为建立一种能同时检测牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)这4种病原的方法,本研究分别以BPIV3和BRSV的P基因、IBRV的gI基因和BVDV的5'UTR基因为靶基因设计特...为建立一种能同时检测牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)这4种病原的方法,本研究分别以BPIV3和BRSV的P基因、IBRV的gI基因和BVDV的5'UTR基因为靶基因设计特异性引物和探针,构建质粒标准品pUC57-BPIV3-P、pUC57-BRSV-P、pUC57-IBRV-gI和PVC57-BVDV-5'UTR,并经PCR和测序鉴定正确后等体积比混合作为模板,采用方阵法对引物、探针和各反应条件等的优化,初步建立引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)4种病毒性病原的多重TaqMan qPCR检测方法。结果显示,建立的多重qPCR仅能特异性检测BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV,与引起BRDC其他病原的牛冠状病毒(BCoV)、牛支原体(M-bov)、牛多杀性巴氏杆菌(Pm)、牛溶血性曼氏杆菌(Mh)均无交叉反应;对1:1:1:1混合的4种质粒标准品的检测限均为10拷贝/μL;组内和组间重复性试验的变异系数均小于1%;以本研究方法和国家标准检测法对149份临床样品平行检测BVDV,结果显示两种方法的总符合率分别为80.85%,以本研究方法和已有专利中的多重qPCR方法对149份临床样品平行检测BPIV3、BRSV、IBRV,结果显示两种方法的总符合率分别为75.07%、100%和92.83%,临床样品中存在4种病原8种混合感染情况。结果表明,本研究建立的致BRDC的4种病毒多重Taq Man qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV这4种常见牛病毒的鉴别检测和流行病学调查,为养殖场BRDC的防控奠定基础。展开更多
随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法...随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法这2种不同预处理方法下,使用2种广泛采用的DNA提取方法(FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒、天根Magnetic Soil and Stool DNA Kit磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒),对水样中的DNA进行提取,然后建立qPCR方法进一步对12种抗生素抗性基因和1类整合子进行定量检测。本研究拟从菌体富集效率、DNA提取效果和定量质控等方面优化预处理、DNA提取和qPCR定量检测等步骤。结果发现,直接过膜的前处理方法使得DNA提取浓度和菌体富集效率更高。FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒提取的DNA浓度更高。同时,建议在定量过程中添加以超纯水为基质的空白对照来避免引物二聚体的干扰。为了减少qPCR测量的变异性并提高精密度,每次qPCR运行包括一式三份的标准曲线的样品,并添加阳性对照。使用认证的标准品验证qPCR所得结果的正确度,以提高准确性并支持实验室间的均一性。本研究旨在提供一种可靠高效的抗生素ARGs的qPCR检测技术,为构建水环境中抗生素ARGs检测的质量控制体系提供了参考。展开更多
文摘为建立一种能同时检测牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)这4种病原的方法,本研究分别以BPIV3和BRSV的P基因、IBRV的gI基因和BVDV的5'UTR基因为靶基因设计特异性引物和探针,构建质粒标准品pUC57-BPIV3-P、pUC57-BRSV-P、pUC57-IBRV-gI和PVC57-BVDV-5'UTR,并经PCR和测序鉴定正确后等体积比混合作为模板,采用方阵法对引物、探针和各反应条件等的优化,初步建立引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)4种病毒性病原的多重TaqMan qPCR检测方法。结果显示,建立的多重qPCR仅能特异性检测BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV,与引起BRDC其他病原的牛冠状病毒(BCoV)、牛支原体(M-bov)、牛多杀性巴氏杆菌(Pm)、牛溶血性曼氏杆菌(Mh)均无交叉反应;对1:1:1:1混合的4种质粒标准品的检测限均为10拷贝/μL;组内和组间重复性试验的变异系数均小于1%;以本研究方法和国家标准检测法对149份临床样品平行检测BVDV,结果显示两种方法的总符合率分别为80.85%,以本研究方法和已有专利中的多重qPCR方法对149份临床样品平行检测BPIV3、BRSV、IBRV,结果显示两种方法的总符合率分别为75.07%、100%和92.83%,临床样品中存在4种病原8种混合感染情况。结果表明,本研究建立的致BRDC的4种病毒多重Taq Man qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV这4种常见牛病毒的鉴别检测和流行病学调查,为养殖场BRDC的防控奠定基础。
文摘随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法这2种不同预处理方法下,使用2种广泛采用的DNA提取方法(FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒、天根Magnetic Soil and Stool DNA Kit磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒),对水样中的DNA进行提取,然后建立qPCR方法进一步对12种抗生素抗性基因和1类整合子进行定量检测。本研究拟从菌体富集效率、DNA提取效果和定量质控等方面优化预处理、DNA提取和qPCR定量检测等步骤。结果发现,直接过膜的前处理方法使得DNA提取浓度和菌体富集效率更高。FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒提取的DNA浓度更高。同时,建议在定量过程中添加以超纯水为基质的空白对照来避免引物二聚体的干扰。为了减少qPCR测量的变异性并提高精密度,每次qPCR运行包括一式三份的标准曲线的样品,并添加阳性对照。使用认证的标准品验证qPCR所得结果的正确度,以提高准确性并支持实验室间的均一性。本研究旨在提供一种可靠高效的抗生素ARGs的qPCR检测技术,为构建水环境中抗生素ARGs检测的质量控制体系提供了参考。
