高效液相体积排阻色谱法定量检测重组猪伪狂犬病毒gD蛋白

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作者 陈晓洁 师小潇 +4 位作者 张承凤 黎明 师伟伟 杨延丽 贺笋 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2025年第1期25-32,共8页

本试验旨在建立高效液相体积排阻色谱(HPSEC)法进行重组猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD的定量质控并评价其应用,进一步扩展该方法在兽用疫苗领域的应用范围。制备并鉴定gD蛋白标准品,检测其在保存过程中的稳定性;采用HPSEC法定量检测gD蛋白... 本试验旨在建立高效液相体积排阻色谱(HPSEC)法进行重组猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD的定量质控并评价其应用,进一步扩展该方法在兽用疫苗领域的应用范围。制备并鉴定gD蛋白标准品,检测其在保存过程中的稳定性;采用HPSEC法定量检测gD蛋白并鉴定其色谱峰;建立HPSEC法检测gD蛋白标准品的标准曲线,并进行线性、检测限、准确度和精密度验证;考察HPSEC法定量检测细胞培养料液样品、纯化样品和乳化样品中gD蛋白浓度的适用性;对比HPSEC法和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法定量gD蛋白结果的相关性。结果显示,制备的gD蛋白标准品纯度>98%,可稳定存放12个月,浓度偏差为0.01%~2.80%。HPSEC法具有良好的线性(R^(2)=0.9999,n=8);检测限在5.0μg/mL以下;准确度较高,5个浓度的gD蛋白标准品检测准确度为93.2%~104.6%(n=6);精密度良好,5个浓度的gD蛋白标准品6次重复检测的相对标准偏差(RSD)为0.2%~1.6%(n=6);日间精密度良好,3批次细胞培养料液样品3 d各6次重复检测的RSD为1.1%~2.0%(n=6);可应用于细胞培养过程中gD蛋白在细胞培养料液样品中表达量的监测,纯化样品和乳化样品中gD蛋白的检测。分别采用HPSEC法和SDS-PAGE法定量12批细胞培养料液样品中gD蛋白浓度,2种方法结果高度正相关(Rs^(2)=0.9298,n=12),配对t检验无显著性差异(Ps=0.1457)。结果表明,HPSEC法定量检测猪伪狂犬病毒gD蛋白适用性好、重复性好、准确度高,能应用于抗原生产不同阶段样品的质量控制,指导疫苗工艺开发。 展开更多

关键词 高效液相体积排阻色谱(HPSEC) 猪伪狂犬病毒(prv) gD蛋白 疫苗 定量

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猪伪狂犬病病毒变异株传代致弱JS18-150株的获得与鉴定

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作者 侯真真 张华伟 +5 位作者 郝根喜 罗修鑫 宋文博 周明光 陈焕春 徐高原 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期178-185,共8页

为获得安全性良好、免疫原性高的变异株弱毒苗,采用鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养的方法对猪伪狂犬病病毒流行毒株JS18株进行传代,最终获得JS18-150株,随后通过PCR鉴定、测序、致病力试验和免疫效力试验对JS18-150株的体外生长特性、安... 为获得安全性良好、免疫原性高的变异株弱毒苗,采用鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养的方法对猪伪狂犬病病毒流行毒株JS18株进行传代,最终获得JS18-150株,随后通过PCR鉴定、测序、致病力试验和免疫效力试验对JS18-150株的体外生长特性、安全性和免疫原性进行初步研究。试验结果显示,在CEF上连续传代后,JS18株的gI、gE、US9基因缺失,获得的JS18-150株毒力已致弱,在CEF上适应性显著提高,与JS18株生长动力学相似;将JS18-150株以107.0TCID50/mL接种仔猪,所有仔猪均未观察到任何临床症状,且体温均未超过40.5℃;JS18-150株以106TCID50/mL接种仔猪后能保护仔猪有效抵御JS18株和HBZL05株的攻击。结果表明,JS18-150株对仔猪安全性良好,可作为PRV弱毒疫苗研制的候选毒株。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病病毒 变异株 传代致弱 基因缺失 伪狂犬病疫苗

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鉴别猪伪狂犬病病毒gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

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作者 李倩倩 黄英 +7 位作者 陈翔鸿 宋文博 杨柳 龙云志 余道兵 梁巩 黄超 汤细彪 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第10期68-74,共7页

