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脑心肌炎病毒VP22A基因真核表达载体的构建 被引量：1
1
作者 邵帅 纪晓岚 +1 位作者 刘明启 李琼毅 《中国动物保健》 2025年第1期240-241,共2页
为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至... 为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至DH5α感受态细胞,菌液PCR鉴定阳性单克隆菌落,对阳性单克隆提取重组质粒并双酶切进行验证,对阳性重组质粒进行测序。重组质粒双酶切和测序结果表明,pc DNA3.1-Flag-VP2和pc DNA3.1-Flag-2A真核表达载体构建成功。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 VP2基因 2A基因 真核表达载体
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苏云金芽胞杆菌可视化快速表达载体的构建与特性分析
2
作者 张静安 胡孝龙 +5 位作者 曹蓓蓓 廖敏 束长龙 张杰 王奎 操海群 《生物技术通报》 北大核心 2025年第1期95-102,共8页
【目的】构建可以快速高效表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫基因的表达载体,提高Bt杀虫基因发掘及功能研究效率。【方法】以pUC18载体为基础,构建一个以cry1Ac基因启动子p1Ac指导、融合绿色荧光蛋白GFP的可视化快速... 【目的】构建可以快速高效表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫基因的表达载体,提高Bt杀虫基因发掘及功能研究效率。【方法】以pUC18载体为基础,构建一个以cry1Ac基因启动子p1Ac指导、融合绿色荧光蛋白GFP的可视化快速表达载体p1Ac-GFP,并从生物活性、碱溶性、抗胰蛋白酶稳定性、培养条件等方面对其进行分析。【结果】p1Ac-GFP在大肠杆菌中指导表达的Cry1Ac蛋白与Bt来源的蛋白在杀虫活性方面无明显差异。同时,p1Ac-GFP表达的Cry1Ac蛋白能够溶解于50 mmol/L Na_(2)CO_(3)溶液中,可溶性组分可被胰蛋白酶消化为60 kD大小的核心活性片段。此外,p1Ac-GFP大肠杆菌宿主菌株可以发出绿色荧光,培养菌液荧光强度与所表达的Bt蛋白浓度呈较好的线性关系。培养条件优化结果显示,37℃、培养液与装瓶体积比为5/5、48 h的培养时间最适合p1Ac-GFP表达Bt Cry1Ac蛋白。【结论】p1Ac-GFP表达Bt蛋白时可以直接使用菌液荧光强度作为生物活性测定的浓度指示依据,有助于Bt基因杀虫活性功能的快速批量筛选。 展开更多
关键词 苏云金芽胞杆菌 杀虫基因 cry1Ac启动子 大肠杆菌 表达载体
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山药生长素运输载体基因的表达特点及其对N-(1-奈基)邻氨甲酰苯甲酸的响应
3
作者 尹冬 徐升胜 +4 位作者 段延碧 程园 郭凤根 王仕玉 龙雯虹 《山东农业科学》 北大核心 2025年第4期32-39,共8页
为了探讨生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药(Dioscorea opposita)生长发育过程中的作用,本研究采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,通过筛选合适的内参基因,系统研究了生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药不同部位茎蔓及其他组织中的... 为了探讨生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药(Dioscorea opposita)生长发育过程中的作用,本研究采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,通过筛选合适的内参基因,系统研究了生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药不同部位茎蔓及其他组织中的表达模式,以及其对N-(1-奈基)邻氨甲酰苯甲酸(NPA)的响应。结果如下:利用Delta Ct、NormFinder、geNorm和Comparative△Ct软件对8个候选内参基因(MYB、GADPH、TRX-2、ACT-1、EF-1α、F-box、HIS、α-TUB)的稳定性进行评价,筛选出MYB基因可用作山药不同部位茎蔓中生长素运输载体基因表达分析的内参基因。RT-qPCR分析结果表明,DoAUX2、DoAUX3、DoPIN1、DoPIN3和DoPIN7基因在山药茎蔓幼嫩部位的上端表达量高于下端表达量;DoAUX1、DoAUX2和DoPIN3基因在茎蔓成熟部位的上端表达量高于下端表达量;DoPIN3基因在茎蔓幼嫩部位和成熟部位的上端表达量高于下端。生长素运输载体基因在山药茎尖、叶片、根系、珠芽、雄花及雌花中均有表达,其中,DoAUX1、DoAUX2和DoPIN7基因在叶片中的表达量最高,DoAUX3和DoPIN1基因在茎尖中的表达量显著高于其他组织,DoPIN3和DoPIN6基因在根系中的表达量显著高于其他组织,表现出明显的组织特异性。与清水对照相比,NPA处理显著影响DoAUX1、DoAUX2、DoAUX3、DoPIN1、DoPIN3、DoPIN6和DoPIN7基因的表达,且大多表现为下调表达。综上,生长素运输载体基因通过调控生长素在山药不同组织中的分布调控其生长发育,NPA能通过调控生长素运输载体基因的表达影响生长素在山药植株中的运输。 展开更多
