牛轮状病毒UK株NSP1基因序列分析及原核表达 被引量：2

1

作者 冉旭华 曹思 +4 位作者 张峣 魏晓曼 闻晓波 倪宏波 朱战波 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第5期1104-1109,共6页

轮状病毒是引起多种幼龄动物及5周龄以下儿童腹泻的主要病原体。NSP1非结构蛋白是轮状病毒基因5的产物,为长约55ku的RNA结合蛋白。现已发现NSP1蛋白是一种毒力决定因子,可颉颃宿主先天性免疫应答。参照GenBank收录的牛轮状病毒UK株序列... 轮状病毒是引起多种幼龄动物及5周龄以下儿童腹泻的主要病原体。NSP1非结构蛋白是轮状病毒基因5的产物,为长约55ku的RNA结合蛋白。现已发现NSP1蛋白是一种毒力决定因子,可颉颃宿主先天性免疫应答。参照GenBank收录的牛轮状病毒UK株序列设计并合成1对特异性引物,本试验利用RT-PCR方法扩增牛轮状病毒UK株NSP1基因,克隆入pET-28a(+)表达载体,经双酶切和测序鉴定,并利用分子生物学软件进行同源性比对分析。本试验结果显示获得的NSP1基因全长编码区序列为1 473bp,编码491个氨基酸,与美国WC3株同源性最高。将阳性重组质粒转入E.coli Rosetta(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析,结果表明重组蛋白分子质量约为55ku,以包涵体形式表达,可与鼠抗His-tag抗体反应。本试验成功获得牛轮状病毒UK株NSP1基因,且实现了在原核表达系统中高效表达重组蛋白,本试验结果为研究NSP1蛋白在细胞内定位与其活性之间的相互关系奠定了基础。 展开更多

关键词 牛轮状病毒UK株 nsp1 序列分析 原核表达

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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α(nsp1α)的N端锌指结构是其抑制NLRP3炎症小体活性所必需 被引量：2

2

作者 王超 史西保 +5 位作者 王丽 陈静 司朝朝 王爱萍 邓瑞广 张改平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期2032-2039,共8页

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害养猪业的病毒性传染病之一,其致病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抑制宿主的天然免疫和特异性免疫反应,引起机体免疫抑制,造成持续性感染,从而给该病的防控带来困难。NLRP3炎症小体作为先天性免疫... 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害养猪业的病毒性传染病之一,其致病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抑制宿主的天然免疫和特异性免疫反应,引起机体免疫抑制,造成持续性感染,从而给该病的防控带来困难。NLRP3炎症小体作为先天性免疫的重要组分在机体抗病毒中发挥重要作用。前期研究发现PRRSV能够激活NLRP3炎症小体,但PRRSV是否存在拮抗NLRP3炎症小体的组分还未见报道。本研究首先在缺失内源性炎症小体的HEK293T细胞中,共转染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四个真核表达质粒,建立NLRP3炎症小体的体外研究模型。然后,在该炎症小体模型细胞和猪肺泡巨噬细胞中,转染PRRSV nsp1α的真核表达质粒,结果表明nsp1α能够明显拮抗炎症小体的活化,而进一步的突变试验表明缺失N端锌指(ZF)结构或者突变ZF结构的nsp1α均不能抑制NLRP3炎症小体活化。本研究不仅首次发现了拮抗NLRP3炎症小体活化的PRRSV蛋白——nsp1α,而且发现nsp1α的N端锌指结构是其抑制NLRP3炎症小体活性所必需。本研究进一步发现了PRRSV拮抗天然免疫的新机制,并为PRRSV的防控提供了潜在的分子靶点和理论指导。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp1α ZF结构域 NLRP3炎症小体 IL-1Β

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马尾松毛虫质型多角体病毒NSP1蛋白在昆虫细胞表达及定位

3

作者 靳亮 许翠萍 +5 位作者 王金昌 关丽梅 张稳超 黄朝 高学梅 王洪秀 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期208-214,共7页