为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性... 为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性试验,对临床样本和疫苗样本进行检测,并与商品化试剂盒的检测结果进行对比。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线R^(2)为0.9971;该方法特异性强,能区分PRV与其他常见的猪病原体;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL;对临床样本的检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致;能够区分PRV gI/gE基因部分缺失的疫苗株和野毒株。结果表明,本试验建立了一种特异性强、灵敏度高、适用范围广的鉴别诊断PRV gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病病毒(prv) gI/gE基因部分缺失疫苗株 鉴别诊断 TaqMan实时荧光定量PCR

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鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用 被引量：4

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作者 赵雪丽 闫若潜 +6 位作者 吴志明 曹伟伟 王淑娟 谢彩华 马震原 周兵强 王东方 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第4期865-870,共6页

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5′端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRVg... 为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5′端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRVgE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果表明,成功建立了鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,该方法灵敏度高,最低检出限为100拷贝/μL;重复性好;特异性强,可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因,但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒等其他8种病原扩增不出任何条带;自835份临床疑似PRV感染病料中共检测出PRVgD和gE基因双阳性样品即野毒感染阳性样品267份,PRVgD基因单阳性样品28份,选取该方法检测出的26份PRV野毒感染阳性样品用于病原分离培养,两种方法的符合率为96.1%。说明本试验建立的二重PCR鉴别诊断方法快速、灵敏、特异,对于临床上疫苗毒和野毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病病毒 gE基因缺失疫苗 gD/gE基因 二重PCR 鉴别诊断

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猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR鉴别 被引量：2

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作者 姜子义 李碧 +6 位作者 蔡瑶 颜久淇 龚双燕 樊毅 黄剑波 朱玲 徐志文 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1307-1311,共5页

为建立一种快速鉴别猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的方法,根据猪伪狂犬病毒(PRV)全基因序列,并参照SA215、Bartha-K61疫苗株基因缺失位点特征,在单一检测野毒株与疫苗株的基础上,针对g E、g B和TK基因设计引物,首次建立了同时检测猪伪狂... 为建立一种快速鉴别猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的方法,根据猪伪狂犬病毒(PRV)全基因序列,并参照SA215、Bartha-K61疫苗株基因缺失位点特征,在单一检测野毒株与疫苗株的基础上,针对g E、g B和TK基因设计引物,首次建立了同时检测猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR检测方法。通过一次PCR检测能区分感染野毒株、疫苗株SA215和Bartha-K61,且与猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)、细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。多次试验证明该方法简单、可靠且敏感度高,可用于科学研究和临床诊断等方面。 展开更多

关键词 prv 检测 多重PCR 疫苗株 变异株

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川株伪狂犬病疫苗的动物免疫试验 被引量：4

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作者 李晓慧 叶子健 +2 位作者 赵岭乐 王玉福 呼延含蓉 《吉林畜牧兽医》 2006年第7期10-11,共2页

本试验采用川株伪狂犬病毒,通过鸡胚原代细胞培养,48～72h收毒,以白油为乳化剂,用胶体磨乳化制苗。用该苗106.0TCID50、104.0TCID50两个剂量先后建立非靶动物(兔63只、小白鼠、大白鼠各30只、豚鼠6只)的动物模型试验及靶动物(哺乳仔猪... 本试验采用川株伪狂犬病毒,通过鸡胚原代细胞培养,48～72h收毒,以白油为乳化剂,用胶体磨乳化制苗。用该苗106.0TCID50、104.0TCID50两个剂量先后建立非靶动物(兔63只、小白鼠、大白鼠各30只、豚鼠6只)的动物模型试验及靶动物(哺乳仔猪、母猪、育肥猪共135头)的兔疫区域性试验,结果表明:本疫苗安全性良好,免疫抗体在35～45d出现高峰,免疫后猪体能抵御强毒攻击,无任何不良反应。 展开更多

关键词 川株伪狂犬疫苗 免疫 试验

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复方天门冬多糖注射液对猪伪狂犬病疫苗免疫效果的影响 被引量：7

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作者 杨楷 潘贵珍 +3 位作者 胡庭俊 马浚杰 曾芸 黄明 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期2081-2086,共6页