关键词 生长素运输载体基因 山药 表达特点 茎蔓 N-(1-奈基)邻氨甲酰苯甲酸(NPA)
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MAVS全长及其截短体真核表达载体的构建和鉴定
4
作者 玉妹 毕冬琳 +1 位作者 郑天倚 李琼毅 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第1期49-60,共12页
建立线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS)全长及截短体的真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达,为后续探索MAVS在病毒逃逸机制研究中的作用提供重要的实验材料。首先,根据NCBI数据库中人源MAVS的... 建立线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS)全长及截短体的真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达,为后续探索MAVS在病毒逃逸机制研究中的作用提供重要的实验材料。首先,根据NCBI数据库中人源MAVS的全长序列,设计截短体引物,通过PCR从cDNA模板中扩增出MAVS全长及不同截短体的基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1-3xflag载体中。随后,将构建好的载体转染到HEK-293细胞中,利用RT-PCR技术检测扩增产物大小,与目的大小进行对比,用Western blot技术检测MAVS蛋白在293细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了全长MAVS(MAVS-FL)及其截短体MAVS-△C、MAVS-△CP、MAVS-PBD、MAVS-△Tm的真核表达载体,Western blot结果表明,构建的载体蛋白在HEK-293中能够有效表达。本研究成功构建了MAVS全长及其截短体的真核表达载体,并在HEK-293细胞中表达了这些蛋白,为后续研究MAVS蛋白的功能和抗病毒机制提供了实验材料。 展开更多
关键词 线粒体抗病毒蛋白 真核表达载体 截短体构建 蛋白表达
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小鼠SGK1基因真核表达载体的构建及鉴定
5
作者 张丽娜 巴隆 孟峻 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第1期51-57,共7页
目的:构建含有小鼠血清和糖皮质激素诱导激酶(SGK)1基因的真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry,并观察载体在转染HEK293细胞后的表达情况。方法:PCR法扩增SGK1目的基因片段,并与经过HindⅢ和SbfⅠ双酶切的pcDNA3.1-MYC-C-mcherry载... 目的:构建含有小鼠血清和糖皮质激素诱导激酶(SGK)1基因的真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry,并观察载体在转染HEK293细胞后的表达情况。方法:PCR法扩增SGK1目的基因片段,并与经过HindⅢ和SbfⅠ双酶切的pcDNA3.1-MYC-C-mcherry载体连接。酶切和测序验证成功后,采用脂质体转染法将pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry转染至HEK293细胞中,Western blotting法测定HEK293细胞中真核表达载体的表达情况。结果:酶切载体条带位于5200 bp,目的基因条带位于3100 bp,与预期结果相符。Snap Gene软件比对,pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry的测序结果与预期序列一致,表明真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry构建成功。Western blotting法观察到转染后的HEK293细胞在相对分子质量49000附近显现出明显的条带,真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry成功表达。结论:成功构建真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry,为后续研究SGK1基因对小鼠受精卵细胞早期发育的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 血清和糖皮质激素诱导激酶1 真核表达载体 HEK293细胞 载体构建 质粒
