p16逆转录病毒载体的构建及其高滴度克隆的杂交筛选 被引量：6

1

作者 武莎莎 王申五 +1 位作者 马丽萍 曹国栋 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 2000年第1期82-85,共4页

构建多肿瘤抑制基因 p1 6( mts- 1 )的逆转录病毒载体 ,用一种简便的非放射性杂交方法 ,从多个包装细胞克隆中筛选出病毒滴度高的克隆 ,以提高病毒转导效率 .以 p1 6c DNA全长为目的基因 ,构建逆转录病毒载体 p LMSN,非脂质体转染试剂... 构建多肿瘤抑制基因 p1 6( mts- 1 )的逆转录病毒载体 ,用一种简便的非放射性杂交方法 ,从多个包装细胞克隆中筛选出病毒滴度高的克隆 ,以提高病毒转导效率 .以 p1 6c DNA全长为目的基因 ,构建逆转录病毒载体 p LMSN,非脂质体转染试剂转染兼性包装细胞 PT67,G41 8筛选抗性克隆 ,扩增单个克隆后提取包装细胞上清的病毒 RNA( v RNA) ,以碱性磷酸酶直接标记的目的基因为探针作斑点杂文 ,化学发光自显影法定量测定 ,在短时间内从多个候选克隆中筛选出高产毒的克隆 .为 p1 6基因治疗的实验研究奠定了物质基础 . 展开更多

关键词 p16逆转录病毒载体 vRNA斑点杂交 病毒滴度

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人乳头瘤病毒16 E7(HPV16E7)逆转录病毒载体的构建 被引量：3

2

作者 何清义 李起鸿 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期537-539,共3页

目的　构建人乳头瘤病毒 16型E7基因片段 (HPV16E7)的逆转录病毒载体。方法　PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段 ,并用酶切、连接等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上 ,然后再用酶切、测序进行鉴定。通过Genbank的数据库分析软件... 目的　构建人乳头瘤病毒 16型E7基因片段 (HPV16E7)的逆转录病毒载体。方法　PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段 ,并用酶切、连接等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上 ,然后再用酶切、测序进行鉴定。通过Genbank的数据库分析软件对HPV16E7进行同源性分析。结果　经酶切分析、测序证明 ,从HPV16cDNA克隆的 30 0bp的HPV16E7与逆转录病毒载体发生了基因重组 ,HPV16E7基因片段与数据库中的原HPV16cDNA的E7有高度的同源性。结论　构建了含HPV16E7的逆转录病毒载体 ,为人关节软骨细胞的基因转染打下了基础。 展开更多

关键词 HpV16E7 逆转录病毒载体 构建

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逆转录病毒载体介导shRNA对人胚胎肾细胞中p53基因的沉默作用 被引量：3

3

作者 刘扬 马淑梅 +6 位作者 刘晓冬 金顺子 徐瑞明 武宁 赵银龙 龚守良 刘树铮 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期228-231,共4页

目的:检测逆转录病毒载体介导的小发夹环RNA(small hairpin RNA,shRNA)对人胚胎肾细胞(HEK293)中p53基因的干扰作用。方法:将人H1启动子由XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点插入CMV启动子上游,人CD4基因替代匀霉素抗性基因,作为检测标志。针对人... 目的:检测逆转录病毒载体介导的小发夹环RNA(small hairpin RNA,shRNA)对人胚胎肾细胞(HEK293)中p53基因的干扰作用。方法:将人H1启动子由XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点插入CMV启动子上游,人CD4基因替代匀霉素抗性基因,作为检测标志。针对人野生型p53基因设计的shRNA被连接在H1启动子的下游,构建含有shRNA的逆转录病毒载体LTRH1-p53,即RNAi表达载体;利用流式细胞术检测逆转录病毒感染HEK293细胞72 h后细胞内P53蛋白水平的变化。结果:成功构建LTRH1-p53载体,该载体感染HEK293细胞后72 h,与感染空病毒载体LTRH1组相比,P53蛋白表达降至空病毒载体LTRH1组的69%(P<0.01)。结论:LTRH1-p53表达载体成功使p53基因沉默,shRNA表达载体的使用为基因功能研究提供有力工具。 展开更多