马尾松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus,Dp CPV)基因组S5片段编码一个由881个氨基酸组成、分子量为101 k D的非结构蛋白(NSP1)。为探寻Dp CPV NSP1蛋白的功能,将Dp CPV 1基因组S5-1片段的抗原... 马尾松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus,Dp CPV)基因组S5片段编码一个由881个氨基酸组成、分子量为101 k D的非结构蛋白(NSP1)。为探寻Dp CPV NSP1蛋白的功能,将Dp CPV 1基因组S5-1片段的抗原区(1-600 bp)进行了原核表达,并将纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。将稀释后的病毒液感染甜菜夜蛾幼虫,感染后每天解剖甜菜夜蛾并取中肠样品,通过Western blot检测NSP1蛋白的合成时间曲线。Western blot检测结果显示,S5片段表达的蛋白在病毒感染第1天就有合成,并且除了检测到全长的蛋白(101 k D)外,也检测到了80 k D和20 k D的蛋白条带,说明NSP1蛋白为早期表达蛋白,并且蛋白发生了切割。另外,首次对Dp CPV 1 S5片段进行了在昆虫细胞中表达和昆虫亚细胞定位,结果显示,昆虫细胞定位于细胞的细胞质。 展开更多

关键词 马尾松毛虫质型多角体病毒 nsp1 抗体制备 真核表达 细胞定位

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp1蛋白锌指结构1(ZF1)突变体的构建及活性鉴定

4

作者 赵鹏伟 吴家强 +8 位作者 杜以军 李俊 孙文博 丛晓燕 时建立 彭军 于江 刘月月 王金宝 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第6期1-6,共6页

本试验旨在构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)SX-1株非结构蛋白Nsp1的真核表达质粒,并对Nsp1蛋白锌指结构1(ZF1)进行定点突变,检测其在真核细胞中的表达活性。利用TRIzol法提取总RNA,RT-PCR扩增Nsp1目的基因,经双酶切构建pC... 本试验旨在构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)SX-1株非结构蛋白Nsp1的真核表达质粒,并对Nsp1蛋白锌指结构1(ZF1)进行定点突变,检测其在真核细胞中的表达活性。利用TRIzol法提取总RNA,RT-PCR扩增Nsp1目的基因,经双酶切构建pCI-neo-Nsp1真核表达质粒后对Nsp1蛋白锌指结构1的8C、10C、25C和28C的4个位点进行定点突变,成功获得分别突变为A和S的8个突变体。转染HeLa细胞,通过间接免疫荧光方法(IFA)和Western blotting检测Nsp1蛋白的活性。IFA结果显示,Flag抗体检测时蛋白质主要分布在细胞质和细胞核中,Myc抗体检测时蛋白质主要分布在细胞核中。Western blotting结果显示,Flag抗体检测时,S突变体出现大小约为44和20ku条带,A突变体出现约为44ku条带;Myc抗体检测时,S突变体出现大小约为44和27ku条带,A突变体出现大小约为44ku条带。试验结果表明,本试验成功构建了Nsp1突变体的真核表达质粒,证实其能在真核细胞中表达,为进一步研究Nsp1蛋白的锌指结构是否对机体Ⅰ型IFN产生起下调作用提供基础。 展开更多

关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒SX-1株 nsp1 突变体构建 活性鉴定

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百脉根结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2的相互作用 被引量：4

5

作者 胡晓晶 储晓洁 +2 位作者 康恒 朱辉 张忠明 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期132-137,共6页

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,对其根瘤菌共生信号转导途径和作用机制的研究,有助于揭示根瘤菌与豆科植物共生关系建立和共生体形成的奥秘。本研究利用酵母双杂交系统和体外蛋白质相互作用技术,证明百脉根GARS类家... 豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,对其根瘤菌共生信号转导途径和作用机制的研究,有助于揭示根瘤菌与豆科植物共生关系建立和共生体形成的奥秘。本研究利用酵母双杂交系统和体外蛋白质相互作用技术,证明百脉根GARS类家族转录因子结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2在体外体内均可以相互作用,并将相互作用的位点定位在NSP1的GRAS结构域的LHRII区域和NSP2的LHRI区内。 展开更多

关键词 百脉根 结瘤信号通道蛋白nsp1 结瘤信号通道蛋白NSP2 共生信号转导 酵母双杂交

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猪流行性腹泻病毒NSP1蛋白在细胞器中定位特性

6

作者 季朝阳 张莎 +4 位作者 石达 陈建飞 时洪艳 张鑫 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期842-844,共3页

