大肠杆菌Nissle 1917类T7表达系统的构建及应用

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作者 郑烨 邓睿哲 +3 位作者 杨富荏 林艺娜 王辉 叶健文 《暨南大学学报(自然科学与医学版)》 北大核心 2025年第2期151-162,共12页

目的:在大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN)中构建类T7 RNA聚合酶的强诱导表达系统,实现目标蛋白的高效表达。方法:在EcN中构建不同诱导表达调控系统,并进行“剂量-响应”表征测试,筛选出低渗漏、高表达的诱导系统... 目的:在大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN)中构建类T7 RNA聚合酶的强诱导表达系统,实现目标蛋白的高效表达。方法:在EcN中构建不同诱导表达调控系统,并进行“剂量-响应”表征测试,筛选出低渗漏、高表达的诱导系统;通过构建基因组整合表达类T7 RNA聚合酶(T7-like RNA polymerase,MmP1)的菌株LM01,并测试其启动子突变文库,优化其表达强度及动态输出范围;利用MmP1诱导系统表达超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),验证其蛋白表达能力。结果:在EcN中成功构建并表征了多个诱导系统,其中以MmP1为RNA聚合酶的类T7诱导表达系统的饱和诱导输出强度最优,最大动态调控范围高达909倍;将MmP1聚合酶表达模块整合至EcN基因组后,其饱和响应表达输出提高达66.8%;P MmP1启动子突变文库的构建提供了涵盖65~1097倍动态范围的宽范围可诱导表达可能性;MmP1系统在SOD蛋白可溶性表达测试中产量最高,达到435.7 mg/L,为香草酸诱导系统产量的4.02倍,且酶活性最高达到391.3 U/mL。结论:类T7(MmP1)诱导系统在EcN中可成功构建,并具有高饱和表达、低本底渗漏、动态范围可控等特性,有助于实现蛋白的高效表达合成。 展开更多

关键词 大肠杆菌Nissle 1917 诱导表达系统 类T7表达系统 蛋白表达 合成生物学

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蓝藻热休克诱导高效表达系统的构建 被引量：9

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作者 章军 秦燕 +5 位作者 欧阳青 徐虹 黄澜 刘仁海 周克夫 楼士林 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2001年第8期17-21,共5页

以聚球藻Synechococcussp .PCC794 2作为基因工程受体菌 ,构建了热休克诱导的高效表达系统。用PCR法扩增并克隆出Synechococcussp .PCC794 2自身的热休克基因 groESL操纵子的强启动区 (2 4 0bp) ,并紧靠其后组装上泛素 (UB)融合的胸腺素... 以聚球藻Synechococcussp .PCC794 2作为基因工程受体菌 ,构建了热休克诱导的高效表达系统。用PCR法扩增并克隆出Synechococcussp .PCC794 2自身的热休克基因 groESL操纵子的强启动区 (2 4 0bp) ,并紧靠其后组装上泛素 (UB)融合的胸腺素α1(Tα1)目的基因 ,在下游组装有rbcSpolyA终止子。此外 ,还组装了一个完整的卡那霉素抗性基因作为筛选标记基因。这样 ,就构建了完整的蓝藻的基因表达系统。经转化蓝藻Synechococcussp .PCC794 2细胞 ,在 4 2℃热诱导 30min后 ,目的基因UB Tα1得到较高水平表达 ,表达量约占可溶性蛋白的 8.7% 展开更多

关键词 蓝藻 热休克诱导 基因表达 基因工程 表达系统 卡那霉素抗性基因

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可诱导的shRNAs表达系统对HeLa细胞SMYD3基因表达的抑制 被引量：2

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作者 王淑珍 罗学刚 +3 位作者 丁艳 申静 陆云华 奚涛 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期369-374,共6页