关键词 RNA干扰 基因 p53 逆转录病毒载体 SHRNA

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逆转录病毒介导p16基因转移引起K562白血病细胞系的增殖抑制 被引量：1

4

作者 武莎莎 曹国栋 +2 位作者 陈德喜 潘秀英 王申五 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2000年第2期114-117,共4页

关键词 肿瘤抑制基因 p16 逆转录病毒 白血病细胞系

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新疆维吾尔族妇女子宫颈鳞状细胞癌中人乳头瘤病毒16感染和p33^(ING1b)及端粒酶逆转录酶催化亚单位表达的相关性 被引量：2

5

作者 玛依努尔.尼亚孜 刘芳 +4 位作者 朱开春 戴建霞 阿也提.司马义 王琳 昆多孜.乌赛那洪 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期592-596,共5页

目的探讨新疆维吾尔族妇女子宫颈鳞状细胞癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)16感染和p33ING1b及端粒酶逆转录酶催化亚单位(hTERT)表达的相关性。方法采用免疫组织化学方法检测了50例子宫颈鳞状细胞癌(SCC)和34例子宫颈上皮内瘤变(CIN)p33ING1b... 目的探讨新疆维吾尔族妇女子宫颈鳞状细胞癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)16感染和p33ING1b及端粒酶逆转录酶催化亚单位(hTERT)表达的相关性。方法采用免疫组织化学方法检测了50例子宫颈鳞状细胞癌(SCC)和34例子宫颈上皮内瘤变(CIN)p33ING1b和hTERT表达情况,PCR法检测HPV16感染情况,并与12例正常子宫颈进行对照。结果对照组、CIN1组、CIN2～3组和SCC组中HPV16感染率分别为0、22.2%、44.0%和74.0%,各组间差异有显著性(x2=26.537,P=0.000);p33ING1b阳性率分别为91.7%、77.7%、68.0%和36.0%,各组间差异有显著性(x2=38.943,P=0.000);hTERT阳性率分别为50.0%、66.6%、88.0%和94.0%,各组间差异也有显著性(x2=48.199,P=0.000)。HPV16感染与p33ING1b表达呈负相关(r=-0.294,P=0.004),与hTERT表达呈正相关(r=0.286,P=0.005);p33ING1b表达与hTERT表达呈负相关(r=-0.361,P=0.000)。结论HPV16感染可能与新疆维吾尔族妇女子宫颈SCC组织中p33ING1b表达下降及hTERT表达增加有关。 展开更多

关键词 子宫颈鳞状细胞癌 p33^ING1B 人端粒酶逆转录酶催化亚单位 人乳头瘤病毒16 维吾尔族

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含野生型p53cDNA重组逆转录病毒的制备

6

作者 李艳利 王若宁 +1 位作者 张一鸣 陈丙莺 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期299-300,共2页

目的:制备含野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法:设计引物PCR扩增野生型p53cDNA,用T-A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109,提取pGEM-T/p53重组体,双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN,... 目的:制备含野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法:设计引物PCR扩增野生型p53cDNA,用T-A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109,提取pGEM-T/p53重组体,双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌JM109,筛选pL(p53cDNA)SN重组体,脂质体法转染包装细胞AM12,G-418(geneticin)筛选,收集病毒液。结果:通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆,收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒。结论:含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究。 展开更多