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白1(NSP1)在Vero E6细胞中的分布和亚细胞定位情况,本研究采用RT-PCR方法扩增NSP1基因,并将其克隆至真核表达载体pAcGFP-C1中构建重组质粒pAcGFPNSP1。将pAcGFP-NSP1转染至Vero E6细胞中进行瞬时表... 为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白1(NSP1)在Vero E6细胞中的分布和亚细胞定位情况,本研究采用RT-PCR方法扩增NSP1基因,并将其克隆至真核表达载体pAcGFP-C1中构建重组质粒pAcGFPNSP1。将pAcGFP-NSP1转染至Vero E6细胞中进行瞬时表达,并收集转染后48 h的细胞进行western blot检测。通过激光共聚焦显微镜观察NSP1在细胞中的定位情况。结果表明,NSP1在Vero E6细胞中表达,其主要定位于细胞质中,与细胞中的线粒体、内质网、高尔基体均呈现高度共定位。本研究在Vero E6细胞中表达了PEDV NSP1蛋白,并首次对其亚细胞定位进行了解析,为进一步了解病毒的复制及其致病机制的研究提供了依据。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 nsp1 VERO E6细胞 亚细胞定位

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新冠病毒Nsp1蛋白结构与功能的生物信息学分析及原核表达 被引量：6

7

作者 刘玲 李璟 +7 位作者 范蕾 宣焱 杜淼 张德玖 李卓禧 陈晓聪 杨娅男 徐本锦 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期566-576,共11页

目的Nsp1是新冠病毒的主要毒力因子,介导了病毒在宿主细胞中的免疫逃逸,扩大了病毒感染范围。本研究对Nsp1进行系统生信分析及原核表达,有助于全面理解该蛋白在新冠病毒侵染宿主细胞中的分子机理。方法采用Pfam、TMHMM、ProtScale、ExP... 目的Nsp1是新冠病毒的主要毒力因子,介导了病毒在宿主细胞中的免疫逃逸,扩大了病毒感染范围。本研究对Nsp1进行系统生信分析及原核表达,有助于全面理解该蛋白在新冠病毒侵染宿主细胞中的分子机理。方法采用Pfam、TMHMM、ProtScale、ExPASy和SignalP 4.0等工具对Nsp1的翻译后修饰、理化性质、跨膜螺旋、相互作用网络、同源性及进化特点等进行系统分析;利用分子克隆技术构建重组表达载体pET-22b-Nsp1并进行原核表达。结果Nsp1由180个氨基酸组成,分子量19.78 kDa,等电点为5.36,不稳定指数28.83,在哺乳动物中的半衰期约30 h,在大肠杆菌内超过10 h,有12个可能的磷酸化位点和3个O-糖基化位点,无信号肽和跨膜螺旋,亲水性较强;二级结构分析显示,Nsp1中无规则卷曲占比最高(45.00%),其次是α螺旋(25.56%)和延伸链(20.56%),β-转角占比最低(8.89%);序列对比和进化分析显示,与SARS-CoV-2 Nsp1序列一致性最高的是蝙蝠非典型冠状病毒WIV1(85.0%);原核表达发现Nsp1主要在沉淀中表达,经质谱鉴定目的蛋白就是Nsp1。结论本研究为新冠病毒Nsp1的表达、纯化及功能分析提供了重要借鉴,有助于进一步揭示Nsp1的生物学功能及开展相关抑制剂和抗病毒药物的研发。 展开更多

关键词 新冠病毒 nsp1蛋白 生信分析 结构与功能 进化分析

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新型冠状病毒Nsp1基因真核表达载体的构建及对宿主蛋白质翻译的影响 被引量：1

8

作者 王宏宇 田志飘 +8 位作者 刘红线 郑亮 于雯 吴志军 Matthew Kay 高振秋 曹宏伟 耿荣庆 张华 《黑龙江八一农垦大学学报》 2024年第1期84-90,共7页

