利用透明颤菌血红蛋白基因vgb改造毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的研究 被引量：4

1

作者 孟志刚 张锐 +1 位作者 陈毓荃 郭三堆 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期166-170,共5页

为了解决酵母发酵时贫氧限制目的蛋白表达量,利用透明颤菌血红蛋白基因vgb设计毕赤酵母分泌 型表达载体pPIC9K-vgb,并以人乳铁蛋白基因为目的基因转入毕赤酵母GS115。研究结果表明,该表达载体具 有转化操作简单、后期工程菌筛选简便、... 为了解决酵母发酵时贫氧限制目的蛋白表达量,利用透明颤菌血红蛋白基因vgb设计毕赤酵母分泌 型表达载体pPIC9K-vgb,并以人乳铁蛋白基因为目的基因转入毕赤酵母GS115。研究结果表明,该表达载体具 有转化操作简单、后期工程菌筛选简便、菌体耐低氧能力强、目的蛋白摇瓶表达量高等优点。该表达载体也可 以通过直接替换目的基因而用于其他蛋白表达系统的开发研究。 展开更多

关键词 透明颤菌血红蛋白基因vgb 毕赤酵母 表达载体ppic9k 人乳铁蛋白

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重组免疫毒素IL3-PE38KDEL真核表达载体的构建

2

作者 白凤霞 娄世峰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期106-108,共3页

目的:构建大肠杆菌-毕赤酵母表达载体Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。方法:用PCR的方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL,再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体Ppic9k-Linker中,得到融合基因Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。重组载体经酶... 目的:构建大肠杆菌-毕赤酵母表达载体Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。方法:用PCR的方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL,再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体Ppic9k-Linker中,得到融合基因Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。重组载体经酶切,菌落PCR鉴定,DNA序列分析插入片段完全正确。结果:经限制性内切酶酶切鉴定,菌落PCR及DNA序列分析表明重组表达载体Ppic9k-IL3-Lin-ker-PE38KDEL构建成功。结论:成功地构建融合基因IL3-PE38KDEL的毕赤酵母表达载体,为后续的蛋白质的表达、纯化及功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 融合基因 IL3 PE38kDEL 真核表达载体 ppic9k

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黑曲霉A9葡萄糖氧化酶基因克隆及其酵母表达载体构建 被引量：3

3

作者 黄亮 郭润芳 +1 位作者 于宏伟 贾英民 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期60-64,共5页

以黑曲霉A9基因组为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)直接对葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行PCR扩增,再将PCR产物克隆入pMD18-T载体,经DNA测序,该基因为1 743 bp,编码581个氨基酸。该基因序列已在GeneBank注册,登录号为DQ836361。用限制性内切... 以黑曲霉A9基因组为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)直接对葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行PCR扩增,再将PCR产物克隆入pMD18-T载体,经DNA测序,该基因为1 743 bp,编码581个氨基酸。该基因序列已在GeneBank注册,登录号为DQ836361。用限制性内切酶切下目的基因,插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成表达载体pPIC9K-GOD。重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-GOD的构建,可望获得超量表达的高活性葡萄糖氧化酶,为研制高品质的酶制剂奠定基础。 展开更多

关键词 黑曲霉 葡萄糖氧化酶 克隆 表达载体ppic9k

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家蚕抗菌肽基因Cecropin-D的克隆及其真核表达载体的构建 被引量：1

4

作者 章玉萍 范涛 +6 位作者 马忠友 代君君 王储言 李瑞雪 吴传华 田善富 肖林珍 《北方蚕业》 2010年第4期18-21,共4页

从家蚕中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了家蚕Cecropin-D基因编码区的cDNA,扩增出家蚕抗茵肽Cecropin-D成熟肽基因片段,重组克隆入pMD18-Tvector载体,经DNA测序,该基因为186bp,编码62个氨基酸。用限制性内切酶... 从家蚕中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了家蚕Cecropin-D基因编码区的cDNA,扩增出家蚕抗茵肽Cecropin-D成熟肽基因片段,重组克隆入pMD18-Tvector载体,经DNA测序,该基因为186bp,编码62个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建真核表达栽体pPlC9K-CD。本实验的研究为获得超量表达的高活性表达抗菌肽Cecropin-D以及为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定了基础。 展开更多

关键词 家蚕 抗菌肽 Cecropin-D 克隆 表达栽体ppic9k

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His标签的水稻硅转运蛋白表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

5

作者 林红梅 方长旬 +4 位作者 林瑞余 何建宇 林伟伟 李颖哲 林文雄 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2016年第5期561-566,共6页

