胁迫相关基因的定量表达分析提供了参考依据。 展开更多
关键词 灰绿藜 实时荧光定量pcr 内参基因 胁迫
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东方泽泻实时荧光定量PCR内参基因的筛选及AoSS基因的组织表达特性分析 被引量:4
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作者 刘青芝 谷巍 +5 位作者 孙云飞 吴启南 巢建国 桑晓华 王小浩 刘琪 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期1467-1475,共9页
【目的】筛选适用于东方泽泻实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的内参基因,并分析其鲨烯合酶基因(AoSS)的表达特性,为后续研究东方泽泻原萜烷型三萜生物合成调控及诱导机制打下基础。【方法】从东方泽泻转录组中选取内参基因18S rRNA、EF1α、GA... 【目的】筛选适用于东方泽泻实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的内参基因,并分析其鲨烯合酶基因(AoSS)的表达特性,为后续研究东方泽泻原萜烷型三萜生物合成调控及诱导机制打下基础。【方法】从东方泽泻转录组中选取内参基因18S rRNA、EF1α、GAPDH、ACT、UBQ和UBC,应用qRT-PCR检测其在不同组织和激素处理下的表达情况,并借助Delta CT、GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder对其表达稳定性进行分析评价。以筛选到的内参基因分析AoSS基因在不同组织中的表达情况。【结果】18S r RNA、GAPDH和EF1α基因在东方泽泻不同组织的表达稳定性较高,但18S rRNA、UBC和EF1α基因在不同激素处理下的表达稳定性均较高。以18S rRNA、GAPDH和EF1α基因为内参分析AoSS基因在东方泽泻不同组织中的表达量情况,结果显示,AoSS基因在东方泽泻不同组织中均有表达,其表达情况基本一致,均在东方泽泻块茎中表达量最高,其次是叶柄和叶,而在根中表达量最低。【结论】18S rRNA、GAPDH和EF1α基因是研究东方泽泻不同组织中基因表达分析的首选内参基因;18S rRNA、EF1α和UBC基因是研究激素处理下基因表达的首选内参基因。AoSS基因的表达具有组织特异性,其可能在东方泽泻的生长发育中发挥重要的调控功能。 展开更多
关键词 东方泽泻 内参基因 鲨烯合酶(SS) 实时荧光定量pcr(qrt-pcr) 表达特性
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小麦根际土壤中禾谷多黏菌实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用 被引量:2
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作者 王燕霞 吴季荣 +4 位作者 俞明正 赵晶晶 邢宇俊 徐剑宏 史建荣 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第5期962-966,共5页
为了研究转基因小麦N12-1对其根际土壤中禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)数量的影响,建立了基于实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)方法检测多黏菌数量的体系,并将该体系用于转基因小麦N12-1及其受体扬麦158不同生长期根际土... 为了研究转基因小麦N12-1对其根际土壤中禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)数量的影响,建立了基于实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)方法检测多黏菌数量的体系,并将该体系用于转基因小麦N12-1及其受体扬麦158不同生长期根际土壤中禾谷多黏菌数量的检测。结果显示,标准曲线的扩增效率为95%,相关系数为0.999,熔解曲线呈现单一峰,符合荧光定量扩增的各项指标;在各个生长期,转基因小麦N12-1与其受体扬麦158根际土壤中的禾谷多黏菌数量没有显著差异。由此推测,转基因小麦N12-1的种植对其根际土壤中禾谷多黏菌的数量没有显著影响。 展开更多
关键词 禾谷多黏菌 实时荧光定量pcr 转基因小麦