【目的】明确复方天门冬多糖注射液对猪伪狂犬病疫苗免疫效果的影响,为有效防控猪伪狂犬病提供理论依据。【方法】选择30头不带野毒感染的三元杂交猪,随机分为6组,每组5头,分别设为猪伪狂犬病疫苗+复方天门冬多糖注射液(高、中、低)剂量... 【目的】明确复方天门冬多糖注射液对猪伪狂犬病疫苗免疫效果的影响,为有效防控猪伪狂犬病提供理论依据。【方法】选择30头不带野毒感染的三元杂交猪,随机分为6组,每组5头,分别设为猪伪狂犬病疫苗+复方天门冬多糖注射液(高、中、低)剂量组(I^III)、猪伪狂犬病疫苗+瘟毒清药物对照组(IV)、猪伪狂犬病疫苗对照组(V)和空白对照组(VI),以探讨复方天门冬多糖注射液对猪接种伪狂犬病疫苗后抗体水平和血清细胞因子的影响。【结果】复方天门冬多糖注射液中剂量组(II)的血清抗体水平相对较稳定,其平均抗体阻断率基本维持在50%左右。至给药后第28 d,II组的血清IL-2水平升至108.75±34.15 pg/m L,且在整个试验过程均维持在90.00 pg/m L以上,前后波动不明显;在血清总蛋白和白蛋白方面,注射给药前均以II组的水平较低,分别为56.22±7.04和28.11±3.52 g/L,至给药后第28 d则以II组的水平最高,分别为80.50±2.43和40.25±1.21 g/L,均显著高于V组和VI组(P<0.05);血清溶菌酶水平方面,以II组和III组的血清溶菌酶水平波动较小,均维持在50.00μg/m L以上。各处理组间的血清XOD活性与NO水平差异均不显著(P>0.05)。【结论】复方天门冬多糖注射液对猪伪狂犬病疫苗有增效作用,其临床推荐用法用量为:接种猪伪狂犬病疫苗后按0.125 m L/kg的剂量进行肌内注射,1次/d,连用3 d。 展开更多

关键词 复方天门冬多糖注射液 猪伪狂犬病 疫苗 抗体水平 血清细胞因子

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伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立 被引量：5

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作者 兰德松 顾贵波 侯振中 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第7期1804-1812,共9页

为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法... 为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数(R2)分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒(prv) 野毒株 gE基因缺失疫苗株 TaqMan实时荧光定量PCR 鉴别

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重组动物疱疹病毒活载体疫苗的构建与应用研究进展 被引量：8

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作者 杨明珠 陈晓春 +2 位作者 宋佳诚 侯亚欣 李俊平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第1期338-351,共14页

重组病毒活载体疫苗是通过基因工程方法构建的活载体疫苗,规避了传统疫苗的一些缺点,具有极大的优势和应用前景。目前被广泛用作重组病毒载体的动物疱疹病毒有火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies viru... 重组病毒活载体疫苗是通过基因工程方法构建的活载体疫苗,规避了传统疫苗的一些缺点,具有极大的优势和应用前景。目前被广泛用作重组病毒载体的动物疱疹病毒有火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、鸭瘟病毒(Duck enteritis virus,DEV)、鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)等。对疱疹病毒基因组序列进行分析显示,其基因组大,复制非必需区域多,容纳外源基因的能力强。同时疱疹病毒具有宿主范围广泛、免疫持续期长、安全性较好及相关基因操作技术成熟等优点。笔者总结了当前构建重组动物疱疹病毒的主要方法,包括传统同源重组技术、细菌人工染色体(BAC)技术、Fosmid文库及CRISPR/Cas9基因编辑技术,简述了各个方法的基本原理及技术特点,比较了各个方法的优缺点,并分析了各个方法的最适运用条件,从而更准确地为研究工作提供理论及技术参考;对外源基因的表达方式进行分析,论证了不同启动子对外源基因表达的调控作用不同,同时对不同疱疹病毒的常用插入位点进行了研究成果的列举总结,并对当前重组病毒HVT、PRV、DEV及ILTV活载体疫苗的研究进展进行总结,对相关生物制品的注册应用信息进行了归纳,介绍了高选择率外源基因及高成功率插入位点,从而为相关生物制品的研制提供理论参考。 展开更多

关键词 重组动物疱疹病毒 活载体疫苗 火鸡疱疹病毒(HVT) 伪狂犬病病毒(prv) 鸭瘟病毒(DEV) 传染性喉气管炎病毒(ILTV)

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重组脑膜炎球菌PorB蛋白对猪伪狂犬弱毒疫苗的免疫增强效力

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作者 石晓玉 张元鹏 +5 位作者 乔绪稳 于晓明 陈瑾 姜平 郑其升 侯继波 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第2期-,共8页

