目的:探讨RNA m^(6)A甲基化修饰在脂肪细胞胰岛素抵抗中的作用及机制。方法:收集2型糖尿病患者术中赘余皮下脂肪组织,以非2型糖尿病患者同样组织为对照,检测组间RNA m^(6)A水平。高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠构建胰岛素抵抗(in⁃sulin resis...目的:探讨RNA m^(6)A甲基化修饰在脂肪细胞胰岛素抵抗中的作用及机制。方法:收集2型糖尿病患者术中赘余皮下脂肪组织,以非2型糖尿病患者同样组织为对照,检测组间RNA m^(6)A水平。高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠构建胰岛素抵抗(in⁃sulin resistance,IR)模型(HFD组,n=5,60%高脂饲料喂养16周),对照组10%低脂饲料喂养16周(CD组,n=5)。模型构建成功后,取附睾周围脂肪组织行表观转录组学m^(6)A甲基化修饰芯片检测,并借助MeRIP-qPCR实验、RT-qPCR以及RNA结合蛋白免疫沉淀测定(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RIP)实验验证胰岛素信号转导相关基因变化;进一步观察METTL3小分子抑制剂STM2457对高脂饮食诱导下小鼠胰岛素信号转导基因的影响。结果:2型糖尿病患者和小鼠IR模型脂肪组织中总体m^(6)A修饰水平均升高(患者200 ng RNA t=-8.375,P<0.001;患者100 ng RNA t=-3.722,P=0.006;患者50 ng RNA t=-4.937;P=0.001;小鼠100 ng RNA t=-3.590,P=0.023;小鼠50 ng RNA t=-2.760,P=0.025)。表观转录组学检测证实IR的脂肪组织中1175个基因发生高m^(6)A修饰,55个基因发生低m^(6)A修饰,同时有182个基因呈现高m^(6)A修饰且低表达,包括AKT2、INSR、PIK3R1、ACACA、SREBF1等5个胰岛素信号转导关键基因,其中AKT2、INSR、ACACA、SREBF1等4个基因被确证并证实其与METTL3存在直接结合,其m^(6)A修饰水平受METTL3正向调控。STM2457作用下,胰岛素敏感性提高,且AKT2、INSR、ACACA、SREBF1转录水平上调,提示IR表型改善明显。结论:高脂饮食通过METTL3诱导脂肪细胞胰岛素信号转导基因AKT2、INSR、ACACA、SREBF1发生m^(6)A高甲基化修饰,诱导其低表达,阻滞胰岛素信号转导,进而参与诱发IR。展开更多
目的:探讨Mettl3介导m^(6)A甲基化修饰对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的脊髓神经元氧化应激和调亡的影响。方法:分离新生(24h内)SD大鼠脊髓,经消化、离心后重悬沉淀,差速贴壁30min后收集未贴壁细胞培养于Neurobasal培养基中,经免疫荧光鉴...目的:探讨Mettl3介导m^(6)A甲基化修饰对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的脊髓神经元氧化应激和调亡的影响。方法:分离新生(24h内)SD大鼠脊髓,经消化、离心后重悬沉淀,差速贴壁30min后收集未贴壁细胞培养于Neurobasal培养基中,经免疫荧光鉴定呈β3-tubulin阳性,确认为脊髓神经元。将脊髓神经元随机分为6组:空白组,细胞不予任何处理,正常培养;转染对照组,细胞转染阴性对照siRNA(si-NC);转染组,细胞转染Mettl3 siRNA(si-Mettl3);诱导组,细胞采用300μmol/L的H_(2)O_(2)处理;转染对照诱导组,细胞先转染si-NC,然后采用300μmol/LH_(2)O_(2)处理;转染诱导组,细胞先转染si-Mettl3,然后采用300μmol/LH_(2)O_(2)处理。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞Mettl3的mRNA表达水平,Westernblot检测Mettl3、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平,免疫荧光检测Mettl3表达,酶标仪检测各组整体m^(6)A水平,并检测白细胞介素IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:与空白组相比,诱导组的m6A甲基化修饰水平显著提高(P<0.05),Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),IL-1β(73.39±8.82ng/Lvs125.58±15.31ng/L)、IL-6(63.34±7.12ng/L vs 101.28±12.49ng/L)、TNF-α(103.29±12.19ng/Lvs 204.37±23.65ng/L)和MDA(4.01±0.67pmol/Lvs 9.23±1.05pmol/L)水平显著性升高(P<0.05),SOD(28.37±3.72U/mgvs 17.23±2.05U/mg)和GSHPx(158.19±19.26U/mgvs83.35±9.05U/mg)水平显著性降低(P<0.05),且Bax和cleavedCaspase-3的蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),细胞凋亡率显著升高[(8.30±0.68)%vs(34.29±3.16)%,P<0.05];与诱导组相比,转染诱导组的m^(6)A甲基化修饰水平显著性降低(P<0.05),Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),IL-1β(125.58±15.31ng/L vs 96.28±11.27ng/L)、IL-6(101.28±12.49ng/L vs 84.56±10.24ng/L)、TNF-α(204.37±23.65ng/L vs 147.15±18.46ng/L)和MDA(9.23±1.05pmol/L vs 7.28±0.96pmol/L)水平显著性降低(P<0.05),SOD(17.23±2.05U/mg vs 24.01±2.76U/mg)和GSH-Px(83.35±9.05U/mg vs 121.48±15.47U/mg)水平显著升高(P<0.05),且Bax和cleavedCaspase-3的蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),细胞凋亡率显著性降低(34.29±3.16)%vs(23.57±2.01)%,P<0.05)。与空白组相比,转染组的炎性因子、氧化应激和调亡水平均无显著性差异(P>0.05)。结论:H_(2)O_(2)可上调脊髓神经元中m^(6)A甲基化修饰水平,并可诱导氧化应激和细胞凋亡;抑制Mettl3表达能够降低H_(2)O_(2)诱导的脊髓神经元m^(6)A甲基化修饰水平,进而缓解氧化应激和细胞凋亡。展开更多