以水稻根系c DNA为模板,PCR扩增含His标签的Lsi1基因开放阅读框,并将该基因克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PIC9k中,PCR及测序验证重组质粒p PIC9k-Lsi1目的基因序列.将验证正确的重组质粒p PIC9k-Lsi1通过SacⅠ酶切线性化,电转到毕赤酵... 以水稻根系c DNA为模板,PCR扩增含His标签的Lsi1基因开放阅读框,并将该基因克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PIC9k中,PCR及测序验证重组质粒p PIC9k-Lsi1目的基因序列.将验证正确的重组质粒p PIC9k-Lsi1通过SacⅠ酶切线性化,电转到毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过MD/MM板筛选出甲醇利用快型的酵母转化子,再通过不同浓度梯度的G418平板筛选多拷贝转化菌株.提取酵母基因组,PCR验证正确的菌株即为工程菌(GS115/p PIC9k-Lsi1).用1%甲醇诱导该工程菌72 h后,收集上清,经SDS-PAGE检测到位于32.8 ku处的目的蛋白即为Si转运蛋白(Os Lsi1). 展开更多

关键词 巴斯德毕赤酵母 Si转运蛋白 ppic9k 异源表达

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鸡α干扰素真核表达载体的改造及在毕赤酵母中的分泌表达 被引量：1

6

作者 曹丁 李学优 +2 位作者 昝继清 兰玲峰 甘祥武 《江苏农业科学》 2019年第19期68-68,69-71,共4页

旨在利用毕赤酵母密码子的偏好性和遗传简并性,将鸡α干扰素优化基因片段cIFN-α2连入毕赤酵母表达载体pPIC9k,再经重叠延伸PCR方法去除重组质粒的5′端非翻译区多余的8个核苷酸GGATCCAA,使其与毕赤酵母AOX1(醇氧化酶)的5′端非翻译区... 旨在利用毕赤酵母密码子的偏好性和遗传简并性,将鸡α干扰素优化基因片段cIFN-α2连入毕赤酵母表达载体pPIC9k,再经重叠延伸PCR方法去除重组质粒的5′端非翻译区多余的8个核苷酸GGATCCAA,使其与毕赤酵母AOX1(醇氧化酶)的5′端非翻译区的序列完全一致,构建并筛选重组毕赤酵母,并进行摇瓶诱导表达试验。将表达产物用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测,并用微量病变抑制法检测其抗病毒效价。抗病毒活性检测结果显示,天然基因、优化基因、质粒5′端非翻译区改造后的优化基因重组质粒表达产物的抗病毒效价分别为10^5、10^6、1.5×10^6 U/mL。鸡α干扰素基因优化后的抗病毒效价提高了10倍,对质粒5′端非翻译区进行进一步改造后,表达蛋白的抗病毒活性提高了50%,从而为鸡α干扰素的工业化生产奠定了基础。 展开更多

关键词 鸡α干扰素 真核表达 ppic9k 分泌表达 抗病毒活性

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草鱼生长激素基因在毕赤酵母中的表达 被引量：4

7

作者 孟亚鹏 徐敏 +5 位作者 代焕梅 丁秀琼 张海英 殷雪 刘世贵 龙章富 《四川动物》 CSCD 北大核心 2006年第1期68-71,共4页

将草鱼生长激素基因(cGH)的cDNA亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,经电击转化导入毕赤巴斯德酵母GS115菌株,获得转化子。菌落PCR技术筛选证实cGH已经整合到了酵母染色体上。对重组酵母进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析,结果表明cGH... 将草鱼生长激素基因(cGH)的cDNA亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,经电击转化导入毕赤巴斯德酵母GS115菌株,获得转化子。菌落PCR技术筛选证实cGH已经整合到了酵母染色体上。对重组酵母进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析,结果表明cGH在毕赤巴斯德酵母GS115菌株中获得了高效表达。 展开更多

关键词 草鱼 生长激素基因 ppic9k表达载体 毕赤酵母 高效表达

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Neuritin毕赤酵母表达系统的构建及其对PC12细胞的影响 被引量：6

8

作者 张树军 赵臣 +4 位作者 狄建军 穆莎茉莉 仙玲玲 于娜 黄瑾 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期148-152,共5页

旨在构建Neuritin的毕赤酵母表达系统获得大量有活性的Neuritin蛋白,研究其神经生物学功能。PCR扩增编码neuritin基因cDNA序列,并纯化回收,通过酶切和连接插入穿梭载体pPIC9K中,转化大肠杆菌DH5α,neuritin-pPIC9k重组质粒经PCR与测序... 旨在构建Neuritin的毕赤酵母表达系统获得大量有活性的Neuritin蛋白,研究其神经生物学功能。PCR扩增编码neuritin基因cDNA序列,并纯化回收,通过酶切和连接插入穿梭载体pPIC9K中,转化大肠杆菌DH5α,neuritin-pPIC9k重组质粒经PCR与测序鉴定后,使用SalⅠ酶切使其线性化,电击转化酵母菌GS115,经筛选与鉴定,成功构建了Neuritin的毕赤酵母表达系统。结果表明,使用甲醇诱导其表达,SDS-PAGE和Western blot分析得到11 kD的Neuritin蛋白,纯化的Neuritin蛋白加入PC12细胞培养液中,能促进其突起的生长。 展开更多