非结构蛋白1(Non-structural protein 1,Nsp1)作为新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)的毒力决定因子,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为更有效地研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的生物学功能,成... 非结构蛋白1(Non-structural protein 1,Nsp1)作为新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)的毒力决定因子,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为更有效地研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的生物学功能,成功构建SARS-CoV-2Nsp1基因的真核表达载体,并验证其抑制宿主及外源蛋白质翻译的功能。通过PCR技术扩增SARS-CoV-2Nsp1基因后,利用同源重组技术将其连接至pEGFP-N1载体上。经双酶切和测序结果鉴定,SARS-CoV-2Nsp1基因成功克隆至pEGFP-N1载体上。将重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1转染至HEK-293T细胞和HeLa细胞中,经嘌呤霉素标记后,利用Western Blot和考马斯亮蓝染色检测重组质粒的表达以及嘌呤霉素信号。结果表明,重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1在HEK-293T细胞和HeLa细胞中成功表达,并验证其抑制宿主蛋白质和外源转入细胞蛋白质的翻译,为更深入研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的功能奠定基础。 展开更多

关键词 新型冠状病毒 nsp1基因 真核载体构建 蛋白翻译

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基孔肯雅病毒nsP1单克隆抗体制备及其在快速检测中的应用

9

作者 周婷婷 杨展 +3 位作者 常永和 周东明 朱进 郑峰 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2022年第2期136-140,共5页

目的基孔肯雅病毒(CHIKV)广泛分布于非洲、南亚以及东南亚地区。文章拟制备抗CHIKV nsP1蛋白单克隆抗体,建立CHIKV的现场快速检测方法。方法合成nsP1编码基因序列,构建原核表达载体pET28a-nsP1,大肠埃希菌表达并纯化获得重组nsP1蛋白,... 目的基孔肯雅病毒(CHIKV)广泛分布于非洲、南亚以及东南亚地区。文章拟制备抗CHIKV nsP1蛋白单克隆抗体,建立CHIKV的现场快速检测方法。方法合成nsP1编码基因序列,构建原核表达载体pET28a-nsP1,大肠埃希菌表达并纯化获得重组nsP1蛋白,免疫小鼠后用常规方法制备筛选可稳定分泌nsP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株.SDS-PAGE和ELISA鉴定抗体特异性,并建立免疫学检测方法。结果成功获得了6株阳性细胞株,纯化和筛选得到特异性良好的抗nsP1配对单克隆抗体,建立的双抗夹心ELISA法能特异性检测nsP1抗原,并在此基础上建立了可快速检测CHIKV的胶体金免疫层析方法。结论成功建立了针对CHIKV抗原的免疫学检测方法,为CHIKV感染早期诊断增加了技术储备。 展开更多

关键词 基孔肯雅病毒 nsp1蛋白 单克隆抗体 胶体金

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通过猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp1β的晶体结构揭示了一种新的金属依赖核酸酶

10

作者 Xue F 胡小华 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第6期98-98,共1页

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)属于套式病毒目(Nidovirales),动脉炎病毒科(Arteriviridae),是猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrom,PRRS)的病原,PRR... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)属于套式病毒目(Nidovirales),动脉炎病毒科(Arteriviridae),是猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrom,PRRS)的病原,PRRS的流行给养猪业造成了巨大的经济损失。作为PRRSV基因组编码的第2个蛋白质,Nsp1可以通过C末端的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(papain-likecysteine protease,PCP)将自己从Nsp2下游切割下来。虽然已知Nsp1与病毒毒力有关,但其在病毒感染过程的确切作用仍不清楚。本试验描述了PRRSV Nsp1天然的同型二聚体晶体结构,通过采用一个类似组装了几个已知核酸酶的折叠(其在体外用锰离子可激发较强的核酸酶活性)来研究了PRRSV Nsp1N末端的体系结构。通过标记的核酸酶,识别Nsp1的关键特性:具有C端木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶区域(负责将Nsp1β从Nsp2上自行解离下来),连接NTD和PCP的接头(LKD),以及C末端的延展区(CTE),推测其位于PCPβ区域的结合位点相对较稳定。综合以往关于核定位的报道,多关注于Nsp1β的自处理模式及预测生物学功能,本研究为开发多靶位新药提供了模板。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 非结构蛋白nsp1β 核酸酶 晶体结构