关键词 野生型p53 CDNA 逆转录病毒表达载体

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逆转录病毒介导的野生型p53基因对原位肺癌的治疗效应

7

作者 马施华 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1995年第1期38-38,共1页

非小细胞肺癌(NSCLC)在所有肺癌中所占比例比较高．达75％-80％．但所有治疗措施中仅10%有一定效果，其它均不能令人满意。随着科学的发展．人们从分子水平上对其发病机理的了解也越来越深刻，并逐渐认识到，这类癌症的发生与多基因的... 非小细胞肺癌(NSCLC)在所有肺癌中所占比例比较高．达75％-80％．但所有治疗措施中仅10%有一定效果，其它均不能令人满意。随着科学的发展．人们从分子水平上对其发病机理的了解也越来越深刻，并逐渐认识到，这类癌症的发生与多基因的变异有关．其中，p53抑癌基因的突变(如Tp53)在人类肺癌中最为普遍，因此，肺癌细胞中野生型p53功能的恢复有可能抑制肿瘤细胞的生长。本研究观察了表达野生型p53的逆转录病毒载体应用于原位肺癌的治疗效果。 展开更多

关键词 肺癌 野生型p53基因 治疗效应 逆转录病毒介导 瘤细胞 类癌 Tp53 人类 逆转录病毒载体 分子水平

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稳定表达猪水疱病病毒P1基因的PK-15细胞系的建立 被引量：2

8

作者 田宏 吴锦艳 +5 位作者 龚真莉 郑海学 孙世琪 尚佑军 刘湘涛 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期478-482,共5页

从猪水疱病全长感染性cDNA中,应用PCR技术扩增到SVDV结构蛋白P1基因,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒... 从猪水疱病全长感染性cDNA中,应用PCR技术扩增到SVDV结构蛋白P1基因,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒,在Polybrene的介导下感染PK-15细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。免疫荧光连续检测阳性克隆传代细胞,发现在不同代次的细胞中均有SVDV P1蛋白表达,而且表达的蛋白可被SVD阳性血清所识别;同时应用PCR技术,可从体外反复传代阳性细胞基因组中扩增到SVD P1基因。表明本次所筛选的阳性细胞克隆不但能持续稳定地表达SVD P1蛋白,而且可携带外源基因进行传代,具有良好的遗传稳定性。 展开更多

关键词 猪水疱病病毒p1基因 重组逆转录病毒载体 pK-15细胞 基因表达

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体外转染野生型p16-基因对兔血管平滑肌细胞生长的抑制作用 被引量：1

9

作者 张亚文 张国元 黄长晖 《中国循环杂志》 CSCD 北大核心 2000年第1期48-50,共3页

目的 :研究体外转染外源性野生型 p16基因对兔血管平滑肌细胞生长的影响。　　方法 :构建野生型 p16基因的重组逆转录病毒载体 ,并体外转染兔血管平滑肌细胞 ,应用 Northern blot及 Westernblot检测外源 p16基因的表达 ,并用四唑盐 ( M... 目的 :研究体外转染外源性野生型 p16基因对兔血管平滑肌细胞生长的影响。　　方法 :构建野生型 p16基因的重组逆转录病毒载体 ,并体外转染兔血管平滑肌细胞 ,应用 Northern blot及 Westernblot检测外源 p16基因的表达 ,并用四唑盐 ( MTT)法及流式细胞仪检测其对细胞生长的抑制作用。　　结果 :逆转录病毒载体可有效地将外源性 p16基因导入平滑肌细胞 ,表达 P16蛋白 ,并显著抑制血管平滑肌细胞的生长使细胞滞留于 G1 期。　　结论 :体外转染外源性野生型 p16基因可有效抑制血管平滑肌细胞的生长。 展开更多

关键词 p16基因 逆转录病毒载体 血管平滑肌细胞 抑制

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p53基因转导诱发慢性髓性白血病患者骨髓细胞凋亡 被引量：1

10

作者 马丽萍 童春荣 +1 位作者 王申五 陈德喜 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 1999年第1期79-80,共2页