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荧光定量PCR方法及分子标志物在海洋污染监测中的应用进展 被引量:3
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作者 车志群 莫祖英 +1 位作者 孙仁杰 阎冰 《生态科学》 CSCD 2015年第5期233-240,共8页
荧光定量PCR作为一种核酸定量技术,可在PCR扩增时在体系中加入荧光染料或荧光基团,实时监测荧光信号从而对PCR扩增产物进行实时准确定量,技术灵敏度高,特异性强。通过对荧光定量PCR的原理、分类、优缺点及几种定量分析方法对比进行简述... 荧光定量PCR作为一种核酸定量技术,可在PCR扩增时在体系中加入荧光染料或荧光基团,实时监测荧光信号从而对PCR扩增产物进行实时准确定量,技术灵敏度高,特异性强。通过对荧光定量PCR的原理、分类、优缺点及几种定量分析方法对比进行简述,并对其在国内外海洋环境污染监测中的广泛应用和研究进行了全面综述,从而对荧光定量PCR和分子标志物在海洋监测中的应用前景做进一步的展望。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 定量分析方法 分子生标志物 海洋污染监测
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实时荧光定量PCR检测宫颈癌组织中HGF mRNA和c-Met mRNA的表达 被引量:2
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作者 张咏梅 张雪玉 +2 位作者 刘莉莉 吴蔚 马文娟 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期234-237,共4页
目的检测宫颈癌组织中肝细胞生长因子(HGF)及其受体原癌基因c-Met的分子表达水平,并探讨其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术检测43例宫颈癌,30例宫颈上皮内瘤变Ⅲ和27例正常宫颈组织标本中HGF和c-Met的分子表达水平。结... 目的检测宫颈癌组织中肝细胞生长因子(HGF)及其受体原癌基因c-Met的分子表达水平,并探讨其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术检测43例宫颈癌,30例宫颈上皮内瘤变Ⅲ和27例正常宫颈组织标本中HGF和c-Met的分子表达水平。结果 HGF mRNA和c-Met mRNA在宫颈癌组织中均呈高表达,其与宫颈癌患者临床分期、肿瘤直径大小、浸润深度、淋巴结转移有关(P均<0.05),而与肿瘤的分化程度无关(P>0.05)。HGF mRNA和c-Met mRNA之间存在正相关(r=0.666,P<0.01)。结论 QRT-PCR技术可对宫颈癌组织中的HGF mRNA和c-Met mRNA表达进行定量检测;HGF mRNA和c-Met mRNA的高表达与宫颈癌的侵袭转移有关。两者联合监测有利于早期诊断宫颈癌,为宫颈癌的治疗和预后提供参考。 展开更多
关键词 宫颈癌 肝细胞生长因子 原癌基因C-MET 实时荧光定量pcr
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竹林金针虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选与应用 被引量:1
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作者 叶碧欢 陈友吾 +4 位作者 舒金平 张威 张亚波 李海波 宋其岩 《浙江农林大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期644-651,共8页
【目的】筛选平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense侵染条件下筛胸梳爪叩甲Melanotus cribricollis幼虫稳定表达的内参基因,为该竹林金针虫相关基因的表达研究奠定基础。【方法】基于筛胸梳爪叩甲幼虫的转录组数据,利用实时荧光定量PCR扩... 【目的】筛选平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense侵染条件下筛胸梳爪叩甲Melanotus cribricollis幼虫稳定表达的内参基因,为该竹林金针虫相关基因的表达研究奠定基础。