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进口锦鲤暴发病病原的nested-PCR鉴定 被引量：61
1
作者 刘荭 史秀杰 +1 位作者 高隆英 江育林 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期414-418,共5页
为了查明锦鲤暴发性疾病的病因 ,将患病锦鲤的脑、肝、脾和肾等组织悬液接种到CO、CK和EPC等鱼类细胞系中培养 ,均未发现细胞病变 ;从病灶中取样进行病原菌的分离和培养 ,证明锦鲤有副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的感染。制备锦鲤疱疹病毒 (... 为了查明锦鲤暴发性疾病的病因 ,将患病锦鲤的脑、肝、脾和肾等组织悬液接种到CO、CK和EPC等鱼类细胞系中培养 ,均未发现细胞病变 ;从病灶中取样进行病原菌的分离和培养 ,证明锦鲤有副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的感染。制备锦鲤疱疹病毒 (KHV)的 2对引物KHV9/ 5F和KHV9/ 5R ,KHV1和KHV2 ,用嵌套式聚合酶链式反应 (nested -PCR)在脑和脾脏组织的抽提物中扩增出长度为 4 12bp的特异性的DNA片段。将该片段的nested -PCR扩增产物纯化后 ,克隆、测序。用NCBI -Blast软件将测序结果在Genebank中进行搜寻、比较 ,结果发现与注册号为AF4 1180 3的KHV基因序列的一部分片段有 99%的同源性。因此初步判断这次锦鲤暴发性疾病是由KHV引起的 。 展开更多
关键词 锦鲤 暴发病 病原 nested-PCR鉴定 嵌套式聚合酶链式反应
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广西道地药材肉桂及阴香的DNA分子鉴定研究 被引量：5
2
作者 李立 吴桂凡 +3 位作者 罗轶 李丽莉 凌婕 马双成 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期191-196,203,共7页
建立一种能够准确鉴别肉桂及阴香的特异性聚合酶链式反应方法,以保障肉桂用药的安全性和有效性。通过对比分析肉桂及阴香的psbA-trnH序列差异找到特异性单核苷酸多态性位点,设计特异性引物,通过优化退火温度、循环次数,评估不同聚合酶... 建立一种能够准确鉴别肉桂及阴香的特异性聚合酶链式反应方法,以保障肉桂用药的安全性和有效性。通过对比分析肉桂及阴香的psbA-trnH序列差异找到特异性单核苷酸多态性位点,设计特异性引物,通过优化退火温度、循环次数,评估不同聚合酶种类和不同基因扩增仪等扩增条件对不同来源的肉桂及阴香进行特异性扩增,根据特异性扩增条带进行鉴别。结果表明退火温度为54℃,循环次数为35次时,肉桂经肉桂特异性引物扩增后在100~200 bp处出现特异性条带,阴香无条带;退火温度为56℃,循环次数为40次时,阴香经阴香引物扩增后在200~300 bp处出现特异性条带,肉桂无条带。该研究所建立的特异性PCR方法可以快速准确鉴别出肉桂及阴香,为控制肉桂的质量安全提供参考。 展开更多
关键词 肉桂 阴香 特异性聚合酶链式反应 特异性引物 质量安全
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马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种real-time PCR检测方法的建立与应用 被引量：1
3
作者 吕厚姣 李欣媛 +3 位作者 白小佳 贾龙刚 耿伟涛 王艳萍 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第9期102-108,共7页
本研究建立了一种特异性实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,根据模式菌株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的16S rDNA序列和全基因组序列设计筛选特异性引物,采用SYBR Green I荧光染料建立r... 本研究建立了一种特异性实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,根据模式菌株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的16S rDNA序列和全基因组序列设计筛选特异性引物,采用SYBR Green I荧光染料建立real-time PCR方法,并对方法的特异性、灵敏度、重复性和混合体系等进行检测。结果表明,本研究所建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,建立real-time PCR的标准曲线,其决定系数R2为0.965,具有良好的线性关系,且在马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种及混合体系中可以特异性检出。综上,本研究建立的real-time PCR法可以快速、准确地检测马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种,为马乳酒样乳杆菌的特异性定性定量检测提供了一种新的方法。 展开更多