研究及应用细胞凋亡相关基因参与肿瘤治疗是基因治疗的一个重要领域。细胞凋亡相关基因中研究得最深入的是p53基因。已经有报道转移野生型p53基因抑制肿瘤细胞的体外实验,或转p53基因抑制动物体内成瘤性的实验。为进一步接近人体内基因... 研究及应用细胞凋亡相关基因参与肿瘤治疗是基因治疗的一个重要领域。细胞凋亡相关基因中研究得最深入的是p53基因。已经有报道转移野生型p53基因抑制肿瘤细胞的体外实验,或转p53基因抑制动物体内成瘤性的实验。为进一步接近人体内基因治疗,我们采用逆转录病毒载体将p53基因转导至CML细胞,初步的实验结果提示,转导的p53基因能引起白血病细胞生长抑制和凋亡。 展开更多

关键词 p53基因 逆转录病毒载体 基因转导 细胞凋亡 慢性髓性白血病

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外源性野生型p53基因对人肺腺癌细胞系GLC-82的生物学效应

11

作者 李萍 丁振若 +3 位作者 任力强 于文彬 饶国洲 苏明权 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 1997年第4期28-31,共4页

目的：研究外源性野生型ｐ５３基因对人肺腺癌细胞系ＧＬＣ－８２的生物学作用。方法：将含有野生型ｐ５３基因的ｐＤＯＲ－ｎｅｏ逆转录病毒载体，通过ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染ＧＬＣ－８２细胞，用流式细胞仪、电镜及３Ｈ－ＴｄＲ掺... 目的：研究外源性野生型ｐ５３基因对人肺腺癌细胞系ＧＬＣ－８２的生物学作用。方法：将含有野生型ｐ５３基因的ｐＤＯＲ－ｎｅｏ逆转录病毒载体，通过ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染ＧＬＣ－８２细胞，用流式细胞仪、电镜及３Ｈ－ＴｄＲ掺入法，观察野生型ｐ５３基因对ＧＬＣ－８２细胞的生物学效应。结果：电镜观察可见，转染野生型ｐ５３基因，可使ＧＬＣ－８２细胞出现一些病理现象，如胞浆中有明显的空泡及线粒体肿胀；流式细胞仪分析显示，野生型ｐ５３基因可阻止ＧＬＣ－８２细胞周期停止于Ｇ１～Ｓ区；３Ｈ－ＴｄＲ掺入试验提示，野生型ｐ５３基因能够抑制ＧＬＣ－８２细胞ＤＮＡ的合成。结论：这些结果阐明了野生型ｐ５３基因是抑制ＧＬＣ－８２细胞生长的部分机理。 展开更多

关键词 p53基因 GLC-82 基因转染 逆转录病毒载体

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p53抑癌基因在血管平滑肌细胞增殖和内皮剥脱再狭窄形成中的作用 被引量：1

12

作者 董薇 朱小君 +4 位作者 刘勃 邱京欣 付爱华 李岱宗 周爱儒 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 1994年第S1期140-141,共2页

ｐ５３抑癌基因在血管平滑肌细胞增殖和内皮剥脱再狭窄形成中的作用董薇，朱小君，刘勃，邱京欣北京医科大学心血管基础研究所付爱华，李岱宗，周爱儒癌基因和抗癌基因在细胞增殖和分化中具有重要作用。我们曾经提出癌基因表达过盛或抗... ｐ５３抑癌基因在血管平滑肌细胞增殖和内皮剥脱再狭窄形成中的作用董薇，朱小君，刘勃，邱京欣北京医科大学心血管基础研究所付爱华，李岱宗，周爱儒癌基因和抗癌基因在细胞增殖和分化中具有重要作用。我们曾经提出癌基因表达过盛或抗癌基因表达不足可能是细胞增殖的重要... 展开更多

关键词 内皮剥脱 p53 再狭窄 抑癌基因 抗癌基因 细胞增殖 血管平滑肌细胞 基础研究所 逆转录病毒载体 内皮细胞损伤

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