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盖塔病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

11

作者 顾志刚 郭洁真 +4 位作者 王子涵 孙彤 陈鸿军 孙竹筠 陈丹清 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期112-118,共7页

盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒,可通过蚊虫传播感染人畜,导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状,可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列,设计3组引... 盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒,可通过蚊虫传播感染人畜,导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状,可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列,设计3组引物探针,筛选出最佳的引物探针,建立一种灵敏度高、特异性强的针对盖塔病毒的TaqMan探针实时荧光定量RTPCR检测方法。对该方法进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品检测。标准曲线Ct值与相应质粒标准品浓度存在良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9989;对含GETV基因的重组质粒pCDNA3.1-nsP1体外转录RNA进行敏感性试验,最低检出限达10 copies,是普通RT-PCR方法的1000倍,敏感性高;与PRRSV、CSFV与PEDV的核酸不发生交叉反应,特异性好;变异系数小于2%,重复性好。本研究建立了一种敏感、特异的GETV检测方法,对GETV的快速诊断具有重要意义。 展开更多

关键词 盖塔病毒 nsp1 TAQMAN探针 实时荧光定量RT-PCR

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轮状病毒拮抗宿主先天性免疫机制研究进展 被引量：4

12

作者 刘阳阳 冉旭华 闻晓波 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期659-664,共6页

轮状病毒(Rotavirus,RV)是世界范围内引起婴幼儿和多种幼龄动物严重肠胃炎的主要病原之一,全世界每年有近50万婴幼儿因感染轮状病毒而死亡。轮状病毒对IFN介导的抗病毒效应敏感,因此,为了拮抗宿主先天性免疫,轮状病毒非结构蛋白1(NSP1)... 轮状病毒(Rotavirus,RV)是世界范围内引起婴幼儿和多种幼龄动物严重肠胃炎的主要病原之一,全世界每年有近50万婴幼儿因感染轮状病毒而死亡。轮状病毒对IFN介导的抗病毒效应敏感,因此,为了拮抗宿主先天性免疫,轮状病毒非结构蛋白1(NSP1)通过作用于IFN表达通路的多个成分,如IFN调节因子家族(IRFs),转录因子NF-κB,细胞胞质模式识别受体RIG-I等来拮抗宿主先天性免疫。此外轮状病毒NSP2、VP2、VP3和NSP4蛋白也发挥了一定的拮抗作用。本文综述了轮状病毒拮抗机体先天性免疫的相关机制,为轮状病毒的分子生物学研究和疫苗、治疗性药物的研制提供参考。 展开更多

关键词 轮状病毒 nsp1 先天性免疫 干扰素

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轮状病毒感染的免疫逃避及病理损伤机制 被引量：4

13

作者 杨志元 刘阳阳 闻晓波 《现代畜牧兽医》 2017年第6期48-52,共5页

轮状病毒(Rotavirus,RV)是一种人兽共患病病原,能够引起幼龄动物和婴幼儿发生腹泻疾病,危害人和动物身体健康。目前尚无特效治疗药治疗该病。RV NSP1是其逃避宿主先天性免疫应答的关键蛋白,具有介导IRFs、RIG-I、β-Tr CP、TRAFs和STAT... 轮状病毒(Rotavirus,RV)是一种人兽共患病病原,能够引起幼龄动物和婴幼儿发生腹泻疾病,危害人和动物身体健康。目前尚无特效治疗药治疗该病。RV NSP1是其逃避宿主先天性免疫应答的关键蛋白,具有介导IRFs、RIG-I、β-Tr CP、TRAFs和STATs等宿主免疫应答通路中的重要分子降解的功能,从而逃避宿主免疫。RV在感染宿主细胞过程中,可以破坏微循环,感染导致小肠绒毛细胞死亡脱落;RV NSP4蛋白介导多种离子非正常转运;刺激肠神经系统等多种途径致使机体产生病理损伤,发生腹泻甚至严重可致死亡。了解轮状病毒感染后的免疫逃避机制和病理损伤机制对于研制高效疫苗和靶向药物具有一定的指导意义。 展开更多