【方法】基于筛胸梳爪叩甲幼虫的转录组数据,利用实时荧光定量PCR扩增特异性引物,分析相关性和扩增效率;利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评估筛选出6个候选内参基因(β-actin、GAPDH、α-tubulin、RPL13α、RPS3、RPS27a),并验证其表达稳定性。【结果】GeNorm分析结果显示:PRS27a和RPS3的表达最稳定,随后依次是α-tubulin、RPL13α、β-actin和GAPDH;最适合的内参基因数目为2。NormFinder分析结果显示:RPL13α的表达最稳定,随后依次是α-tubulin、RPS3、RPS27a、β-actin和GAPDH。BestKeeper分析结果显示:β-actin和GAPDH的P>0.5,不适合作为本试验条件下的内参基因。不同软件分析得出的候选内参排序存在一定差异。综合分析和表达稳定性验证表明PRS27a或RPS3是最佳内参基因,6个目的基因的表达水平变化趋势均基本一致。【结论】PRS27a和RPS3是研究平沙绿僵菌侵染的竹林金针虫相关基因表达的最佳内参基因。 展开更多
关键词 森林保护学 竹林金针虫 平沙绿僵菌 内参基因 实时荧光定量pcr
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不同浓度Cd2+胁迫下烟草实时荧光定量PCR内参基因的筛选 被引量:10
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作者 池俊玲 赵一博 +3 位作者 郭江波 张龙 刘汉阳 辛翠花 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期2133-2140,共8页
【目的】筛选出镉(Cd)胁迫下烟草的最佳内参基因,为后续研究与Cd^2+相关的功能性基因提供理论依据。【方法】分别以0、250和500 mg/L氯化镉(CdCl2)溶液对本生烟草进行胁迫处理,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同浓度Cd^2+胁迫处理... 【目的】筛选出镉(Cd)胁迫下烟草的最佳内参基因,为后续研究与Cd^2+相关的功能性基因提供理论依据。【方法】分别以0、250和500 mg/L氯化镉(CdCl2)溶液对本生烟草进行胁迫处理,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同浓度Cd^2+胁迫处理下肌动蛋白基因(ACT)、微管蛋白基因(TUB)、蛋白磷酸酶2基因(PP2A)、18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)及转录延伸因子基因(EF1a)6个候选内参基因的表达情况,并利用geNorm和Norm-Finder综合评价Ct各内参基因表达的稳定性。【结果】以不同浓度Cd^2+胁迫处理的本生烟草cDNA为模板均可PCR扩增出ACT、TUB、18S rRNA、PP2A、GAPDH和EF1a等6个内参基因。6个内参基因的qRT-PCR扩增曲线走势正常,平行性好,无引物二聚体和非特异性条带产生,且绘制的标准曲线上各点基本分布在一条直线上,扩增效率在要求范围(90.00%~105.00%)之内,符合下一步评价要求,且斜率的回归系数(R2)>0.9800,说明线性关系较好。GAPDH和EF1a基因的表达丰度较高,18S rRNA处于中等水平,ACT、TUB和PP2A基因的表达丰度较低。geNorm分析结果显示,6个内参基因的表达稳定性排序为EF1a基因>GAPDH基因>ACT基因>TUB基因>PP2A基因>18S rRNA;Norm-Finder分析结果显示,6个内参基因的表达稳定性排序为EF1a基因>TUB基因>GAPDH基因=PP2A基因>ACT基因>18S rRNA。【结论】EF1a基因在不同浓度Cd^2+胁迫处理下表达水平较高,稳定性最好,可作为Cd胁迫下本生烟草的最佳内参基因。 展开更多
关键词 烟草 镉胁迫 实时荧光定量pcr(qrt-pcr) 内参基因 筛选
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扩展青霉菌实时定量PCR内参基因挖掘与应用
10
作者 张真真 蒋礼玲 +3 位作者 李婉炘 王谨凡 贾举庆 黄胜雄 《合肥工业大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2023年第2期261-267,共7页