目的:探讨可诱导的shRNAs表达载体介导的RNA干扰技术对HeLa细胞SMYD3基因的抑制作用。方法:设计和构建由强力霉素调控产生针对SMYD3基因的shRNAs表达质粒,转染至HeLa细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,RT-PCR检测SMYD3基因的表达,MT... 目的:探讨可诱导的shRNAs表达载体介导的RNA干扰技术对HeLa细胞SMYD3基因的抑制作用。方法:设计和构建由强力霉素调控产生针对SMYD3基因的shRNAs表达质粒,转染至HeLa细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,RT-PCR检测SMYD3基因的表达,MTT法检测对细胞增殖的影响。结果:酶切鉴定、测序分析证实shRNAs表达质粒构建成功。转染HeLa细胞后,在强力霉素诱导下,受到特异SMYD3 shRNAs干扰的HeLa细胞发生了典型的凋亡形态学改变。同时SMYD3 mRNA表达下调,细胞生长受抑制。而阴性对照组和空白对照组无明显变化。结论:针对SMYD3基因的可诱导的shRNAs表达质粒转染HeLa细胞后,在强力霉素的作用下,可阻断SMYD3基因的表达,抑制HeLa细胞的增殖,并能诱导HeLa细胞凋亡。 展开更多

关键词 可诱导 shRNAs表达系统 SMYD3 抑制

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单质粒模式诱导表达载体系统的建立 被引量：2

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作者 刘定燮 周晓巍 黄培堂 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第5期824-825,共2页

在Invitrogen公司T Rex诱导表达系统的基础上,将目的基因与调控蛋白基因克隆于同一载体上,并在CV1细胞中观察了四环素对该单质粒模式载体报告基因表达的诱导效应.载体在瞬时转染CV1细胞并以四环素诱导 2 4h后目的基因的表达水平提高了 ... 在Invitrogen公司T Rex诱导表达系统的基础上,将目的基因与调控蛋白基因克隆于同一载体上,并在CV1细胞中观察了四环素对该单质粒模式载体报告基因表达的诱导效应.载体在瞬时转染CV1细胞并以四环素诱导 2 4h后目的基因的表达水平提高了 8 9倍。 展开更多

关键词 单质粒模式 诱导表达 载体系统 四环素

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食品级高效诱导表达系统—NICE系统 被引量：4

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作者 徐波 曹郁生 《生物技术通报》 CAS CSCD 2005年第2期14-17,共4页

乳酸菌NICE系统是在乳链菌肽诱导下由nisA启动子控制目的基因表达的,含nisR和nisK的两组分调节系统的高效诱导表达系统。由于NICE系统的诱导剂、宿主菌和载体都是食品级的,其应用前景十分广阔。

关键词 表达系统 食品级 高效 基因表达 乳链菌肽 调节系统 启动子 乳酸菌 诱导剂 宿主菌 载体

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Retro-Tet:一种基于逆转录病毒的诱导性基因表达系统 被引量：1

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作者 龚小卫 姜勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期420-424,共5页

Retro Tet基因表达系统是一种新型的高效、稳定、无毒、具有严密开 关功能的可诱导性真核细胞基因表达系统 .该系统兼备了逆转录病毒基因表达系统和Tet off Tet on基因表达系统的优点 ,在稳定表达细胞系的筛选、基因的表达与调控及基... Retro Tet基因表达系统是一种新型的高效、稳定、无毒、具有严密开 关功能的可诱导性真核细胞基因表达系统 .该系统兼备了逆转录病毒基因表达系统和Tet off Tet on基因表达系统的优点 ,在稳定表达细胞系的筛选、基因的表达与调控及基因功能研究等方面得到了成功的应用 。 展开更多

关键词 诱导性基因表达系统 基因调控 基因治疗 Tetro-Tet 逆转录病毒

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小鼠H1foo基因四环素诱导表达系统的构建与表达 被引量：1

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作者 李建 宁静 +2 位作者 陈西锐 宋成艳 雷安民 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期757-762,共6页