关键词 马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种 实时聚合酶链式反应 特异性引物
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巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究 被引量：13
4
作者 周华蓉 沈建箴 +3 位作者 付海英 叶宝国 范丽萍 林福安 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2006年第2期375-378,共4页
本研究应用改进的甲基化特异性PCR(MSP)法,即巢式甲基化特异性PCR法检测6种肿瘤细胞株p16基因启动子的甲基化状态效率,探讨其在筛选p16基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株,及将其作为研究基因甲基化与表达关系的理想细胞模型中的应用。6种... 本研究应用改进的甲基化特异性PCR(MSP)法,即巢式甲基化特异性PCR法检测6种肿瘤细胞株p16基因启动子的甲基化状态效率,探讨其在筛选p16基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株,及将其作为研究基因甲基化与表达关系的理想细胞模型中的应用。6种肿瘤细胞株基因组DNA经碱变性后以亚硫酸盐修饰,再用巢式甲基化特异性聚合酶链反应扩增,分析检测其p16启动子区CpG岛的甲基化状态。结果表明:CA46、U266都有不同程度的p16基因启动子区甲基化,而Molt4、K562、HL-60、Jurkat的p16基因启动子区均未甲基化。结论:用巢式甲基化特异性PCR可以准确的检测出恶性血液病细胞株p16基因的甲基化状态,方法简单,灵敏且重复性强,可以广泛用于筛选各种p16基因启动子区甲基化的恶性血液病细胞株以及恶性血液病诊断。 展开更多
关键词 巢式甲基化特异性聚合酶链反应 恶性血液病细胞株 P16基因 基因甲基化
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应用NPCR发现我国Kawasaki型恙虫病立克次体 被引量：37
5
作者 郭恒彬 吴光华 +5 位作者 唐家琪 李先富 于明明 张云 潘秀珍 李越希 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 1995年第2期22-24,共3页
本文报告用恙虫病立克次体表面蛋白５６ＫＤａ型特异抗原（ｔｓａ５６ＫＤａ）基因编码区的引物，采用嵌合式聚合酶链反应（ＮＰＣＲ）鉴定江苏地区的２株恙虫病立克次体。结果该２株恙虫病立克次体与Ｇｉｌｌｉａｍ，Ｋａｒｐ，Ｋａｔ... 本文报告用恙虫病立克次体表面蛋白５６ＫＤａ型特异抗原（ｔｓａ５６ＫＤａ）基因编码区的引物，采用嵌合式聚合酶链反应（ＮＰＣＲ）鉴定江苏地区的２株恙虫病立克次体。结果该２株恙虫病立克次体与Ｇｉｌｌｉａｍ，Ｋａｒｐ，Ｋａｔｏ和Ｋｕｒｏｋｉ型特异引物无任何ＤＮＡ扩增带，而与日本ｋａｗａｓａｋｉ株型特异引物扩增后有５２３ｂｐ的ＤＮＡ扩增带，表明我国存在Ｋａｗａｓａｋｉ型恙虫病立克次体。 展开更多
关键词 恙虫病 立克次体 特异抗原 嵌合式 聚合酶链反应
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转基因玉米59122品系的特异性检测 被引量：8
6
作者 许文涛 杨蓉 +4 位作者 陆姣 张南 罗云波 何景 黄昆仑 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第4期139-142,共4页
使用反向聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了转基因玉米59122的外源基因与玉米基因组之间的两段侧翼序列,并据其左侧侧翼序列设计了具品系特异性的引物,运用半巢式PCR技术建立了59122的品系特异性二重PCR检测方法,扩增片段100bp,横跨pat终... 使用反向聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了转基因玉米59122的外源基因与玉米基因组之间的两段侧翼序列,并据其左侧侧翼序列设计了具品系特异性的引物,运用半巢式PCR技术建立了59122的品系特异性二重PCR检测方法,扩增片段100bp,横跨pat终止子与转基因玉米侧翼基因之间。以转基因玉米59122、MON863、MON810、GA21、NK603,转基因大豆Roundup Ready和转基因油菜GT73等为材料,证明本方法与其他转基因作物具有高特异性。本方法在检测59122时,确定出连接体系中线性DNA的最佳质量浓度为1ng/μL左右,检出限达到0.1%,灵敏度为38个单倍体基因组拷贝数。因此可准确、快速、高效地检测转基因玉米及其产品,或作为常规PCR定性检测后的验证方法。 展开更多