实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术因其高效且便捷的特点在基因表达检测中被广泛应用。实时定量PCR结果数据处理策略之一是使用内参基因进行基因表达数据的标准化。文章基于扩展青霉菌孢子不同生长阶段的RNA-... 实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术因其高效且便捷的特点在基因表达检测中被广泛应用。实时定量PCR结果数据处理策略之一是使用内参基因进行基因表达数据的标准化。文章基于扩展青霉菌孢子不同生长阶段的RNA-seq数据,挖掘和注释了694个稳定表达的候选内参基因;随机挑选出Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase在内的14个基因,以4、25℃条件下PDB培养基生长6、12、24、36 h的扩展青霉菌为材料,进行实时定量PCR实验。实时定量PCR数据基于geNorm和NormFinder 2种软件的综合分析,表明Isy1、Spt5、Nucb、Hp1适合作为内参基因。以Isy1和Spt5分别作为内参基因,检测Gh30基因在4、25℃条件下扩展青霉菌生长发育过程中的基因表达,显示出一致的基因表达水平,进一步验证了挖掘得到的内参基因的可靠性。该研究为扩展青霉菌的分子生物学研究提供了优良的内参基因,同时提供了一种高效的内参基因的挖掘和鉴定方法。 展开更多
关键词 内参基因 扩展青霉菌 RNA-seq数据 实时定量聚合酶链式反应(pcr) 稳定性
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三倍体虹鳟实时荧光定量PCR内参基因稳定性分析 被引量:2
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作者 苏晓燕 韩步鹰 +3 位作者 孟玉琼 白晓易 李长忠 马睿 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期35-43,共9页
采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、核糖体大亚基蛋白基因(rplp2)、真核延伸因子基因(ef1-α)、β-肌动蛋白(β-actin)和18S核糖体核酸基因(18S rRNA)等5个候选内参基因在体质量约800 g三倍体虹鳟脑、... 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、核糖体大亚基蛋白基因(rplp2)、真核延伸因子基因(ef1-α)、β-肌动蛋白(β-actin)和18S核糖体核酸基因(18S rRNA)等5个候选内参基因在体质量约800 g三倍体虹鳟脑、眼、鳃、皮肤、心脏、肾脏(头肾、中肾、后肾)、肝脏、脾脏、胃、幽门垂、肠(前肠、中肠、后肠)以及肌肉(红肌、白肌、肌间隔)等组织中的表达水平,通过内参基因表达的Ct值比较,并采用GeNorm、Best-Keeper、NormFinder 3种软件分析5个候选内参基因的表达稳定性。GeNorm分析显示,5个候选内参基因的平均表达稳定值(M)依次为β-actin=rplp2<ef1-α<18S rRNA<gapdh,其中β-actin和rplp2 M值最小,为1.42。Best-Keeper分析显示,5个候选内参基因的标准偏差依次为rplp2<ef1-α<β-actin<18S rRNA<gapdh,变异系数依次为rplp2<ef1-α<β-actin<gapdh<18S rRNA,其中rplp2标准偏差(0.92)和变异系数(3.94%)均最小。NormFinder分析显示,5个候选内参基因的平均表达稳定值依次为rplp2=β-actin<ef1-α<18S rRNA<gapdh,其中rplp2与β-actin稳定值最小(0.66)。综上所述,5个候选内参基因中rplp2与β-actin内参基因表达最稳定,建议rplp2与β-actin作为三倍体虹鳟实时荧光定量PCR分析的适宜内参基因。 展开更多
关键词 三倍体虹鳟 实时荧光定量pcr 内参基因
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离子交换色谱技术在大鼠粪便肠道菌群分析中的应用研究
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作者 陈灼娟 邱丹腾 +1 位作者 张海玲 刘树滔 《食品与生物技术学报》 北大核心 2025年第2期154-162,共9页