卵母细胞特异性连接组蛋白H1foo(Linker histone H1foo)是连接组蛋白H1(Histone 1)在卵母细胞中特异性表达的1个亚型,H1foo在卵母细胞减数分裂和成熟发育过程中起着不可替代的作用,而且H1foo也参与了重编程过程。为了在体细胞中进一步研... 卵母细胞特异性连接组蛋白H1foo(Linker histone H1foo)是连接组蛋白H1(Histone 1)在卵母细胞中特异性表达的1个亚型,H1foo在卵母细胞减数分裂和成熟发育过程中起着不可替代的作用,而且H1foo也参与了重编程过程。为了在体细胞中进一步研究H1foo的功能,本试验通过采用四环素诱导表达载体系统,用PCR的方法扩增了小鼠的H1foo基因和四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子区。用双酶切和连接等方法将上述元件连接到真核表达载体pVenus上,构建了重组质粒pVenus-tet-CMV-H1foo。双酶切和测序结果显示,片段连接正确,且全长测序正确。本试验所构建的四环素诱导的小鼠H1foo真核表达系统有助于人们在体细胞中更好地探讨H1foo在特定时间的作用和功能。 展开更多

关键词 小鼠 H1foo基因 四环素诱导表达系统

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化学诱导表达系统在植物基因工程中的应用 被引量：1

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作者 张妍茹 李宁 +1 位作者 石泓 王傲雪 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期120-125,共6页

化学诱导型启动子能够从时空上精确调控基因的表达,是研究基因产物的有力工具。利用植物内源性化学诱导启动子或其他生物的化学诱导响应元件都可以在植物中构建化学诱导表达系统。文章介绍了化学诱导表达系统的类型及其构建原理,并对其... 化学诱导型启动子能够从时空上精确调控基因的表达,是研究基因产物的有力工具。利用植物内源性化学诱导启动子或其他生物的化学诱导响应元件都可以在植物中构建化学诱导表达系统。文章介绍了化学诱导表达系统的类型及其构建原理,并对其在植物基因工程中的应用提出了展望。 展开更多

关键词 启动子 表达系统 化学诱导

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兽疫链球菌ATCC39920可控诱导表达系统的构建及其应用 被引量：2

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作者 郑小娥 王震 刘浩 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期130-136,共7页

旨在构建一种在兽疫链球菌(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)中可用的基因诱导表达系统,并探究其在两步发酵中的应用。分别构建蔗糖、乳糖、木糖和乳酸链球菌素(nisin)诱导表达载体,以编码透明质酸合成酶的has A基因作为报告基... 旨在构建一种在兽疫链球菌(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)中可用的基因诱导表达系统,并探究其在两步发酵中的应用。分别构建蔗糖、乳糖、木糖和乳酸链球菌素(nisin)诱导表达载体,以编码透明质酸合成酶的has A基因作为报告基因,以has A基因功能缺失导致荚膜缺陷的?has A作为宿主菌,观察诱导后荚膜生成情况验证系统的可行性。结果显示,木糖和nisin系统不能诱导has A表达,乳糖系统诱导表达效率低,蔗糖系统可严谨且高效诱导基因表达。以?has A/p LH201菌株实施两步发酵,葡萄糖为唯一糖源时仅用于菌体生长,添加蔗糖诱导产生透明质酸,终产量达到3.4 g/L。成功构建了一种以蔗糖为诱导物的可控-诱导基因表达系统,可用于兽疫链球菌两步发酵。 展开更多

关键词 兽疫链球菌 可控诱导表达系统 可控两步发酵 透明质酸

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大豆发状根乙醇诱导表达系统的建立及验证

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作者 洪冰杰 许鑫 +2 位作者 侯文胜 于丽杰 韩天富 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期217-225,共9页