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基于VIGS的不同表达载体混合接种对烤烟烟碱代谢的影响
6
作者 卜亚艇 李伟 +9 位作者 许燕彪 谢可 徐秉聪 吴剑平 叶性荣 周建军 祖琼瑶 杨再军 郑聪 徐世晓 《江苏农业科学》 北大核心 2025年第3期16-23,共8页
烟碱的代谢具有复杂的基因调控网络,其中众多基因间存在相互影响,为探究不同基因共同沉默后对烟碱代谢通路以及叶片烟碱含量的影响。使用前期构建的烟碱代谢途径中3个功能基因(NtA622、NtPMT、NtBBL)和1个调控基因(NtMYB305a)病毒载体,... 烟碱的代谢具有复杂的基因调控网络,其中众多基因间存在相互影响,为探究不同基因共同沉默后对烟碱代谢通路以及叶片烟碱含量的影响。使用前期构建的烟碱代谢途径中3个功能基因(NtA622、NtPMT、NtBBL)和1个调控基因(NtMYB305a)病毒载体,利用病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术依据基因在烟碱代谢中的作用性质和作用阶段,设置不同载体组合浸染液接种处理,测定各处理的基因相对表达量、酶活性、烟碱含量,系统分析目的基因沉默效率以及沉默后对其他基因表达的影响,并探究各处理的基因平均沉默效率对烟碱降低率的贡献度。结果表明,各处理沉默相应目的基因,会在一定程度上影响本研究中其他目的基因的表达,其中NtA622基因受影响较小,而NtPMT、NtBBL基因受影响较大;各处理烟碱含量均得到降低,其中D6处理4个基因共同沉默后烟碱含量降低幅度最大,PMT、BBL活性与烟碱含量趋势基本一致,A622活性与烟碱含量趋势不完全一致;基因平均沉默效率低于烟碱含量降低率越多,说明对烟碱降低的贡献度越大,基因平均沉默效率高于烟碱含量降低率越多,说明对烟碱降低的贡献度越小。由此可知,利用VIGS技术可有效沉默目的基因的表达,进而降低叶片中烟碱含量,其中4个基因共同沉默后,烟碱含量降低最多;在烟碱代谢途径上,NtA622基因相对较稳定,而NtPMT与NtBBL基因相对不稳定;PMT、BBL活性与烟碱含量趋势基本一致。本研究为烤烟烟碱的分子调控提供了理论和技术支撑。 展开更多
关键词 VIGS 混合载体 烟碱 基因表达量 酶活性 基因平均沉默效率
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牛源IFI6基因的克隆及其蛋白生物信息学分析与真核表达载体构建
7
作者 肖芳 嵇辛勤 《贵州畜牧兽医》 2025年第1期30-34,共5页
为构建牛源IFI6基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法扩增牛肾细胞(MDBK)的IFI6基因,对其蛋白的理化性质、蛋白亲/疏水性、信号肽、跨膜结构域、二/三级结构进行预测分析,并构建牛源IFI6基因真核表达载体pEGFP-N1-IFI6。结果:牛源IFI6... 为构建牛源IFI6基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法扩增牛肾细胞(MDBK)的IFI6基因,对其蛋白的理化性质、蛋白亲/疏水性、信号肽、跨膜结构域、二/三级结构进行预测分析,并构建牛源IFI6基因真核表达载体pEGFP-N1-IFI6。结果:牛源IFI6基因开放读码框序列长度为405 bp,编码134个氨基酸,蛋白分子质量为32425.61 u,等电点为5.20,不稳定系数为57.75(>40),属于不稳定疏水性蛋白质,存在信号肽和跨膜结构域;Eco RⅠ、Bam HⅠ双酶切的pEGFP-N1-IFI6重组质粒扩增出4700、405 bp条带,分别与pEGFP-N1、IFI6基因相符。结论:pEGFP-N1-IFI6真核表达载体构建成功,可为家畜的抗病毒研究奠定基础。 展开更多
关键词 IFI6基因 生物信息学分析 表达载体构建
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多根紫萍SpLAR基因的克隆、表达分析及表达载体构建
8
作者 刘文英 左研熙 +2 位作者 何舒萍 杨璞 向蓓蓓 《湖北农业科学》 2025年第7期120-127,共8页