【目的】探究离子交换色谱技术作为大鼠粪便样本预处理方法的可行性。【方法】采集大鼠粪便样本后分别进行3种预处理:对照组(Con组)、离心分离预处理组(Cen组)和色谱分离预处理组(Chr组),比较不同预处理方法下样本的DNA提取质量、16S r... 【目的】探究离子交换色谱技术作为大鼠粪便样本预处理方法的可行性。【方法】采集大鼠粪便样本后分别进行3种预处理:对照组(Con组)、离心分离预处理组(Cen组)和色谱分离预处理组(Chr组),比较不同预处理方法下样本的DNA提取质量、16S rRNA扩增子高通量测序结果及特定菌群的实时荧光定量PCR结果的差异。【结果】Chr组样本提取的DNA质量浓度分别是Cen组和Con组的1.44倍和6.49倍;Con组样本的操作分类单元(OTUs)数量为2630个,而Cen组和Chr组分别增至3220个和3223个。α多样性分析和β多样性分析结果表明,Chr组样本具有更高的微生物多样性,且组内样本间相似度高、重现性好。实时荧光定量PCR结果表明,3组样品的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)丰度差异极显著:Chr组样本的青春双歧杆菌丰度最高,其次是Cen组,Con组最低;当菌悬液添加量从100μL增至200μL时,Con组的青春双歧杆菌丰度无显著差异(P>0.05),而Cen组和Chr组分别提升至1.32倍和1.70倍,这表明离子交换色谱能更好地保留粪便样本中的微生物。【结论】离子交换色谱作为大鼠粪便样本的预处理方法,能够显著提高肠道菌群分析的重现性和灵敏度。 展开更多
关键词 离子交换色谱 肠道菌群 高通量测序 微生物多样性 荧光定量pcr
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含尼帕病毒N基因和L基因的假病毒构建及其应用
13
作者 崔超杰 张慧 +7 位作者 刘春菊 魏荣 张永强 崔进 戈胜强 李金明 蔡玉梅 王志亮 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第7期56-62,共7页
尼帕病毒(NiV)作为高致死率的人兽共患病病原,受到世界各国广泛关注。为了获得快速灵敏的检测方法和安全稳定的阳性标准品,本试验将NiV N和L基因同时插入假病毒转移质粒PLJM-GFP中,与包装质粒共转染人胚胎肾(HEK293T)细胞,收集并浓缩病... 尼帕病毒(NiV)作为高致死率的人兽共患病病原,受到世界各国广泛关注。为了获得快速灵敏的检测方法和安全稳定的阳性标准品,本试验将NiV N和L基因同时插入假病毒转移质粒PLJM-GFP中,与包装质粒共转染人胚胎肾(HEK293T)细胞,收集并浓缩病毒液,测定转染后48和72 h收集的假病毒滴度,于透射电子显微镜下观察假病毒形态,并进行PCR扩增和测序鉴定。以世界动物卫生组织推荐的NiV检测引物对包装的假病毒进行验证,应用实时荧光定量PCR(q PCR)技术对不同标准和文献中的4对NiV检测引物进行特异性和敏感性分析,并对构建的NiV假病毒进行均一性试验、短期稳定性试验和抗RNase A降解试验。结果显示,转染后48和72 h收集的假病毒滴度分别可达2.72×10^(5)和3.47×10^(4)IU/m L,电子显微镜下假病毒呈圆形、有囊膜的颗粒。测序结果显示,NiV假病毒核酸中成功插入N和L基因片段;4对NiV检测引物特异性良好,均可用于NiV检测,其中,在研国家标准检测方法中引物的灵敏性更高,病毒的检测下限为10^(0)IU/m L;NiV假病毒均一性良好,可在4℃条件下稳定保存至少7 d,且能够抵抗一定量的RNase A降解。本试验成功包装含有NiV N基因和L基因的假病毒,并对其进行初步应用和稳定性研究,为尼帕病毒性脑炎的防控提供物质储备。 展开更多
关键词 尼帕病毒(NiV) 假病毒构建 实时荧光定量逆转录pcr(qrt-pcr) 敏感性试验
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基于转录组学研究宁乡猪肌肉的生长发育
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作者 张维 崔清明 +9 位作者 任慧波 陈晨 李华丽 胡雄贵 朱吉 杨仕柳 李述初 张四阳 彭英林 刘莹莹 《湖南农业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第2期80-88,共9页