关键词 转基因作物 品系特异性检测 半巢式聚合酶链式反应 反向聚合酶链式反应 二重聚合酶链式反应
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类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞IL-10基因启动子甲基化状态研究 被引量：12
7
作者 付丽红 丛斌 +6 位作者 甄艳凤 李淑瑾 马春玲 倪志宇 张国忠 左敏 姚玉霞 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期1357-1361,共5页
白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是在类风湿性关节炎中发挥重要免疫调节作用的细胞因子,其基因失活与已分化的Th1和Th2细胞染色质结构重塑有关。为了探讨IL-10基因启动子甲基化及基因失活在类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA... 白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是在类风湿性关节炎中发挥重要免疫调节作用的细胞因子,其基因失活与已分化的Th1和Th2细胞染色质结构重塑有关。为了探讨IL-10基因启动子甲基化及基因失活在类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)发病和进展中的作用,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及甲基化特异性聚合酶链反应(MSP),分别检测34例类风湿性关节炎患者和30例健康人外周血单个核细胞IL-10mRNA、蛋白表达水平及基因启动子甲基化状态。结果显示,病例组IL-10mRNA及蛋白表达均低于健康对照组,无统计学差异(P>0.05)。病例组甲基化率(85.29%)高于健康对照组(43.33%),具有统计学差异(χ2=12.439,P=0.000)。IL-10基因启动子甲基化状态与其mRNA表达呈显著负相关(r=?0.579,P=0.001),与所累关节数显著相关,但与血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、年龄均无相关性(P>0.05)。IL-10mRNA表达与年龄、所累关节数、ESR、CRP及RF均无相关性(P>0.05)。上述结果提示,启动子甲基化可能是IL-10基因失活的重要机制,IL-10基因异常高甲基化状态可能参与了RA的发生发展。 展开更多
关键词 类风湿性关节炎 白细胞介素-10 甲基化特异性聚合酶链反应
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血浆RNF180启动子甲基化及其蛋白表达在胃癌诊断中的价值 被引量：8
8
作者 张学松 张谢 +4 位作者 孙蓓蕾 宋毓飞 陆宏娜 王丹萍 黄志刚 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2014年第22期1432-1436,共5页
目的:探讨血浆RNF180基因启动子甲基化及其蛋白表达在胃癌临床诊断中的价值。方法:采用甲基化特异性PCR法(MSP)和ELISA法检测各组患者血浆中RNF180甲基化状态和RNF180蛋白表达情况,并分别将其与各临床病理指标进行统计学分析。结果:MSP... 目的:探讨血浆RNF180基因启动子甲基化及其蛋白表达在胃癌临床诊断中的价值。方法:采用甲基化特异性PCR法(MSP)和ELISA法检测各组患者血浆中RNF180甲基化状态和RNF180蛋白表达情况,并分别将其与各临床病理指标进行统计学分析。结果:MSP结果显示胃癌患者血浆中RNF180基因启动子甲基化率为62.75%,健康者为21.88%,其差异具有统计学意义(P<0.01)。RNF180甲基化阳性率与肿瘤大小、临床分期、分化程度、淋巴结转移以及远处转移密切相关(P<0.05)。ELISA结果显示胃癌血浆RNF180蛋白水平(23.22±1.36)μg/m L明显低于对照健康组(34.25±2.44)μg/m L,差异具有统计学意义(P<0.01)。胃癌血浆RNF180蛋白表达水平与临床病理特征无统计学意义(P>0.05)。结论:胃癌患者血浆RNF180基因表达存在高甲基化率,而RNF180蛋白表达明显下降,提示血浆RNF180基因甲基化可作为一种微创的检测方法在临床胃癌诊断中有潜在的应用价值。 展开更多