为探究多根紫萍(Spirodela polyrrhiza)中无色花青素还原酶编码基因SpLAR在原花青素生物合成中的作用,基于多根紫萍转录组数据获取SpLAR全长cDNA序列,成功克隆该基因;对SpLAR蛋白的特性进行预测,并检测了不同培养天数及营养胁迫条件下Sp... 为探究多根紫萍(Spirodela polyrrhiza)中无色花青素还原酶编码基因SpLAR在原花青素生物合成中的作用,基于多根紫萍转录组数据获取SpLAR全长cDNA序列,成功克隆该基因;对SpLAR蛋白的特性进行预测,并检测了不同培养天数及营养胁迫条件下SpLAR基因的表达水平;通过测定相应条件下原花青素的积累量,进一步分析了SpLAR基因表达量与原花青素积累量之间的相关性;并采用同源重组技术构建了pCAMBIA1301-SpLAR植物表达载体。生物信息学分析结果显示,该基因全长1059 bp,编码352个氨基酸,预测分子质量为38 ku,为亲水性不稳定蛋白,含有一个跨膜结构域,无信号肽,属于NADB_Rossmann超家族,SpLAR蛋白与芋(Colocasia esculenta)同源蛋白相似性最高;RT-qPCR及含量测定结果表明,SpLAR基因的表达量呈先升高后降低的动态变化趋势,且与原花青素积累量呈正相关,Datko处理下,在9 d时SpLAR基因表达量最高,此时原花青素积累量达到峰值20.6 mg/g。营养胁迫处理可显著促进SpLAR基因的表达及原花青素的生物合成,使积累量在9 d提升至24.8 mg/g。 展开更多
关键词 多根紫萍(Spirodela polyrrhiza) SpLAR基因 生物信息学 表达分析 载体构建
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蛋鸡CCND1基因真核表达载体的构建及在卵泡不同发育时期的时空表达模式研究
9
作者 邹贤群 余静 +1 位作者 刘永杰 陈晓霞 《饲料研究》 北大核心 2025年第9期64-69,共6页
试验旨在探究细胞周期蛋白D1(CCND1)基因在蛋鸡卵泡不同发育时期的时空表达模式,进一步研究CCND1基因的分子生物学作用,构建真核表达载体,并预测CCND1基因在蛋鸡卵泡发育过程中的具体分子作用。选用150日龄海兰褐蛋鸡不同大小的卵泡为... 试验旨在探究细胞周期蛋白D1(CCND1)基因在蛋鸡卵泡不同发育时期的时空表达模式,进一步研究CCND1基因的分子生物学作用,构建真核表达载体,并预测CCND1基因在蛋鸡卵泡发育过程中的具体分子作用。选用150日龄海兰褐蛋鸡不同大小的卵泡为试验材料,运用半定量RT-PCR、免疫组化等技术,在分子水平上进行时空表达模式研究与分析。通过酶切位点BamH I和XhoI的双酶切验证连接产物的正确性后进行测序,将测序正确的真核表达载体转染至鸡卵巢的颗粒细胞,利用实时荧光定量PCR技术对转染效果进行确认。结果显示,卵泡直径为5~6 mm和6~7 mm的CCND1的mRNA表达量显著高于其他各卵泡(P<0.05)。在前等级卵泡的卵母细胞和间质中可以观察到CCND1蛋白定位。经过菌落PCR扩增和测序分析,成功构建了真核表达载体pYr-adshuttle-4-CCND1,并将其有效转染至鸡卵泡的颗粒细胞。研究表明,试验可推测CCND1基因在蛋鸡卵泡生长发育过程中发挥一定的作用,为未来的基因功能研究和潜在应用提供了必要的分子基础和工具支持。 展开更多
关键词 蛋鸡 细胞周期蛋白D1(CCND1) 卵泡 真核表达载体 时空表达
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PRDM5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染Neuro-2a细胞的建立
10
作者 吴钊淳 李友 +2 位作者 何嘉文 廖科棋 李胜男 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第1期1-8,共8页
目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列... 目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列,将其与Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶双酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-PRDM5过表达重组质粒,采用PCR法筛选并鉴定出的与目的基因片段长度相近的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序正确的GV492-control质粒和GV492-PRDM5过表达重组质粒分别转染至人胚胎肾细胞HEK293T中,转染48 h后离心收集慢病毒,分别为GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒,采用慢病毒滴度测定法检测上述2种慢病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-control组和GV492-PRDM5组,分别使用GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后使用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))对成功感染GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的Neuro-2a细胞进行筛选,通过荧光显微镜观察GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平;Western blotting法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平。