分别选取3头1、60、120、180、240、300、360日龄(分别记为ND1、ND60、ND120、ND180、ND240、ND300、ND360)宁乡猪的背最长肌进行转录组测序分析,对9个比较组所筛选到的差异表达基因(DEGs)进行富集分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT–PCR... 分别选取3头1、60、120、180、240、300、360日龄(分别记为ND1、ND60、ND120、ND180、ND240、ND300、ND360)宁乡猪的背最长肌进行转录组测序分析,对9个比较组所筛选到的差异表达基因(DEGs)进行富集分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT–PCR)验证DEGs水平。结果表明:ND60 vs ND1、ND120 vs ND60、ND180 vs ND120、ND240 vs ND180、ND300 vs ND240、ND360 vs ND300、ND180 vs ND1、ND360 vs ND180和ND360 vs ND1这9个比较组中分别鉴定出1982、245、131、311、26、84、2257、1377和2654个DEGs。GO分析结果表明,DEGs主要参与肌肉收缩、骨骼肌组织发育和钙离子结合过程;KEGG通路分析结果表明,DEGs主要富集于糖异生/糖酵解、PI3K–Akt、MAPK等信号通路;对DEGs进行qRT–PCR验证,qRT–PCR结果与测序结果一致;转录组测序和试验验证结果发现,THBS3在ND180 vs ND1和ND360 vs ND1比较组中均下调,THBS4分别在ND180 vs ND1和ND360 vs ND180中显著下调和上调,这表明THBS3和THBS4的表达方式与猪生长发育规律相反,推测它们可能负向调控骨骼肌的生长发育。 展开更多
关键词 宁乡猪 背最长肌 转录组 差异表达基因 GO分析 KEGG通路分析 实时荧光定量pcr
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木香薷花发育相关内参基因的筛选评价
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作者 刘苗苗 杨瑾 +1 位作者 陈山 周秀梅 《林业科学研究》 北大核心 2025年第4期165-174,共10页
[目的]筛选出木香薷花发育相关稳定表达的内参基因,为后续开展木香薷花发育相关的基因功能分析及调控机理研究奠定基础。[方法]从木香薷花瓣转录组数据库中选择了9个内参基因(GAPDH、ACT、UBQ、UBC、TUA、TUB、EF1-α、eIF3K和SEP),采... [目的]筛选出木香薷花发育相关稳定表达的内参基因,为后续开展木香薷花发育相关的基因功能分析及调控机理研究奠定基础。[方法]从木香薷花瓣转录组数据库中选择了9个内参基因(GAPDH、ACT、UBQ、UBC、TUA、TUB、EF1-α、eIF3K和SEP),采用实时定量PCR技术检测其在木香薷花不同部位及不同发育阶段的小花中的特异性及表达情况,并利用ΔCT程序、GeNorm、NormFinder、Bestkeeper及Refinder网站对其表达稳定性进行综合评估,最后通过木香薷花青素合成过程中关键基因ElstANS对筛选出的内参基因的可靠性进行验证。[结果]在木香薷花不同部位,内参基因UBQ和eIF3K表达最稳定;在小花的各个发育阶段,内参基因UBQ和TUA表达最为稳定;在所有样品中,内参基因ACT和UBQ表达为最稳定,最不稳定的是UBC基因。ElstANS验证发现无论ACT、UBQ单独使用还是组合使用,ElstANS在木香薷花不同部位或不同发育阶段均现出相同的表达趋势,而稳定性最差的UBC无法准确校正qRT-PCR结果。[结论]在进行木香薷花发育调控相关基因的表达分析时,推荐单独使用UBQ、ACT或组合使用UBQ+ACT作为内参基因。 展开更多
关键词 木香薷 内参基因 qrt-pcr 基因表达 花发育
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云南省清华洞蝙蝠携带的冠状病毒调查与病毒定量检测方法的建立
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作者 孔玮 韩培钰 +6 位作者 杨泽 赵俊颖 汤燚 田佳伟 徐粉慧 宗利东 张云智 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第7期704-711,共8页