关键词 RNFl80基因 甲基化 胃癌 血浆 甲基化特异性PCR
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巢式PCR联合焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒耐药基因检测中的敏感性与特异性分析 被引量：12
9
作者 孙树梅 周浩 +3 位作者 周彬 胡子有 侯金林 孙剑 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期610-613,共4页
目的评价巢式PCR联合焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因检测中的敏感与特异性。方法选取rtM204I(ATT)突变型和rtM204(ATG)未突变型质粒,按照不同比例混合后,采用巢式PCR联合焦磷酸测序法对突变位点进行检测,并与常规PCR焦磷酸测... 目的评价巢式PCR联合焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因检测中的敏感与特异性。方法选取rtM204I(ATT)突变型和rtM204(ATG)未突变型质粒,按照不同比例混合后,采用巢式PCR联合焦磷酸测序法对突变位点进行检测,并与常规PCR焦磷酸测序法进行比较,对两种方法的线性及一致性进行分析;选取不同病毒载量临床标本,采用巢式PCR焦磷酸测序法检测耐药突变位点,并与巢式PCR Sanger测序法进行比较,对两种方法的敏感性及特异性进行分析。结果常规PCR焦磷酸测序和巢式PCR焦磷酸测序结果拟合曲线R2>0.99,P<0.05,线性模型有显著性意义。分别将常规PCR焦磷酸测序和巢式PCR焦磷酸测序结果与预测值的差值进行分析,巢式PCR能够较常规PCR更好的反映实际值,在90%比例处优于常规PCR。临床75例患者标本巢式PCR Sanger测序与巢式PCR联合焦磷酸测序结果灵敏性比较提示,Sanger测序的灵敏性为92%,巢式PCR联合焦磷酸测序的灵敏性达到100%,差异有统计学意义(P<0.01)。对于不同病毒拷贝数标本的灵敏性不同,其差异主要表现在低浓度组(HBV DNA≤3log10 copies/ml),Sanger测序的灵敏性为78%,而焦磷酸测序的灵敏性可以达到100%,差异有统计学意义(P<0.01)。阴性对照,两种方法均未检出HBV病毒,两种方法的特异性均较好。结论巢式PCR联合焦磷酸测序的方法监测乙肝病毒变异同巢式PCR联合sanger测序相比,有更好的灵敏性,尤其是在低病毒拷贝数时,差异明显,这对于临床提早发现耐药突变株,指导临床及时更换用药有重要意义。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 巢式PCR 焦磷酸测序
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16S rDNA序列分析法快速鉴定西藏地区传统乳制品中的乳酸菌 被引量：20
10
作者 夏雪娟 陈芝兰 +2 位作者 陈宗道 阚建全 杨吉霞 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第14期245-249,共5页
对14株乳酸菌进行菌种鉴定。提取基因组DNA,采用属特异性聚合酶链式反应(PCR)、16S rDNA序列同源性分析、种特异性PCR与NEBcutter分析相结合的方法对乳酸菌进行鉴定。结果表明,14株菌中,除123-2和23-3外,其余12株菌均属于乳杆菌属;11-2... 对14株乳酸菌进行菌种鉴定。提取基因组DNA,采用属特异性聚合酶链式反应(PCR)、16S rDNA序列同源性分析、种特异性PCR与NEBcutter分析相结合的方法对乳酸菌进行鉴定。结果表明,14株菌中,除123-2和23-3外,其余12株菌均属于乳杆菌属;11-2、13-3、14-3、16-4、23-3、24-3、26-1、122-1、123-4为干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌,17-5、20-2、28-1属于植物乳杆菌,123-2为肠膜状明串株菌,125-2为类布氏乳杆菌,除23-3外均与属特异性PCR结果相匹配;11-2、13-3、14-3、16-4、23-3、24-3、26-1、122-1、123-4均为副干酪乳杆菌。NEBcutter分析结果进一步验证了菌株划分的准确性。该方法快速可靠,且误差较小。 展开更多
关键词 乳酸菌 鉴定 属特异性聚合酶链式反应 16SrDNA 种特异性聚合酶链式反应 NEBcutter