关键词 NEURITIN ppic9k 毕赤酵母表达系统 PC12细胞

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重组人血管内皮生长因子165在Pichia酵母中的表达 被引量：2

9

作者 刘煜 吴国祥 +4 位作者 赵建阳 颜天华 奚涛 沈子龙 成国祥 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期577-581,共5页

目的 :采用基因工程方法构建基因工程菌制备人VEGF1 65蛋白。方法 :自人肿瘤组织中获取人VEGF1 65cDNA ,构建pPIC9K酵母表达载体 ,采用Pichia酵母真核表达系统表达目的蛋白。结果 :SDS PAGE及Western blot结果显示目的蛋白已成功表达。... 目的 :采用基因工程方法构建基因工程菌制备人VEGF1 65蛋白。方法 :自人肿瘤组织中获取人VEGF1 65cDNA ,构建pPIC9K酵母表达载体 ,采用Pichia酵母真核表达系统表达目的蛋白。结果 :SDS PAGE及Western blot结果显示目的蛋白已成功表达。结论 :在Pichia酵母中成功表达人VEGF1 65。 展开更多

关键词 血管内皮生长因子165 巴氏毕赤酵母 ppic9k酵母表达载体 SDS-PAGE WESTERN-BLOT

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人巨细胞病毒重组基因表达质粒的构建 被引量：3

10

作者 郑育声 谢琪璇 +2 位作者 潘善培 芦春斌 肖銮娟 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期716-718,共3页

目的　用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 (Humancytomegalovirus ,HCMV)中抗原性较强的蛋白片段—gp5 2C末端和pp15 0C末端的DNA序列 ,插入pPIC9K质粒 ,构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。方法　根据人巨细胞病毒糖蛋白gp5 2和磷酸蛋... 目的　用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 (Humancytomegalovirus ,HCMV)中抗原性较强的蛋白片段—gp5 2C末端和pp15 0C末端的DNA序列 ,插入pPIC9K质粒 ,构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。方法　根据人巨细胞病毒糖蛋白gp5 2和磷酸蛋白pp15 0C末端的cDNA序列 ,设计出 2对引物。利用PCR的方法 ,以病毒培养液上清为模板 ,进行二轮PCR扩增 ,把两个目的基因串联在一起 ,将所得的DNA片段经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,筛选出阳性转化子 ,并用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果　从人巨细胞病毒培养液上清中扩增出目的基因 ,PCR反应和双酶切鉴定结果与预期相符。 展开更多

关键词 基因表达 人巨细胞病毒 重组PCR 质粒ppic9k

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毕赤酵母分泌表达SAMS及表达产物活性分析

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作者 王莲哲 张现青 +2 位作者 李洋 杨广笑 何光源 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第10期4427-4429,4432,共4页

[目的]利用毕赤酵母分泌表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)。[方法]以酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)基因组DNA为模板,通过PCR扩增出S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因2(sam2),构建重组毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9Ks-am2,转化毕... [目的]利用毕赤酵母分泌表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)。[方法]以酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)基因组DNA为模板,通过PCR扩增出S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因2(sam2),构建重组毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9Ks-am2,转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达分泌蛋白SAM合成酶,并用HPLC测定重组蛋白的酶活力。[结果]经SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量约50kD,比理论值42.5 kD稍大,可能是分泌过程中糖基化等加工造成。体外酶促反应结果显示,伴随甲醇诱导及初步纯化过程的进行,蛋白活力逐步提高,纯化后比活力为61.48 U/mg。[结论]该研究首次实现了SAM合成酶的胞外表达,为开发和建立体外酶促法生产SAM工艺奠定了基础。 展开更多

关键词 SAM 毕赤酵母 ppic9k 分泌表达

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低温脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达 被引量：2

12

作者 王永杰 沈继红 +2 位作者 丛柏林 林学政 黄晓航 《极地研究》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期283-288,共6页

通过PCR技术扩增得到南极适冷菌低温脂肪酶基因lip-948,将其与表达载体pPIC9K连接后转化巴斯德毕赤酵母GS115,通过筛选得到高效表达低温脂肪酶的酵母菌株,该菌株发酵48 h后上清液中脂肪酶活力达到27.5 U.mL-1,普遍高于其他细菌低温脂肪... 通过PCR技术扩增得到南极适冷菌低温脂肪酶基因lip-948,将其与表达载体pPIC9K连接后转化巴斯德毕赤酵母GS115,通过筛选得到高效表达低温脂肪酶的酵母菌株,该菌株发酵48 h后上清液中脂肪酶活力达到27.5 U.mL-1,普遍高于其他细菌低温脂肪酶在毕赤酵母中的表达活性。 展开更多

关键词 低温脂肪酶 表达载体ppic9k 巴斯德毕赤酵母 高效表达

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