目的对云南省清华洞蝙蝠粪便中冠状病毒(coronavirus,CoV)进行定性和定量检测。方法用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对CoV进行定性检测,用生物信息学软件进行同源性与遗传进化分析。建立逆转录实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,对CoV进行... 目的对云南省清华洞蝙蝠粪便中冠状病毒(coronavirus,CoV)进行定性和定量检测。方法用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对CoV进行定性检测,用生物信息学软件进行同源性与遗传进化分析。建立逆转录实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,对CoV进行定量检测。结果共采集棕果蝠粪便样本306份,RT-PCR检测CoV阳性率为7.8%(24/306),检测到的24株CoV均为β-CoV,与NCBI中其它β-CoV核苷酸相似性为86.8%~100.0%;氨基酸相似性为95.2%~100.0%;qRTPCR检测CoV阳性率为18.6%(57/306),比RT-PCR检出率高(χ^(2)=25.3,P˂0.05);β-CoV平均病毒载量为1.3×10^(3)拷贝数/μL。结论云南省清华洞蝙蝠携带β-CoV,建立的qRT-PCR方法具有很好的敏感性、准确性和重复性,qRT-PCR检出率高于RTPCR,可对蝙蝠β-CoV进行快速检测。 展开更多
关键词 蝙蝠 β冠状病毒 RT-pcr qrt-pcr
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北京、山东和湖南地区烟粉虱抗药性及CYP4v2和CYP6CX1 mRNA水平表达量分析 被引量:17
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作者 杨鑫 谢文 +4 位作者 王少丽 吴青君 徐宝云 周小毛 张友军 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期70-75,共6页
于2011年采集北京、山东和湖南三地的烟粉虱,进行B、Q隐种鉴定,并测定4种杀虫剂的抗药性,同时通过荧光定量PCR分析CYP4v2和CYP6CX1两个基因的mRNA水平的表达量。结果表明,北京、湖南和长沙烟粉虱均为Q隐种。抗药性监测表明,北京和湖南... 于2011年采集北京、山东和湖南三地的烟粉虱,进行B、Q隐种鉴定,并测定4种杀虫剂的抗药性,同时通过荧光定量PCR分析CYP4v2和CYP6CX1两个基因的mRNA水平的表达量。结果表明,北京、湖南和长沙烟粉虱均为Q隐种。抗药性监测表明,北京和湖南种群对阿维菌素敏感,山东种群抗性水平较低,而对烟碱类药剂噻虫嗪出现不同程度的抗药性,其中湖南地区烟粉虱对噻虫嗪的抗药性达到49.08倍的高抗水平,北京和山东地区也达到中抗水平。另外,这3个地区的种群对毒死蜱和联苯菊酯抗性水平都较低。通过qRT-PCR分析三地的CYP4v2和CYP6CX1基因表达量,发现相对于敏感种群CYP4v2基因在北京、山东和湖南3个地理种群中分别过量表达3.85倍、19.57倍和10.78倍,而CYP6CX1基因在北京种群中过量表达20.55倍。结果提示田间烟粉虱的细胞色素P450基因CYP4v2和CYP6CX1过量表达可能会是烟粉虱抗药性的形成机制之一。 展开更多
关键词 烟粉虱 杀虫剂抗药性 细胞色素P450 荧光定量pcr
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在水稻纹枯病菌菌核形成中5个基因的表达差异分析 被引量:7
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作者 王伟 杨惠 +1 位作者 王政逸 陈卫良 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期18-25,共8页
以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1IA)菌株GD118不同生长时期的总RNA为材料,以18SrRNA作为内参基因,根据实验室抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)已获得的立枯丝核菌基因片段的表达序列标签(expressed seq... 以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1IA)菌株GD118不同生长时期的总RNA为材料,以18SrRNA作为内参基因,根据实验室抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)已获得的立枯丝核菌基因片段的表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)设计引物,采用实时定量RT-PCR检测A、B、C、E、F基因(分别为双组分反应调节子、激活巨噬细胞糖蛋白、胞外金属弹力蛋白酶、亲环蛋白、内质网囊泡蛋白ERV29)的表达,以期找到水稻纹枯病菌菌核形成中的差异表达基因。结果表明:从菌核开始形成到菌核成熟的过程中,这5个基因的表达量逐渐降低,且菌核在成熟时表达量最低,但成熟后这些基因的表达量迅速恢复到之前的水平,之后表达量基本保持不变。提示这5个基因在水稻纹枯病菌菌核形成的不同时期的表达有显著差异,说明这5个基因可能受菌核形成过程中胁迫条件的诱导表达。 展开更多