探讨原核表达的重组脑膜炎球菌外膜蛋白PorB对猪伪狂犬弱毒活疫苗免疫的增强效果。将Gen Bank公布的脑膜炎球菌外膜蛋白PorB基因克隆到原核表达载体pQZⅢ中,命名为pQZ-PorB质粒,转入大肠杆菌BL21中表达重组蛋白。采用SDS-PAGE、Western-... 探讨原核表达的重组脑膜炎球菌外膜蛋白PorB对猪伪狂犬弱毒活疫苗免疫的增强效果。将Gen Bank公布的脑膜炎球菌外膜蛋白PorB基因克隆到原核表达载体pQZⅢ中,命名为pQZ-PorB质粒,转入大肠杆菌BL21中表达重组蛋白。采用SDS-PAGE、Western-blot技术和Ni^(2+)-NTA柱鉴定并纯化重组蛋白。将每份含100μg剂量的重组PorB蛋白与猪伪狂犬弱毒疫苗混合后分别滴鼻免疫3日龄仔猪和肌肉注射免疫50日龄猪,同时设PBS对照组和免疫前对照组。免疫28 d后测定IgG和IgA抗体水平、猪外周血淋巴细胞增殖情况以及细胞因子(IFN-γ、IL-10、IL-6)的表达水平。SDS-PAGE和Western-blot结果表明,PorB基因在大肠杆菌中表达,表达的重组PorB蛋白是可溶性的,Ni^(2+)-NTA柱能够有效纯化重组蛋白。重组PorB蛋白不但能够刺激免疫猪在较短时间内产生的较高血清IgG抗体、黏膜IgA抗体和中和抗体,而且可以通过诱导机体产生IFN-γ和IL-6来促进细胞免疫反应。在猪伪狂犬弱毒疫苗免疫中,重组PorB蛋白可以作为一种优良的免疫增强剂。 展开更多

关键词 脑膜炎球菌PorB蛋白 猪伪狂犬弱毒疫苗 免疫增强

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FliC蛋白佐剂对伪狂犬病病毒Bartha-K61株弱毒疫苗的黏膜免疫作用

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作者 梁力荣 柯海意 +8 位作者 臧莹安 翟少伦 康桦华 蒋智勇 李艳 张昆丽 周霞 勾红潮 李春玲 《中国畜牧兽医》 2025年第10期4864-4873,共10页

【目的】探讨FliC蛋白作为黏膜佐剂对伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)Bartha-K61弱毒疫苗株的免疫增强作用,为PRV黏膜疫苗的研发奠定基础。【方法】将鼠伤寒沙门菌FliC基因克隆连接至原核表达载体pET-28a(+),连接产物转化大肠杆菌... 【目的】探讨FliC蛋白作为黏膜佐剂对伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)Bartha-K61弱毒疫苗株的免疫增强作用,为PRV黏膜疫苗的研发奠定基础。【方法】将鼠伤寒沙门菌FliC基因克隆连接至原核表达载体pET-28a(+),连接产物转化大肠杆菌Trans10感受态细胞,提取质粒后进行双酶切鉴定并测序;将FliC-pET-28a转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达FliC蛋白,通过考马斯亮蓝染色和Western blotting对纯化后的FliC蛋白进行鉴定。设置Bartha-K61病毒液组和商品化Bartha-K61疫苗组作为对照,将FliC蛋白作为黏膜佐剂与Bartha-K61病毒液混合,滴鼻2次免疫BALB/c小鼠,测定免疫前(0 d)、免疫后7、14、21、28和35 d小鼠血清IgG和IgA水平,免疫后第35天对各组小鼠分别滴鼻PRV GD-WH病毒液10^(4.5) TCID_(50),攻毒后每日观察并记录小鼠生存状况。【结果】成功获得重组质粒FliC-pET-28a,实现了FliC蛋白的可溶性表达,纯化后的FliC蛋白大小约为58 ku。小鼠免疫试验结果显示,二免后Bartha-K61病毒液+FliC蛋白组血清IgG和IgA抗体均显著高于Bartha-K61病毒液组和商品化Bartha-K61疫苗组(P<0.05)。攻毒保护试验结果显示,Bartha-K61病毒液+FliC蛋白免疫能给小鼠提供100%的保护力,抵抗PRV GD-WH的致死性攻击,具有高于Bartha-K61病毒液单独免疫的保护力。【结论】FliC蛋白佐剂对PRV Bartha-K61弱毒疫苗株具有黏膜免疫增强作用,并使小鼠获得一定的免疫保护效力。 展开更多

关键词 FliC蛋白 伪狂犬病病毒弱毒疫苗 黏膜免疫

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