为在大豆中建立目的基因表达可控的化学诱导表达系统,本研究构建了基于乙醇诱导表达系统(ALCA switch)的GUS和GmFT2a表达载体,利用发状根农杆菌介导的根系转化体系,分别获得转ALCA-mini35S-GUS和ALCA-mini35S-GmFT2a的发状根,通过检测GU... 为在大豆中建立目的基因表达可控的化学诱导表达系统,本研究构建了基于乙醇诱导表达系统(ALCA switch)的GUS和GmFT2a表达载体,利用发状根农杆菌介导的根系转化体系,分别获得转ALCA-mini35S-GUS和ALCA-mini35S-GmFT2a的发状根,通过检测GUS的表达情况和GUS酶活性高低评定该系统在大豆发状根中的诱导效率,并通过检测GmFT2a表达水平加以验证。结果表明,在非诱导条件下,ALCA-mini35S-GUS发状根中未见GUS表达,而在培养基中添加乙醇后组织化学染色效果明显,说明GUS基因表达。乙醇诱导表达的效率与乙醇浓度有关,当乙醇浓度为0.05%、处理60 h时GUS相对表达量达到最高值,处理72 h时GUS酶活性最高;0.05%乙醇处理72 h时,ALCA-mini35S-GmFT2a发状根中GmFT2a相对表达量平均值约为诱导前的150倍,个别样本可达初始值的400倍。综上所述,乙醇诱导表达系统可以在大豆发状根中发挥作用,该系统不仅可用于大豆基因功能研究,而且可为培育外源基因表达可控的转基因大豆品种提供新的技术手段。 展开更多

关键词 大豆 乙醇诱导表达系统 GmFT2a 表达调控

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双诱导模式原核表达系统的建立与应用 被引量：1

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作者 方向东 高基民 +5 位作者 马骊 周俊岭 黄树其 刁志宏 陈泽洪 王小宁 《第一军医大学学报》 CSCD 1997年第4期253-257,共5页

将hG－CSFCDNA片段克隆于T7噬菌体RNA聚合酶启动子系统的表达载体pJGW1中，并与可热诱导T7RNA聚合酶产生的质粒pGP1－2共同转化大肠杆菌DHSα。经化学诱导或温度诱导，hG－CSF重组蛋白表达率＞30％，并具有特异的生物活性。所构建的重... 将hG－CSFCDNA片段克隆于T7噬菌体RNA聚合酶启动子系统的表达载体pJGW1中，并与可热诱导T7RNA聚合酶产生的质粒pGP1－2共同转化大肠杆菌DHSα。经化学诱导或温度诱导，hG－CSF重组蛋白表达率＞30％，并具有特异的生物活性。所构建的重组表达工程菌具有良好的稳定性。 展开更多

关键词 双质粒表达系统 基因重组 温度诱导 化学诱导

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植物化学诱导表达系统的类型和应用研究

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作者 况守龙 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第8期3125-3126,共2页

介绍了植物化学诱导表达系统的构建原理,列举了该表达系统的类型,并展望了其应用前景。

关键词 化学诱导剂 化学诱导系统 植物表达系统

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利用pTet-Off系统研究NAIF1对食管癌细胞系EC9706生物学行为的影响

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作者 罗清 钟佳玲 +4 位作者 赵玫 马怡茗 刘健 王佳 黄常志 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期162-165,共4页

目的:利用pTet-off可诱导表达系统将NAIF1重组质粒导入食管癌EC9706中进行生物学行为影响研究。方法:构建pTRE2-NAIF1质粒,与PTK-Hyg质粒共转染入可诱导表达细胞系TF93(由EC9706构建而得),经筛选并鉴定获得稳定可诱导表达克隆。以此克... 目的:利用pTet-off可诱导表达系统将NAIF1重组质粒导入食管癌EC9706中进行生物学行为影响研究。方法:构建pTRE2-NAIF1质粒,与PTK-Hyg质粒共转染入可诱导表达细胞系TF93(由EC9706构建而得),经筛选并鉴定获得稳定可诱导表达克隆。以此克隆采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞术(FCM)检测细胞周期、Transwell小室法检测细胞迁移和检测细胞黏附能力的改变。结果:经筛选并鉴定获得了稳定的可诱导表达TF93-pTRE2-NAIF1克隆。NAIF1在体外可以抑制EC9706细胞增殖、导致G0/G1期细胞阻滞、抑制其迁移和黏附能力。结论:NAIF1能抑制食管癌细胞系EC9706的恶性生物学行为,为食管癌的基因治疗提供了可能的新靶点。 展开更多

关键词 NAIF1 食管癌 EC9706 ptet-off可诱导表达系统

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枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展 被引量：39

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作者 余小霞 田健 +1 位作者 刘晓青 伍宁丰 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期35-44,共10页

枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。而实现外源蛋白的高效表达... 枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。而实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子。目前,枯草芽孢杆菌中常用的启动子为组成型、诱导物诱导型、时期特异性及自诱导型。详细介绍枯草芽孢杆菌表达系统以及其常用启动子的优缺点,并对克隆新的启动子的方法做了总结,旨为完善枯草表达系统和工业生产外源蛋白奠定基础。 展开更多

关键词 枯草芽孢杆菌 表达系统 组成型启动子 诱导型启动子

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半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件 被引量：22

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作者 陈卫 葛佳佳 +1 位作者 张灏 丁霄霖 《无锡轻工大学学报（食品与生物技术）》 CSCD 北大核心 2002年第5期492-495,共4页

从嗜热脂肪芽孢杆菌 (IAM 110 0 1)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB ,构建具T7强启动子的pET 2 0 (b) bgaB质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 .经IPTG诱导后 ,重组菌周质中乳糖酶酶活达到 0 .12U /mL ,胞内酶活为 1... 从嗜热脂肪芽孢杆菌 (IAM 110 0 1)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB ,构建具T7强启动子的pET 2 0 (b) bgaB质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 .经IPTG诱导后 ,重组菌周质中乳糖酶酶活达到 0 .12U /mL ,胞内酶活为 1.35U /mL ,比酶活为 6 .6 6U/mg蛋白 ,比酶源菌产生的酶活提高 5 0倍 .通过对IPTG诱导时机、诱导浓度和诱导时间的优化研究 ,重组菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的 90倍 . 展开更多

关键词 半乳糖苷酶基因 大肠杆菌 基因克隆 T7表达系统 诱导条件

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诱导型eIF3g人工microRNA表达载体的构建及应用 被引量：4

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作者 褚丽莎 韩娜 +1 位作者 宋向阳 曹江 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期135-138,共4页

目的:构建可用四环素调控的针对人eIF3g的人工microRNA表达载体,用于抑制肿瘤细胞中eIF3g的表达。方法:利用网络资源设计针对人eIF3g的人工microRNA,以PCR方法克隆,经DNA测序验证后亚克隆至四环素调控表达系统的pRevTRE2载体上,得到pRev... 目的:构建可用四环素调控的针对人eIF3g的人工microRNA表达载体,用于抑制肿瘤细胞中eIF3g的表达。方法:利用网络资源设计针对人eIF3g的人工microRNA,以PCR方法克隆,经DNA测序验证后亚克隆至四环素调控表达系统的pRevTRE2载体上,得到pRevTRE2-eIF3g-microRNA。将四环素调控表达系统的Tet-off质粒转染K562细胞获得稳定转染克隆后,再利用带有报告基因GFP的pRevTRE2-GFP转染选择调控能力较好的K562/Tet-off细胞株,将pRevTRE2-eIF3g-microRNA转染K562/Tet-off细胞,Westernblot检测eIF3g的表达,以研究eIF3g人工microRNA的作用效果。结果:DNA测序结果显示,针对人eIF3g的人工microRNA的克隆正确。pRevTRE2-GFP转染结果表明所选择的K562/Tet-off细胞株有较好的诱导功能。Westernblot结果显示,转染pRevTRE2-eIF3g-microRNA的K562/Tet-off细胞可用四环素调控eIF3g人工microRNA的表达从而抑制K562细胞中eIF3g的表达。结论:成功构建了可用四环素调控的eIF3g人工mi-croRNA表达载体,能有效调控K562细胞中eIF3g的表达。 展开更多

关键词 eIF3g MICRORNA 四环素诱导表达系统

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建立可诱导表达TNFAIP1的稳定细胞系 被引量：1

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作者 李红 贺志成 +1 位作者 刘倩 周建林 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2008年第2期96-99,共4页