关键词 水稻纹枯病菌 菌核形成 实时荧光定量RT pcr 基因差异表达
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受条锈菌诱导的小麦丝氨酸苏氨酸激酶基因TaS/TK的克隆与表达 被引量:9
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作者 蒋正宁 别同德 +3 位作者 赵仁惠 高德荣 吴旭江 张伯桥 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第5期980-986,共7页
以小麦基因芯片数据获得的1个受条锈病菌诱导上调表达的EST序列为探针,从小麦中克隆抗条锈病相关基因TaS/TK,并对其序列特征、进化关系和表达特征进行分析。结果表明:TaS/TK基因c DNA全长为1 582 bp,包含1 239 bp的ORF、139 bp的5'... 以小麦基因芯片数据获得的1个受条锈病菌诱导上调表达的EST序列为探针,从小麦中克隆抗条锈病相关基因TaS/TK,并对其序列特征、进化关系和表达特征进行分析。结果表明:TaS/TK基因c DNA全长为1 582 bp,包含1 239 bp的ORF、139 bp的5'UTR以及240 bp的3'UTR,编码412个氨基酸,分子量47 120,等电点为5.84,并将其定位于小麦5B染色体;SMART软件分析结果表明TaS/TK仅存在1个典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域;经激酶区Blastp比对分析,TaS/TK与其他植物同源性较低,与同源性最高的短柄草仅为59%;qRT-PCR检测结果显示,TaS/TK在小麦茎、叶中均有表达,但在根中低水平表达;TaS/TK在抗病小麦、感病小麦中均受条锈菌诱导表达,但在抗病材料中表达水平明显高于感病材料;同时,TaS/TK受水杨酸诱导上调表达。以上结果表明TaS/TK可能参与小麦SA信号通路中对条锈病菌的抗性反应。 展开更多
关键词 小麦 条锈病 丝氨酸苏氨酸激酶基因 实时定量pcr
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Lef-1基因在棕色和白色羊驼皮肤差异表达 被引量:9
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作者 杨磊 王海东 +3 位作者 王祎 于秀菊 董彦君 董常生 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1061-1066,共6页
本实验旨在研究淋巴增强因子-1(Lef-1)在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位,探索其与毛色间的关系.采用实时荧光定量PCR、Western印迹以及免疫组织化学方法,研究白色和棕色羊驼皮肤中的mRNA、蛋白表达水平和定位.定量实时荧光PCR结果显示,... 本实验旨在研究淋巴增强因子-1(Lef-1)在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位,探索其与毛色间的关系.采用实时荧光定量PCR、Western印迹以及免疫组织化学方法,研究白色和棕色羊驼皮肤中的mRNA、蛋白表达水平和定位.定量实时荧光PCR结果显示,Lef-1在棕色羊驼皮肤组织相对基因表达量是3.372 7±0.198 9,在白色羊驼皮肤组织是1.000 3±0.022 7;Western印迹结果显示,在羊驼皮肤组织总蛋白中存在分子量约44 kD与兔抗Lef-1多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带,棕色羊驼平均蛋白表达量显著高于白色羊驼;免疫组织化学结果显示,在棕色羊驼皮肤组织中多表达在毛球部,表皮也有分布,在白色羊驼皮肤组织中多表达在表皮,在棕色和白色羊驼皮肤组织中外根鞘都有较强表达.结果显示,Lef-1在棕色和白色羊驼皮肤的定位和含量存在差异,提示Lef-1可能影响了羊驼被毛颜色的形成. 展开更多
关键词 淋巴增强因子-1(Lef-1) 羊驼 定量实时荧光pcr 蛋白质印迹 免疫组织化学
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