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PRPS1 I72位点突变对急性淋巴细胞白血病耐药性的影响及其机制研究
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作者 崔芷嫣 陈尧 +2 位作者 陶悦 沈树红 李慧 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期977-987,共11页
目的·研究磷酸核糖焦磷酸合成酶1(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1,PRPS1)I72位点突变是否能使急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞对巯嘌呤类化学治疗(化疗)药物6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-... 目的·研究磷酸核糖焦磷酸合成酶1(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1,PRPS1)I72位点突变是否能使急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞对巯嘌呤类化学治疗(化疗)药物6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine,6-TG)产生耐药性,并解释其作用机制。方法·将临床上已发现的PRPS1基因的各突变(I72F、R177S、V316L)和2个ALL细胞系(KOPN72bi和RS4;11)中存在的PRPS1基因突变(V208A、V289A)分别插入融合了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的载体pGV303中,用已证明的对巯嘌呤类化疗药耐药的PRPS1 A190T突变为阳性对照,对该类药不耐药的空载体pGV303(Vector)、PRPS1野生型(wild type,WT)及PRPS1 I72V突变为阴性对照。将上述构建好的载体瞬时转染入HEK-293T细胞(简称293T细胞)中,并采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测PRPS1各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况。采用药物敏感性实验检测并计算6-MP或6-TG对上述瞬转PRPS1各突变体的293T细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))。随后,除PRPS1 I72F和I72V之外,将第72位异亮氨酸(isoleucine,I)变成其他氨基酸的多个突变即I72M、I72L、I72N、I72S、I72T分别插入载体pGV303中,瞬时转染入293T细胞后采用Western blotting、药物敏感性实验检测各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC_(50)。采用慢病毒感染法将PRPS1 WT、I72F、I72V、A190T及载体pGV303感染REH细胞系,通过流式细胞术分选GFP阳性细胞以获得PRPS1各突变体稳定表达的细胞,并采用Western blotting及药物敏感性实验检测各突变体在REH细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC_(50),用以验证293T细胞获得的药物敏感性实验结果。采用AnnexinⅤ/DAPI双染法评估各REH细胞系的凋亡情况,并通过Western blotting检测各REH细胞系的DNA损伤相关蛋白[S139位点磷酸化的组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX-S139,γ-H2AX)、磷酸化的细胞周期检验点激酶2(phosphorylated check point kinase 2,pCHK2)]和细胞凋亡相关蛋白聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶剪切体[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase,cleaved PARP]的表达水平。使用PDB数据库(Protein Data Bank)中编号为2HCR(PDB code 2HCR)的PRPS1晶体结构图,通过三维成像及PyMOL软件预测并绘制I72位点、I72V和I72F的氨基酸残基及空间构象图。结果·Western blotting结果显示,瞬时转染的外源性PRPS1各突变蛋白在293T细胞中成功表达;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72F、R177S、V316L、V208A与阳性对照A190T的293T细胞对6-MP或6-TG的IC_(50)均远高于表达V289A及阴性对照Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000)。将第72位异亮氨酸变成其他氨基酸后,Western blotting结果显示瞬时转染的外源性PRPS1 I72位点的各突变蛋白在293T细胞中成功表达;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72M、I72F、I72L、I72N、I72S、I72T与A190T的293T细胞对6-MP或6-TG的IC_(50)均远高于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000)。慢病毒感染REH细胞后,Western blotting结果显示在已构建的稳定细胞系中PRPS1 WT、A190T、I72F、I72V的蛋白高表达且表达量相似;药物敏感性实验结果显示,表达PRPS1 I72F、A190T的REH细胞对6-MP或6-TG的IC_(50)均远高于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000),与293T细胞中瞬时转染得到的药物敏感性结果一致。AnnexinⅤ/DAPI双染法、DNA损伤和凋亡相关蛋白的Western blotting检测的结果均显示,经6-MP处理后,表达PRPS1 A190T、I72F的REH细胞系的DNA损伤和凋亡率明显低于表达Vector、PRPS1 WT、PRPS1 I72V的细胞(均P=0.000)。蛋白结构分析结果显示,PRPS1 I72F会使PRPS1的空间构象发生改变。结论·PRPS1 I72F、R177S、V316L、V208A、I72M、I72L、I72N、I72S、I72T突变可使细胞获得对巯嘌呤类化疗药的耐药性,PRPS1 V289A、I72V突变不影响细胞对巯嘌呤类化疗药的敏感性。293T中的药物敏感性实验结果和REH中的药物敏感性实验结果一致,证明293T细胞可以作为检测PRPS1突变对巯嘌呤类化疗药物耐药性的快速研究模型。PRPS1 I72位点突变对巯嘌呤类化疗药耐药性的影响可能与PRPS1结构发生改变有关。 展开更多
关键词 急性淋巴细胞白血病 耐药复发 磷酸核糖焦磷酸合成酶1 巯嘌呤