结果:PCR法,GV492-PRDM5重组质粒阳性转化子的长度约为684 bp,GV492-PRDM5过表达重组质粒基因序列与设计合成的PRDM5过表达序列一致;GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的滴度均为2.5×108 TU·mL^(-1)。荧光显微镜,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态均良好,且能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-qPCR法,与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞在相对分子质量为75000附近出现特异性条带;与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平升高(P<0.01)。结论:成功构建PRDM5过表达慢病毒载体,建立了稳定转染的GV492-PRDM5-Neuro-2a细胞。 展开更多
关键词 PR锌指区域蛋白 过表达慢病毒载体 稳定表达 Neuro-2a细胞
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九龙牦牛ELOVL3基因克隆、真核表达载体构建及组织表达谱分析
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作者 司比努尔·牙生江 者玉琦 +2 位作者 钟金城 武志娟 柴志欣 《华北农学报》 北大核心 2025年第2期201-209,共9页
极长链脂肪酸延伸酶3(ELOVL3)主要参与合成极长链脂肪酸(VLCFA),在脂肪酸代谢过程中扮演重要角色。旨为克隆九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列,构建ELOVL3基因真核表达载体,并预测分析其生物学功能,通过PCR技术扩增九龙牦牛ELOVL3基因的... 极长链脂肪酸延伸酶3(ELOVL3)主要参与合成极长链脂肪酸(VLCFA),在脂肪酸代谢过程中扮演重要角色。旨为克隆九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列,构建ELOVL3基因真核表达载体,并预测分析其生物学功能,通过PCR技术扩增九龙牦牛ELOVL3基因的CDS区序列,并通过同源重组将其插入到pcDNA3.1载体中以构建重组质粒。采用限制性酶切及PCR技术验证重组质粒,结合测序结果,利用在线预测软件分析其蛋白编码序列的生物学功能。另外,针对ELOVL3基因在mRNA水平和蛋白水平的表达量,进行qPCR和Western Blot检测。结果表明:九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列全长813 bp,共编码270个氨基酸;酶切、PCR及测序鉴定,确认成功构建pcDNA3.1-ELOVL3真核表达载体。生物信息学分析结果显示,ELOVL3基因编码蛋白属于疏水性蛋白,共有6个跨膜结构域及27个磷酸化位点。系统发育树显示,与九龙牦牛亲缘关系最近的是普通牛,最远的是原鸡。此外,ELOVL3基因在九龙牦牛肺脏组织中表达量最高。 展开更多
关键词 牦牛 ELOVL3基因 基因克隆 真核表达载体构建
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木薯Ⅴ型几丁质酶MeCHITV基因生物信息学分析及其表达载体构建
12
作者 刘沁雲 向春瑜 蔡杰 《福建农林大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第3期289-298,共10页
【目的】研究木薯Ⅴ型几丁质酶基因MeCHITV,以为后续阐明其在共生中的功能奠定基础,并为木薯高效栽培与养分利用提供理论依据。【方法】通过RT-PCR技术成功克隆了SC8木薯中的Ⅴ型几丁质酶基因MeCHITV,并采用生物信息学方法对其蛋白结构... 【目的】研究木薯Ⅴ型几丁质酶基因MeCHITV,以为后续阐明其在共生中的功能奠定基础,并为木薯高效栽培与养分利用提供理论依据。【方法】通过RT-PCR技术成功克隆了SC8木薯中的Ⅴ型几丁质酶基因MeCHITV,并采用生物信息学方法对其蛋白结构、组织特异性表达模式和遗传进化关系进行了全面分析。构建了MeCHITV基因的原核表达载体、过表达载体和基因编辑载体。【结果】MeCHITV基因的编码序列(CDS)全长1137 bp,编码378个氨基酸。MeCHITV蛋白的分子质量为42.09 ku,等电点为6.92,不稳定系数为33.97,是稳定蛋白且具有亲水性。其N端含有一个由21个氨基酸组成的信号肽序列。二级结构由33.33%的α螺旋、4.76%的β折叠、41.01%无规则卷曲和20.90%延伸链构成。与截形苜蓿Ⅴ型几丁质酶MtNFH1的同源性最高,亲缘关系最近。MeCHITV基因在木薯须根中表达量最高。此外,成功构建了原核表达载体pET28a-MeCHIV、过表达载体pCAMBIA1300-35S-MeCHITV和基因编辑载体pYAO:hSpCas9-MeCHITV,并分别成功转化至原核表达菌株Rossetta(DE3)和根癌农杆菌LBA4404。【结论】根据MeCHITV基因在须根中的高表达及对其所编码蛋白的结构,推断MeCHITV在根际发挥功能。结合同源性蛋白功能的分析,推测MeCHITV参与了木薯与丛枝菌根真菌(AMF)共生信号的调控。 展开更多