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永川毛霉型豆豉在发酵过程中微生物总量与区系变化规律 被引量：15
11
作者 索化夷 赵欣 +4 位作者 骞宇 陈娟 李键 张玉 阚建全 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第19期124-131,共8页
采用巢式聚合酶链式反应配合变性梯度凝胶电泳技术对永川豆豉发酵过程中微生物区系生态演化进行解析。结果表明:永川豆豉在制曲过程中霉菌和细菌呈对数增长,进入后发酵阶段菌落总数快速下降,并保持在较低水平。永川豆豉在制曲前期有多... 采用巢式聚合酶链式反应配合变性梯度凝胶电泳技术对永川豆豉发酵过程中微生物区系生态演化进行解析。结果表明:永川豆豉在制曲过程中霉菌和细菌呈对数增长,进入后发酵阶段菌落总数快速下降,并保持在较低水平。永川豆豉在制曲前期有多种乳酸菌生长,后期乳酸菌受霉菌增长抑制,种类减少。在后发酵阶段奥德赛芽孢杆菌(Bacillus odysseyi)、乳酸杆菌(Lactobacillus oligofermentans)和乳酸杆菌(Lactobacillus lindneri)是优势菌群。同时在制曲初期也发现了费格森埃希菌(Escherichia fergusonii)等杂菌生长。永川豆豉制曲阶段优势霉菌是总状毛霉(Mucor racemosus),同时伴有有性根霉(Rhizopus sexualis)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、大孢联轭霉(Syzygites megalocarpus)、米根霉(Rhizopus oryzae)的生长,后发酵阶段有接合酵母(Zygosaccharomyces sp.)的参与。 展开更多
关键词 永川豆豉 微生物区系 巢式聚合酶链式反应 变性梯度凝胶电泳
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进口黄檀属木材DNA提取与分子鉴定方法初步研究 被引量：11
12
作者 伏建国 刘金良 +2 位作者 杨晓军 安榆林 骆嘉言 《浙江农林大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期627-632,共6页
由于黄檀属Dalbergia种类较多,很多种类通过形态学方法难以区分,给中国进口木材检验鉴定工作带来了很大困难。为了研究黄檀属木材的分子鉴定方法,选取进口木材中常见的7种黄檀属木材,通过比较不同的木材DNA提取和纯化方法,摸索出了适合... 由于黄檀属Dalbergia种类较多,很多种类通过形态学方法难以区分,给中国进口木材检验鉴定工作带来了很大困难。为了研究黄檀属木材的分子鉴定方法,选取进口木材中常见的7种黄檀属木材,通过比较不同的木材DNA提取和纯化方法,摸索出了适合于黄檀属木材的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)十二烷基硫酸钠(SDS)磁珠相结合的DNA提取和纯化体系,利用巢式聚合酶链式反应(PCR)扩增出433 bp的matK基因片段,共发现12个碱基位点差异,可以将7种进口黄檀属木材及我国的降香黄檀Dalbergia odorifera逐一区分开,为黄檀属木材分子识别鉴定研究工作奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 林业工程 黄檀属木材 DNA提取 纯化 巢式PCR MATK基因 鉴定
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组织细胞性坏死性淋巴结炎中微小病毒B19的检测及其意义 被引量：9
13
作者 张伟平 黄高昇 +4 位作者 王娟红 王文清 王哲 胡沛臻 张伟 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期271-273,共3页
目的研究人微小病毒B19感染与组织细胞性坏死性淋巴结炎(histiocytic necrotizing lymphadenitis,HNL)的关系。方法采用双盲法在32例真性HNL患者及13例正常对照淋巴结活检组织中用巢式PCR和免疫组化染色检测B19病毒基因组DNA和病毒蛋白... 目的研究人微小病毒B19感染与组织细胞性坏死性淋巴结炎(histiocytic necrotizing lymphadenitis,HNL)的关系。方法采用双盲法在32例真性HNL患者及13例正常对照淋巴结活检组织中用巢式PCR和免疫组化染色检测B19病毒基因组DNA和病毒蛋白。结果在32例真性HNL患者淋巴结中,B19病毒DNA和病毒蛋白阳性率分别为90·0%和59·4%,而在对照淋巴结中,两者阳性率分别为53·8%和23·1%。统计学分析显示在真性HNL中B19病毒基因组DNA及病毒蛋白的阳性率更高(P<0·05)。结论B19病毒在真性HNL中有更高感染率,推测与真性HNL的发病可能有一定关系。 展开更多