关键词 轮状病毒 nsp1 先天性免疫 免疫逃避 病理损伤

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牛轮状病毒拮抗人源宿主细胞RLRs通路关键因子的分析

14

作者 刘阳阳 冉旭华 +1 位作者 曹思 闻晓波 《现代畜牧兽医》 2017年第6期1-7,共7页

目前以牛轮状病毒为亲本的人-牛重配口服疫苗临床试验保护效果不佳,可能与免疫抑制有关。为了探讨牛轮状病毒对人源宿主RLRs免疫通路的影响,将牛轮状病毒UK株感染Caco-2细胞6 h/12 h/24 h后,检测IRF3、IRF7、RIG-I和MDA5在转录和蛋白水... 目前以牛轮状病毒为亲本的人-牛重配口服疫苗临床试验保护效果不佳,可能与免疫抑制有关。为了探讨牛轮状病毒对人源宿主RLRs免疫通路的影响,将牛轮状病毒UK株感染Caco-2细胞6 h/12 h/24 h后,检测IRF3、IRF7、RIG-I和MDA5在转录和蛋白水平变化;构建UK-NSP1/NSP1△IRF3质粒分别转染及NSP1分别与IRF3/RIG-I/MDA5共转染293T细胞4 h/8 h/12 h后,western-blot分析IRF3、RIG-I和MDA5蛋白含量变化。结果显示,UK毒株感染组中各基因转录水平均有所上升,RIG-I和MDA5蛋白含量略有上升,IRF3蛋白含量逐渐下降;NSP1转染组中IRF3蛋白含量逐渐下降,RIG-I和MDA5无明显变化;NSP1△IRF3转染组中各蛋白均无明显变化;NSP1共转染组中IRF3含量逐渐下降,另两组含量均逐渐上升。表明,UK株感染后可能激活了人源宿主细胞先天性免疫RLRs通路,但UK-NSP1能够介导人IRF3蛋白降解,而且需要IRF3结合结构域参与,一定程度上拮抗宿主免疫。 展开更多

关键词 轮状病毒 nsp1 RLRs 先天性免疫

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利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组SA11轮状病毒 被引量：1

15

作者 柴萨萨 蔡昊 +6 位作者 刘夏飞 赵静 宋敬东 李金松 裴银辉 李利利 段招军 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期140-146,共7页

目的利用反向遗传技术产生NSP1基因插入和表达外源基因的重组SA11轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体。方法本研究将轮状病毒SA11株的NSP1基因片段的223位(5端)至1388位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止-再启动元件(P2A)的增... 目的利用反向遗传技术产生NSP1基因插入和表达外源基因的重组SA11轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体。方法本研究将轮状病毒SA11株的NSP1基因片段的223位(5端)至1388位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止-再启动元件(P2A)的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因,采用已建立的“12质粒”轮状病毒反向遗传系统拯救NSP1基因插入和表达EGFP的重组SA11轮状病毒。通过观察细胞病变效应和插入基因(EGFP)的荧光表达初步确定重组病毒的成功拯救,再结合电镜的形态学观察、RT-PCR的测序结果及病毒基因组的检测结果,进一步证明重组轮状病毒的成功拯救和传代扩增。利用TCID 50法和qRT-PCR法,测定了rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的病毒滴度并绘制了基因组复制动力曲线。结果基于“12质粒系统”成功拯救了重组轮状病毒rSA11/NSP1-EGFP,证明NSP1片段截短并插入外源基因后病毒仍可正常复制,且具有良好的遗传稳定性,但病毒滴度低于其亲本株。结论基于NSP1基因插入和表达EGFP的重组轮状病毒能够实现稳定遗传,为利用反向遗传学构建表达外源基因的轮状病毒载体的深入探索提供了基础。 展开更多

关键词 A组轮状病毒 反向遗传 外源基因 nsp1基因

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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α多克隆抗体的制备及应用 被引量：1

16

作者 赵慧君 赵旭阳 +11 位作者 史西保 陈静 范小敏 司朝朝 王丽 李青梅 常晓博 李雪莹 付建蒙 徐雅甜 邓瑞广 张改平 《安徽农业科学》 CAS 2019年第12期115-119,131,共6页