关键词 木薯 丛枝菌根真菌 Ⅴ型几丁质酶 MeCHITV 表达载体 基因编辑
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鸡柔嫩艾美耳球虫EtIMP1基因的克隆与表达载体的构建
13
作者 廖加磊 《福建畜牧兽医》 2025年第2期54-56,共3页
本研究对鸡柔嫩艾美耳球虫RNA进行提取及反转录,克隆鸡柔嫩艾美耳球虫IMP1基因,并将PCR产物连接于pEasy-Blunt-Simple载体中,PCR鉴定正确后送公司测序,进行序列分析。结果:成功克隆鸡柔嫩艾美耳球虫EtIMP1基因,其ORF长度为1 194 bp,并... 本研究对鸡柔嫩艾美耳球虫RNA进行提取及反转录,克隆鸡柔嫩艾美耳球虫IMP1基因,并将PCR产物连接于pEasy-Blunt-Simple载体中,PCR鉴定正确后送公司测序,进行序列分析。结果:成功克隆鸡柔嫩艾美耳球虫EtIMP1基因,其ORF长度为1 194 bp,并验证了其正确性;构建鸡柔嫩艾美耳球虫EtIMP1基因表达载体pEasy-Blunt-Simple-IMP1,并得到重组质粒,可为体外表达IMP1基因提供技术方法,也为疫苗候选基因的筛选奠定基础。 展开更多
关键词 鸡柔嫩艾美耳球虫 IMP1基因 克隆 表达载体 PCR
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木薯MeMLO12基因克隆及其CRISPR-Cas9表达载体的构建 被引量：1
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作者 蔡吉苗 李博勋 +3 位作者 黄贵修 李超萍 时涛 王国芬 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第8期1528-1537,共10页
MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放... MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放阅读框,含有15个外显子和14个内含子,编码586个氨基酸,蛋白的分子质量为67.2 kDa,等电点为8.85。该基因编码的蛋白定位在内质网膜上,无信号肽,在23~45、74~96、161~183、285~307、312~334、371~393、413~435 aa处形成7次跨膜结构域。qRT-PCR定量分析发现,受木薯黄单胞病菌侵染后,MeMLO12基因在木薯抗、感品种中的表达量存在明显的差异,参与木薯与黄单胞菌之间的互作,表现出负调控作用。选择该基因第11个外显子进行Snap Gene Viewer分析,获得了10 455条sgRNA的种子序列,从中选取3条靶序列约23 nt,碱基组成上3'末端含G结尾,将其构建到CRISPR-Cas9载体上,经验证,确认MeMLO12的3条靶序列已经成功构建到基因编辑载体上,将其命名为pSGR-Cas9-AT-MeMLO12载体。 展开更多
关键词 木薯 MeMLO12基因 克隆 表达分析 CRISPR-Cas9载体 构建
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赤水乌骨鸡ADSL基因的组织表达特征及其干扰载体构建
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作者 余欢 王成栋 +5 位作者 李辉 陈友波 石钰仕 赵德鹏 龙霞 谭启松 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期226-234,共9页
【目的】探究赤水乌骨鸡胸肌组织中腺苷琥珀酸裂解酶基因(ADSL)表达特征及其目的基因的干扰载体构建,为深入研究畜禽组织肌肉中肌苷酸(IMP)的表达规律及ADSL基因影响畜禽风味的机制提供理论参考。【方法】以不同月龄(3、4、5和6月龄)的... 【目的】探究赤水乌骨鸡胸肌组织中腺苷琥珀酸裂解酶基因(ADSL)表达特征及其目的基因的干扰载体构建,为深入研究畜禽组织肌肉中肌苷酸(IMP)的表达规律及ADSL基因影响畜禽风味的机制提供理论参考。【方法】以不同月龄(3、4、5和6月龄)的赤水乌骨鸡(公鸡和母鸡各半)为试验材料,运用实时荧光定量PCR检测不同月龄及不同性别赤水乌骨鸡胸肌组织中ADSL基因的表达情况;同时根据GenBank中鸡ADSL基因mRNA序列(NM_205529.2)设计4对短发夹RNA(shRNA)干扰序列(sh1-ADSL、sh2-ADSL、sh3-ADSL和sh4-ADSL)和1对阴性对照序列(sh-NC)与pGPH1/GFP/Neo载体连接后进行测序,将构建成功的ADSL基因干扰载体转染至成肌细胞,检测并筛选出干扰效率最高的干扰载体。