关键词 组织细胞性坏死性淋巴结炎 微小病毒B19 巢式PCR 免疫组织化学
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二核苷酸微卫星PCR扩增的影子带及其来源 被引量：9
14
作者 王吉振 王爱国 +4 位作者 储明星 李宁 傅金恋 易建红 高福才 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期241-246,共6页
2个绵羊二核苷酸微卫星BM143和BMS2508的PCR扩增产物在非变性(中性)聚丙烯酰胺凝胶电泳(nPAGE)中形成滞后于主带的影子带。影子带比主带小2 bp。实际上主带由两部分组成:表明微卫星正确大小的PCR特异扩增的高浓度条带(特异扩增带)和比... 2个绵羊二核苷酸微卫星BM143和BMS2508的PCR扩增产物在非变性(中性)聚丙烯酰胺凝胶电泳(nPAGE)中形成滞后于主带的影子带。影子带比主带小2 bp。实际上主带由两部分组成:表明微卫星正确大小的PCR特异扩增的高浓度条带(特异扩增带)和比特异扩增带小2 bp的PCR非特异扩增的低浓度条带(非特异扩增带)。本试验初步证明影子带是微卫星的一条特异扩增带和一条非特异扩增带错配形成的异源双链。本研究结果表明,影子带的出现并不改变特异扩增带在nPAGE中的正常迁移率。 展开更多
关键词 二核苷酸微卫星 聚合酶链式反应 影子带 非特异扩增带 特异扩增带 异源双链
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甘蓝型油菜抗苯磺隆突变体ALS基因分析与SNP标记 被引量：17
15
作者 孙妍妍 曲高平 +3 位作者 黄谦心 吕金洋 郭媛 胡胜武 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期589-595,共7页
为筛选新型甘蓝型油菜抗苯磺隆除草剂的等位基因特异分子标记,以EMS诱变的甘蓝型油菜中双9号M2群体(约30 000单株)为材料,通过苯磺隆喷药处理筛选到3株抗除草剂突变体(分别记为K1、K4、K5)。利用PCR技术克隆到抗性突变体相应的Bn ALS1、... 为筛选新型甘蓝型油菜抗苯磺隆除草剂的等位基因特异分子标记,以EMS诱变的甘蓝型油菜中双9号M2群体(约30 000单株)为材料,通过苯磺隆喷药处理筛选到3株抗除草剂突变体(分别记为K1、K4、K5)。利用PCR技术克隆到抗性突变体相应的Bn ALS1、Bn ALS2、Bn ALS3基因,序列分析结果表明,K1和K4的Bn ALS3基因序列发生碱基突变,其中第+535位C碱基突变为T,导致其编码的Bn ALS3蛋白第197位氨基酸由Pro突变为Ser;而K5的Bn ALS1基因序列第+544位C突变为T,导致其编码的Bn ALS1蛋白发生了Pro197Ser的改变(均以拟南芥ALS氨基酸序列为准)。其中K5抗性位点Bn ALS1∶Pro197Ser的改变属于首次报道。基于突变的基因序列设计了8对等位基因特异性PCR引物组合,有6对能用于区分抗性突变体和野生型材料,其中可检测K5的Bn ALS1基因SNP位点的引物有2对,可检测K1、K4突变体Bn ALS3基因SNP位点的引物有4对。 展开更多
关键词 油菜 抗除草剂突变体 苯磺隆 乙酰乳酸合成酶 等位基因特异PCR 单核苷酸多态性
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上海地区儿童急性下呼吸道常见病毒及鼻病毒感染的临床研究 被引量：37
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作者 李军 朱启镕 +1 位作者 俞蕙 顾新焕 《临床儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期457-461,共5页
目的了解上海地区急性下呼吸道感染(ALRTI)患儿病毒感染病原体的现状。方法收集2005年1月至12月住院确诊为ALRTI的342例患儿深部鼻咽分泌物(NPS)标本,建立套式RT-PCR的方法测定NPS中的鼻病毒(HRV)基因,用直接免疫荧光法(DFA)检测NPS中... 目的了解上海地区急性下呼吸道感染(ALRTI)患儿病毒感染病原体的现状。方法收集2005年1月至12月住院确诊为ALRTI的342例患儿深部鼻咽分泌物(NPS)标本,建立套式RT-PCR的方法测定NPS中的鼻病毒(HRV)基因,用直接免疫荧光法(DFA)检测NPS中的呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(IFV)、副流感病毒(PIV)、腺病毒(ADV)抗原,对各种病毒在小儿ALRTI中的流行特点及临床特征进行分析。结果342例ALRTI患儿NPS标本中,检测到HRV阳性46例(13.45%)。