利用Tet-Off可诱导表达系统在HT1080细胞中建立可诱导表达TNFAIP1基因的稳定细胞系.首先将融合表达GFP的TNFAIP1片段克隆到反应质粒pTRE2hyg中,然后将该质粒转染到HT1080/Tet-off细胞中,使用潮霉素B筛选,挑取单克隆,得到稳定转染的细胞... 利用Tet-Off可诱导表达系统在HT1080细胞中建立可诱导表达TNFAIP1基因的稳定细胞系.首先将融合表达GFP的TNFAIP1片段克隆到反应质粒pTRE2hyg中,然后将该质粒转染到HT1080/Tet-off细胞中,使用潮霉素B筛选,挑取单克隆,得到稳定转染的细胞系,扩大培养后在荧光显微镜下观察克隆的诱导效率,得到了低背景,高效诱导表达GFP-TNFAIP1的稳定细胞系,便于研究TNFAIP1在细胞生长、细胞周期和细胞信号通路等方面的作用. 展开更多

关键词 TNFAIP1 四环素调控系统 诱导表达

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有氧运动对大鼠中枢神经系统HSP70表达的影响 被引量：5

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作者 陆阿明 陆爱云 夏春林 《中国运动医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期411-414,共4页

目的:探讨有氧运动对大鼠中枢神经系统(CNS)细胞热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法:40只SD大鼠分成5组,分别为对照组、中等强度耐力训练组、中等强度耐力训练+大强度力竭运动组、大强度耐力训练组和大强度耐力训练+大强度力竭运动组... 目的:探讨有氧运动对大鼠中枢神经系统(CNS)细胞热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法:40只SD大鼠分成5组,分别为对照组、中等强度耐力训练组、中等强度耐力训练+大强度力竭运动组、大强度耐力训练组和大强度耐力训练+大强度力竭运动组,耐力训练持续6周,力竭运动在最后1次耐力训练后次日进行,各组取材后采用免疫组化和图像分析方法观察运动对CNS脑和脊髓6个部位HSP70表达的影响。结果:中等、大强度耐力训练组CNS各部位HSP70表达水平与对照组相比显著增加;力竭运动组CNS各部位HSP70表达水平均高于相应的耐力训练组,其中中等强度耐力训练+大强度力竭运动组表达增加最显著。结论:耐力训练是CNS各部位HSP70表达水平增加的重要诱导因素,运动强度的适应性改变是决定耐力训练后CNS各部位HSP70表达量的主要因素。 展开更多

关键词 HSP70表达 中枢神经系统 有氧运动 热休克蛋白70(HSP70) 耐力训练 中等强度 图像分析方法 CNS 适应性改变 训练组 运动组 SD大鼠 力竭运动 免疫组化 诱导因素 运动强度 对照组 训练后 表达量 水平

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四环素诱导的猪黑素皮质激素受体-4基因真核表达载体的构建 被引量：3

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作者 解宇 汪亮 +2 位作者 张冬杰 刘娣 孙亚蒙 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第1期13-16,共4页

猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导... 猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子调控区与转录调节元件。采用双酶切和连接等方法将上述元件连接到pcD-NA3.1(+)上,构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R。经双酶切和测序鉴定,结果显示片段正向连接且片段全长测序正确。试验成功构建了四环素诱导的pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R真核表达载体,并能在时间特异性方面调控MC4R基因的表达。 展开更多

关键词 猪 MC4R基因 四环素诱导表达系统

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tTS/rtTA系统下调目的基因基础表达的细胞模型研究 被引量：2

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作者 张若霜 帅丽芳 +1 位作者 赵勇 陈系古 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期361-364,共4页

【目的】构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型。【方法】通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7... 【目的】构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型。【方法】通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7-rtTA-tTS-Neo及pliv7-rtTA-Neo转染人HepG2细胞,经G418筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,克隆扩增后瞬时转染pTRE-Luc质粒,强力霉素(1mg/L)诱导表达后检测荧光素酶活性,挑选出低背景和高诱导表达的HepG2细胞克隆。【结果】带有tTS的细胞株其诱导倍数明显高于不带有tTS的细胞株(192︰21),其中克隆9的诱导倍数最高(256),获得1株高表达、低背景的HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo细胞株。【结论】荧光素酶活性检测结果验证了tTS对四环素调控系统的内在泄露问题有一定的抑制作用,使四环素调控系统的开关具有真正意义上的严密性。 展开更多

关键词 四环素调控系统 tTS沉默子 诱导表达 HEPG2细胞

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