以真核质粒pcDNA3.1-flag-nsp1α为模板,利用PCR扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组载体pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态,1mmol/LIPTG在37℃诱导表达6h,成功获得以包涵体形式存在的重组蛋白,能够与小鼠抗His标签单克隆抗... 以真核质粒pcDNA3.1-flag-nsp1α为模板,利用PCR扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组载体pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态,1mmol/LIPTG在37℃诱导表达6h,成功获得以包涵体形式存在的重组蛋白,能够与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体复性后作为抗原免疫新西兰大白兔,3次免疫后20d获得兔多抗血清。通过间接ELISA、Westernblot、间接免疫荧光、免疫组化等试验获得了高效价的兔多抗血清,该血清能够特异性地识别真核质粒表达的nsp1α以及PRRSVBJ4株。该试验成功表达了pET32a-nsp1α重组蛋白,并制备了高效价、高特异性的兔抗nsp1α多克隆抗体。 展开更多

关键词 PRRSV nsp1α 多克隆抗体

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人B组轮状病毒WH-1株NSP2基因片段的克隆与序列分析

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作者 唐少文 叶临湘 +3 位作者 王斌 郑华英 李燕 杨继红 《中国人兽共患病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期109-112,共4页

目的　了解人B组轮状病毒近 2 0年来基因变异情况 ,为轮状病毒疫苗的研制提供依据。方法　利用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)技术 ,扩增人B组轮状病毒WH - 1株NSP2基因 4 89bp的片断 ,并将其克隆到载体 pUCmT ,转化感受态细胞One-shot... 目的　了解人B组轮状病毒近 2 0年来基因变异情况 ,为轮状病毒疫苗的研制提供依据。方法　利用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)技术 ,扩增人B组轮状病毒WH - 1株NSP2基因 4 89bp的片断 ,并将其克隆到载体 pUCmT ,转化感受态细胞One-shotTop10F’ ,提取转化菌质粒经限制性内切酶PstI酶切分析 ,筛选出阳性菌提取质粒 ,对插入片段进行了测序和核苷酸序列分析。结果　利用GeneBee与其他B组轮状病毒株ADRV(人 )、CAL - 1(人 )及IDIR(鼠 )的NSP2基因进行同源性比较 ,发现毒株WH - 1与ADRV核苷酸序列的同源性达 99 8% ,与CAL - 1达 93 7% ,与IDIR(鼠 )的同源性为80 0 %。使用PredictProtein软件分析WH - 1NSP2的蛋白组成 ,发现其编码的 14 9个氨基酸组成的多肽中 ,含有 1个潜在的N -糖基化位点和多个磷酰化位点。从氨基酸序列的同源性看 ,WH - 1与ADRV的同源性达 99 3% ,与CAL - 1达 98 6 % ,而与IDIR为 86 2 %。结论　WH - 1与ADRV的起源相同 ,且B组轮状病毒NSP2基因保守性很高。对人B组轮状病毒NSP2基因序列分析将有助于B组轮状病毒的流行病学、基因进化以及轮状病毒疫苗的研制都将有重要意义。 展开更多

关键词 人B组轮状病毒 WH-1株NSP2 基因片段 克隆 序列分析

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那仁满都拉教授团队提出降解RNA聚合酶抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2复制的新机制

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《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期114-114,共1页

2022年1月12日《研究》(Research)在线发表了浙江大学医学院那仁满都拉教授团队最新研究成果“Heat treatment promotes ubiquitin-mediated proteolysis of SARS-CoV-2 RNA polymerase and decreases viral load”(DOI:10.34133/2022/9... 2022年1月12日《研究》(Research)在线发表了浙江大学医学院那仁满都拉教授团队最新研究成果“Heat treatment promotes ubiquitin-mediated proteolysis of SARS-CoV-2 RNA polymerase and decreases viral load”(DOI:10.34133/2022/9802969)。研究发现,相对温和的热激(40℃)能够显著地诱导严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-Co V-2)RNA依赖的RNA聚合酶(又名NSP12)及其突变体降解。 展开更多

关键词 nsp1 RNA聚合酶 严重急性呼吸综合征冠状病毒 浙江大学医学院

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