HRV阳性患儿中,3岁以下婴幼儿38例(82.6%),1岁以下27例(58.7%)。HRV致ALRTI全年可见,3到5月份为最高峰。RSV阳性64例(18.70%),1岁以下46例(71.88%)。1岁以下与1岁以上患儿RSV的检出率比较差异有统计学意义(χ2=4.03,P<0.05)。RSV的检出阳性率从2月份起逐渐下降,6到7月份达到最低,8月份起检出率逐渐升高,至12月份达到最高。ADV感染9例(2.63%),PIV感染8例(2.30%),IFV感染7例(2.0%)。本组患儿病毒混合感染共4例。130例病毒性ALRTI患儿诊断支气管肺炎122例,体温正常42例、低热34例、中度热50例、高热仅4例,以中度发热以下为主,末梢血白细胞<10×109/L93例(71.5%),中性粒细胞<50%94例(72.3%),CRP<8mg/L99例(76.2%),均符合病毒性肺炎的特点。64例RSV感染病例中有30例合并喘息(46.9%),36例HRV感染病例中24例合并喘息(52.2%)。结论病毒病原在上海地区小儿ALRTI中占有重要地位,小儿病毒性ALRTI以RSV及HRV为主,ADV、PIV及IFV相对少见,混合性病毒感染少见。HRV所致小儿ALRTI以3岁以下儿童多见,尤以1岁以下为多。上海地区HRV感染主要集中于春秋两季。RSV所致小儿ALRTI以1岁以下为主,以秋、冬、春气温较低的季节多发。除RSV外,HRV也是导致ALRTI患儿喘息的重要病原。 展开更多
关键词 急性下呼吸道感染 病毒 套式RT—PCR 直接免疫荧光法 儿童
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乙脑病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：12
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作者 高正琴 贺争鸣 +2 位作者 邢瑞昌 卫礼 王吉 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第4期279-282,共4页
目的　建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法　根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT ... 目的　建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法　根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT nestedPCR ,将PCR产物进行了克隆测序;同时对猪细小病毒(PPV)、猴空泡病毒4 0 (SV4 0 )及正常乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞提取核酸进行PCR ,并对2 10份临床样品进行了检测。结果　PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞均扩增出10 15bp和6 2 2bp目的基因片段,而PPV、SV4 0及未感染JEV的乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞均未见特异性扩增条带,2 10份猪组织样品中未检出阳性样品。RT nestedPCR检测的最低限度为10PFU病毒。从样品核酸的提取到PCR扩增及检测结果的报告可在8小时内完成。结论　本研究建立的RT NestedPCR方法具有快速、特异、敏感、可靠的特点,可用于人用猪源性生物制品中外源性JEV的污染检测。 展开更多
关键词 乙脑病毒 反转录-嵌套式聚合酶链反应 检测
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肺炎衣原体感染与小儿哮喘发作 被引量：6
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作者 鲁继荣 王玥 +3 位作者 张一宁 付文永 王敏 张宏婵 《临床儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期33-34,40,共3页
为了解肺炎衣原体 (Cpn)感染与小儿哮喘之间的关系 ,并探讨哮喘患儿Cpn感染的诊断及治疗 ,采用微量免疫荧光(MIF)试验及巢式聚合酶链式反应 (nPCR)2种方法对45例哮喘发作期患儿及20例正常对照组进行Cpn检测。结果 :①哮喘组14例nPCR检... 为了解肺炎衣原体 (Cpn)感染与小儿哮喘之间的关系 ,并探讨哮喘患儿Cpn感染的诊断及治疗 ,采用微量免疫荧光(MIF)试验及巢式聚合酶链式反应 (nPCR)2种方法对45例哮喘发作期患儿及20例正常对照组进行Cpn检测。结果 :①哮喘组14例nPCR检测阳性 ,对照组1例阳性 ,两者相比差异有显著性 (P<0.05) ,表明Cpn感染与小儿哮喘发作密切相关。②14例nPCR检测阳性患儿在随后的发作中5例 (35.71 %)仍为阳性 ,表明哮喘患儿中慢性或重复Cpn感染较常见。③就诊或住院后5例Cpn感染哮喘患儿接受了大环内酯类抗生素治疗 ,其中3例病情缓解 ,表明对Cpn感染哮喘患儿进行抗Cpn治疗是必要的。④经全自动荧光测序 ,随机抽取的2例阳性标本和Cpn标准株 (CWL_29)的nPCR产物DNA序列完全一致。 展开更多