【结果】ADSL基因在不同月龄赤水乌骨鸡胸肌组织中的相对表达量排序为5月龄>4月龄>6月龄>3月龄,赤水乌骨母鸡3月龄母鸡的ADSL基因相对表达量极显著高于公鸡(P<0.01,下同),4月龄母鸡ADSL基因的相对表达量显著高于公鸡(P<0.05),6月龄母鸡ADSL基因的相对表达量极显著低于公鸡;ADSL基因质粒的测序结果显示干扰质粒构建成功,质粒转染后干扰组及阴性对照均可见绿色荧光,空白对照不发光,说明各重组质粒成功转染赤水乌骨鸡成肌细胞;ADSL基因沉默结果显示,sh2-ADSL沉默效果最佳,干扰效率为90.30%。【结论】赤水乌骨鸡胸肌中ADSL基因的相对表达量随着月龄增加表现为先上升后下降的变化趋势;3、4和5月龄赤水乌骨母鸡ADSL基因的相对表达量高于公鸡,随着月龄增加ADSL基因的相对表达量增加,公鸡和母鸡间的差异减小。成功分离提取赤水乌骨鸡成肌细胞,并筛选出RNA干扰效果最佳载体sh2-ADSL,为后续研究ADSL基因调控鸡肉肌苷酸及风味的分子机制提供参考。 展开更多
关键词 赤水乌骨鸡 ADSL基因 组织表达 成肌细胞 干扰载体 肉质风味
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p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达
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作者 张春 苏丛 +1 位作者 伍婷 朱立雨 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第3期398-402,共5页
目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10... 目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。 展开更多
关键词 P62 慢病毒载体构建 三质粒包装系统 THP-1细胞 肺炎克雷伯菌 过表达
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多星韭AwCHI 1的克隆与分析及真核表达载体的构建 被引量：2
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作者 赵鑫 张艳 +3 位作者 肖松 黄菊 陈瑶 孙威 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第2期118-126,共9页
查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮物质合成途径中的关键酶,能催化柚皮素查尔酮生成柚皮素,进而转化生成各种类型的黄酮类化合物。根据多星韭(Allium wullichii)转录组测序结果,运用PCR技术克隆获取多星韭查尔酮异构酶的编... 查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮物质合成途径中的关键酶,能催化柚皮素查尔酮生成柚皮素,进而转化生成各种类型的黄酮类化合物。根据多星韭(Allium wullichii)转录组测序结果,运用PCR技术克隆获取多星韭查尔酮异构酶的编码基因(AwCHI 1),对基因序列进行分析,同时与真核表达载体pBI121进行连接,将其转入农杆菌GV3101感受态细胞中,完成农杆菌的转化。研究结果不仅为该基因的功能解析研究奠定了基础,也为多星韭类黄酮代谢途径的研究提供了重要基因资源。 展开更多
关键词 类黄酮 查尔酮异构酶 多星韭 真核表达载体
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绵羊GSTA2基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体构建 被引量：1
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作者 邱丽霞 林秀 +4 位作者 曹忻 杨华 杨永林 余乾 张文喆 《中国草食动物科学》 CAS 北大核心 2024年第2期1-9,共9页
为阐明绵羊谷胱甘肽S转移酶α2(Glutathione S-transferase alpha 2,GSTA2)基因功能,利用牛GSTA2基因序列设计引物,提取绵羊皮肤组织总RNA,应用RT-PCR、基因克隆、生物信息学对GSTA2基因进行研究,构建真核表达载体,转染绵羊皮肤成纤维细... 为阐明绵羊谷胱甘肽S转移酶α2(Glutathione S-transferase alpha 2,GSTA2)基因功能,利用牛GSTA2基因序列设计引物,提取绵羊皮肤组织总RNA,应用RT-PCR、基因克隆、生物信息学对GSTA2基因进行研究,构建真核表达载体,转染绵羊皮肤成纤维细胞,应用qPCR技术检测GSTA2基因的表达。结果表明,克隆到绵羊GSTA2基因672 bp编码区序列(GenBank登录号:OR440604.1),编码223个氨基酸,分子量为25.39 ku。氨基酸比对和系统进化树分析表明,绵羊与牛的GSTA2相似度最高,达87.39%。GSTA2的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建的真核表达载体pcDNA3.1-GSTA2转染绵羊皮肤成纤维细胞后,GSTA2基因表达量极显著上调(P <0.001)。说明成功克隆了绵羊新基因GSTA2的CDS序列,并成功构建了其真核表达载体。 展开更多