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3,5,2',4'-四羟基查尔酮对小鼠尿酸及尿酸合成相关酶基因的影响 被引量:4
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作者 刘恺 林华 +3 位作者 高丽辉 刘旭 李玲 牛艳芬 《天然产物研究与开发》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期131-135,共5页
用氧嗪酸钾诱导高尿酸血症动物模型,对化合物3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)的降尿酸作用及尿酸合成相关酶基因进行研究。用磷钨酸法测定小鼠血清尿酸水平,用RT-PCR测定脑组织中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、肝脏中的磷... 用氧嗪酸钾诱导高尿酸血症动物模型,对化合物3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)的降尿酸作用及尿酸合成相关酶基因进行研究。用磷钨酸法测定小鼠血清尿酸水平,用RT-PCR测定脑组织中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、肝脏中的磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS)和磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)mRNA的表达水平。结果表明:灌胃给予高尿酸血症小鼠P40 2、4、8 mg/kg和阳性对照药别嘌醇1 mg/kg,共给药5次,每天2次,均显著降低血清尿酸水平(P<0.05,0.01),具有显著的降尿酸作用;但对HGPRT、PRPS、PRPPAT的mRNA表达水平无明显影响。 展开更多
关键词 3 5 2' 4'-四羟基查尔酮 高尿酸血症 尿酸 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 磷酸核糖焦磷酸合成酶 磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶
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离子对反相HPLC测定人红细胞PRPP合成酶活性 被引量:2
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作者 彭岚 卢义钦 刘俊凡 《生物化学杂志》 CSCD 1997年第1期113-115,共3页
Using ion-pair reversed-phase HPLC (IPrHPLC), the PRPP synthetase activity inhuman erythrocytes was estimated. Methodological improvements have been taken on seeral aspects, including the removal of leukocytes and pla... Using ion-pair reversed-phase HPLC (IPrHPLC), the PRPP synthetase activity inhuman erythrocytes was estimated. Methodological improvements have been taken on seeral aspects, including the removal of leukocytes and platelets in preparation of hemolysates, lysis of erythrocyte membranes and raising of efficiency in separation of ADP from ATP peaks etc. Thismethod fulfills the requirements of simplicity, reproducibility and accuracy. The intrabatch coefficient of variation was ±3. 0 % on average, the mean relative deviation was 2. 3 %, with a recoveryrate of 94.3—98.6%. The mean value of PRPP sythetase activities in the erythrocytes of 28healthy Chinese was 2. 19 ± 0. 61 μmol·min-1·g-1. 展开更多
关键词 红细胞 PRPP合成酶 离子 高效液相色谱
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大肠杆菌合成烟酰胺单核苷酸途径构建及发酵工艺研究 被引量:1
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作者 程琳 龚劲松 +4 位作者 Michael HALL 苏畅 徐国强 许正宏 史劲松 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2023年第24期8-14,共7页
β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)作为人体内重要辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的直接前体受到了广泛关注,目前工业上主要采用化学法或化学-酶催化法进行合成,发酵法仍未取... β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)作为人体内重要辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的直接前体受到了广泛关注,目前工业上主要采用化学法或化学-酶催化法进行合成,发酵法仍未取得突破。为获得一株高产NMN的工程菌株,对大肠杆菌进行了代谢途径改造。首先在大肠杆菌中异源表达了来自松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)的烟酰胺磷酸核糖转移酶,构建了NMN的补救合成途径;为增强前体5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribose 1-pyrophosphate,PRPP)的供应,过表达了从葡萄糖出发的多个途径酶,促进了葡萄糖向磷酸戊糖途径的流动;同时,为有利于NMN积累,通过敲除NMN下游代谢分解途径基因pncC、ushA以及调控NAD+衍生物基因nadR,所获得的重组菌产量摇瓶水平达到60 mg/L,是初始产量的4.95倍;进一步在5 L罐上进行发酵试验,产量最高达到390.1 mg/L。该菌株用于NMN的发酵生产具有良好的潜力。 展开更多
关键词 代谢网络 基因调控 烟酰胺单核苷酸 5-磷酸核糖1-焦磷酸 发酵工艺
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