关键词 肺炎衣原体 微量免疫荧光 巢式聚合酶链式反应 哮喘
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应用巢氏PCR方法快速检测猪鼻拭子样品中产毒素多杀性巴氏杆菌 被引量：5
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作者 汤细彪 吴斌 +4 位作者 刘国平 杨明柳 罗勇 卢顺 陈焕春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期1083-1087,共5页
根据产毒素多杀性巴氏杆菌的toxA基因序列,设计了2对特异性引物,扩增的片段大小分别为864和447 bp,从而建立了一种能直接从猪鼻拭子中快速检测产毒素多杀性巴氏杆菌的巢氏PCR方法。该方法能检出26CFU菌量以上的模板DNA,且不能从猪的其它... 根据产毒素多杀性巴氏杆菌的toxA基因序列,设计了2对特异性引物,扩增的片段大小分别为864和447 bp,从而建立了一种能直接从猪鼻拭子中快速检测产毒素多杀性巴氏杆菌的巢氏PCR方法。该方法能检出26CFU菌量以上的模板DNA,且不能从猪的其它7种常见病原菌扩增到特异性条带。通过对5个不同地区阳性猪群中采集的146份临床鼻拭子样品进行巢氏PCR检测和细菌分离鉴定,结果2种方法同时为阳性的样品有44份,同时为阴性的样品有97份,另有5份样品只有巢氏PCR检测为阳性,巢氏PCR检测与细菌分离鉴定的符合率为96.58%。试验表明:巢氏PCR方法能快速、灵敏地从猪鼻拭子样品中检出产毒素多杀性巴氏杆菌,适合临床进行大规模病原学检测,具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 产毒素多杀性巴氏杆菌 toxA 鼻拭子 巢氏PCR
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恶性血液病患者mdr1基因启动子区甲基化状态及其与表达的关系 被引量：6
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作者 朱燕 武淑兰 +3 位作者 卜定方 李渊 朱强 曹香红 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2004年第1期6-10,共5页
为了探讨多药耐药 (mdr1)基因启动子区的甲基化状态及其与表达的关系 ,采用甲基化敏感的HpaⅡ酶切结合竞争性定量PCR检测 5 4例急性白血病 (AL)和 9例多发性骨髓瘤 (MM)患者mdr1基因启动子区位于转录起始点上游 - 110和 - 5 0bp处两个C... 为了探讨多药耐药 (mdr1)基因启动子区的甲基化状态及其与表达的关系 ,采用甲基化敏感的HpaⅡ酶切结合竞争性定量PCR检测 5 4例急性白血病 (AL)和 9例多发性骨髓瘤 (MM)患者mdr1基因启动子区位于转录起始点上游 - 110和 - 5 0bp处两个CCGG位点 (I区和Ⅱ区 )的甲基化率 ;半定量RT PCR检测mdr1基因的表达水平。结果显示I区、Ⅱ区及总甲基化率均与表达呈负相关 ,I区比Ⅱ区相关密切 (r分别为 - 0 .6 4和 - 0 .4 0 )。低甲基化组(n=36 )mdr1高表达率显著增高 (P <0 .0 0 1)。与化疗敏感组 (n =8)相比 ,耐药组 (n=16 )I区 (P =0 0 5 )、Ⅱ区 (P <0 .0 5 )和总甲基化率 (P <0 .0 5 )均减低。与未化疗组 (n =36 )相比 ,化疗后组 (n =14 )I区和总甲基化率均减低 (P <0 .0 5 ) ,Ⅱ区甲基化率也减低 ,但无统计学意义 (P >0 .0 5 )。化疗后组随甲基化率减低 ,mdr1表达升高 ,但尚无统计学意义 (P =0 .0 6 )。结论 :AL和MM患者骨髓mdr1基因表达水平与基因转录起始点上游 - 110和- 5 0处两个CCGG位点的甲基化程度呈负相关 ,且与 - 110处关系更密切。化疗后及耐药病人mdr1基因甲基化水平相对降低。化疗后mdr1基因表达增高与其甲基化水平降低有关。 展开更多
关键词 急性白血病 多发性骨髓瘤 多药耐药基因 甲基化 竞争性聚合酶链反应
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