关键词 绵羊 GSTA2基因 克隆 生物信息学 真核表达载体
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龙胜凤鸡IGF2BP1基因的克隆、序列分析和过表达载体构建 被引量：1
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作者 李现超 杨祝良 +5 位作者 孙甜甜 杨雪琴 张佳仪 黄超 粟永春 杨秀荣 《中国家禽》 北大核心 2024年第2期119-124,共6页
为研究胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(Insulin-like growth factor 2 mRNAbinding protein 1,IGF2BP1)基因的序列和在鸡肌肉发育中的功能,研究克隆IGF2BP1基因并进行生物信息学分析,构建IGF2BP1的过表达载体pEGFP-IGF2BP1,在成肌细... 为研究胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(Insulin-like growth factor 2 mRNAbinding protein 1,IGF2BP1)基因的序列和在鸡肌肉发育中的功能,研究克隆IGF2BP1基因并进行生物信息学分析,构建IGF2BP1的过表达载体pEGFP-IGF2BP1,在成肌细胞验证载体的功能。结果显示:龙胜凤鸡IGF2BP1基因CDS区序列全长1 731 bp,编码576个氨基酸,与参考序列相比,存在6处同义突变;物种间同源性分析显示,龙胜凤鸡IGF2BP1基因与原鸡(Gallus gallus)、火鸡(Meleagris gallopavo)、绿头鸭(Anas platyrhynchos)、猪(Sus scrofa)、奶牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)的相似性分别为99.7%、94.7%、92.5%、82.4%、82.8%、82.7%;蛋白质二级、三级结构主要含有无规卷曲(45.83%)、α螺旋(27.26%)和延伸链(20.83%);经过酶切和测序鉴定显示,成功构建了pEGFP-IGF2BP1质粒,并且该质粒可在成肌细胞中表达绿色荧光,qRT-PCR结果显示IGF2BP1在试验组(转染pEGFP-IGF2BP1)的表达量极显著高于对照组(转染pEGFP-N1)(P<0.01)。结果表明,成功克隆IGF2BP1基因,构建的IGF2BP1基因过表达载体在成肌细胞中成功表达。 展开更多
关键词 龙胜凤鸡 IGF2BP1基因 生物信息学 过表达载体
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马铃薯StCYP83B1基因过表达载体构建及遗传转化 被引量：1
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作者 孔乐辉 宗德乾 +4 位作者 史青尧 殷盼盼 巫文玉 单卫星 强晓玉 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期1462-1469,共8页
旨在为解析马铃薯StCYP83B1基因的免疫功能提供重要材料基础,从四倍体马铃薯栽培种‘大西洋’的cDNA中克隆到StCYP83B1基因,将其与融合mCherry标签的35S::pART27重组载体连接,构建p35S::StCYP83B1-mCherry植物过表达载体,并通过农杆菌... 旨在为解析马铃薯StCYP83B1基因的免疫功能提供重要材料基础,从四倍体马铃薯栽培种‘大西洋’的cDNA中克隆到StCYP83B1基因,将其与融合mCherry标签的35S::pART27重组载体连接,构建p35S::StCYP83B1-mCherry植物过表达载体,并通过农杆菌介导的本氏烟瞬时表达体系确认该蛋白的表达;利用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法,将p35S::StCYP83B1-mCherry转入马铃薯中,随机挑选3株转基因植株进行鉴定:PCR检测证明StCYP83B1已整合到马铃薯基因组中,反转录实时定量PCR检测表明StCYP83B1在转化植株中的转录水平比未转化的对照植株上调40~49倍,免疫印迹检测表明StCYP83B1蛋白可以在转化植株中正常表达。同时,对转化马铃薯植株及微型薯的表型鉴定表明,StCYP83B1过量表达并不影响马铃薯的正常生长发育。该稳定转化马铃薯植株的获得为后续深入解析StCYP83B1基因的免疫功能及作用机制奠定了重要材料基础。 展开更多
关键词 马铃薯 StCYP83B1 表达载体 遗传转化
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