文摘目的:探讨RNA m^(6)A甲基化修饰在脂肪细胞胰岛素抵抗中的作用及机制。方法:收集2型糖尿病患者术中赘余皮下脂肪组织,以非2型糖尿病患者同样组织为对照,检测组间RNA m^(6)A水平。高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠构建胰岛素抵抗(in⁃sulin resistance,IR)模型(HFD组,n=5,60%高脂饲料喂养16周),对照组10%低脂饲料喂养16周(CD组,n=5)。模型构建成功后,取附睾周围脂肪组织行表观转录组学m^(6)A甲基化修饰芯片检测,并借助MeRIP-qPCR实验、RT-qPCR以及RNA结合蛋白免疫沉淀测定(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RIP)实验验证胰岛素信号转导相关基因变化;进一步观察METTL3小分子抑制剂STM2457对高脂饮食诱导下小鼠胰岛素信号转导基因的影响。结果:2型糖尿病患者和小鼠IR模型脂肪组织中总体m^(6)A修饰水平均升高(患者200 ng RNA t=-8.375,P<0.001;患者100 ng RNA t=-3.722,P=0.006;患者50 ng RNA t=-4.937;P=0.001;小鼠100 ng RNA t=-3.590,P=0.023;小鼠50 ng RNA t=-2.760,P=0.025)。表观转录组学检测证实IR的脂肪组织中1175个基因发生高m^(6)A修饰,55个基因发生低m^(6)A修饰,同时有182个基因呈现高m^(6)A修饰且低表达,包括AKT2、INSR、PIK3R1、ACACA、SREBF1等5个胰岛素信号转导关键基因,其中AKT2、INSR、ACACA、SREBF1等4个基因被确证并证实其与METTL3存在直接结合,其m^(6)A修饰水平受METTL3正向调控。STM2457作用下,胰岛素敏感性提高,且AKT2、INSR、ACACA、SREBF1转录水平上调,提示IR表型改善明显。结论:高脂饮食通过METTL3诱导脂肪细胞胰岛素信号转导基因AKT2、INSR、ACACA、SREBF1发生m^(6)A高甲基化修饰,诱导其低表达,阻滞胰岛素信号转导,进而参与诱发IR。
文摘目的:探讨Mettl3介导m^(6)A甲基化修饰对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的脊髓神经元氧化应激和调亡的影响。方法:分离新生(24h内)SD大鼠脊髓,经消化、离心后重悬沉淀,差速贴壁30min后收集未贴壁细胞培养于Neurobasal培养基中,经免疫荧光鉴定呈β3-tubulin阳性,确认为脊髓神经元。将脊髓神经元随机分为6组:空白组,细胞不予任何处理,正常培养;转染对照组,细胞转染阴性对照siRNA(si-NC);转染组,细胞转染Mettl3 siRNA(si-Mettl3);诱导组,细胞采用300μmol/L的H_(2)O_(2)处理;转染对照诱导组,细胞先转染si-NC,然后采用300μmol/LH_(2)O_(2)处理;转染诱导组,细胞先转染si-Mettl3,然后采用300μmol/LH_(2)O_(2)处理。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞Mettl3的mRNA表达水平,Westernblot检测Mettl3、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平,免疫荧光检测Mettl3表达,酶标仪检测各组整体m^(6)A水平,并检测白细胞介素IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:与空白组相比,诱导组的m6A甲基化修饰水平显著提高(P<0.05),Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),IL-1β(73.39±8.82ng/Lvs125.58±15.31ng/L)、IL-6(63.34±7.12ng/L vs 101.28±12.49ng/L)、TNF-α(103.29±12.19ng/Lvs 204.37±23.65ng/L)和MDA(4.01±0.67pmol/Lvs 9.23±1.05pmol/L)水平显著性升高(P<0.05),SOD(28.37±3.72U/mgvs 17.23±2.05U/mg)和GSHPx(158.19±19.26U/mgvs83.35±9.05U/mg)水平显著性降低(P<0.05),且Bax和cleavedCaspase-3的蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),细胞凋亡率显著升高[(8.30±0.68)%vs(34.29±3.16)%,P<0.05];与诱导组相比,转染诱导组的m^(6)A甲基化修饰水平显著性降低(P<0.05),Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),IL-1β(125.58±15.31ng/L vs 96.28±11.27ng/L)、IL-6(101.28±12.49ng/L vs 84.56±10.24ng/L)、TNF-α(204.37±23.65ng/L vs 147.15±18.46ng/L)和MDA(9.23±1.05pmol/L vs 7.28±0.96pmol/L)水平显著性降低(P<0.05),SOD(17.23±2.05U/mg vs 24.01±2.76U/mg)和GSH-Px(83.35±9.05U/mg vs 121.48±15.47U/mg)水平显著升高(P<0.05),且Bax和cleavedCaspase-3的蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),细胞凋亡率显著性降低(34.29±3.16)%vs(23.57±2.01)%,P<0.05)。与空白组相比,转染组的炎性因子、氧化应激和调亡水平均无显著性差异(P>0.05)。结论:H_(2)O_(2)可上调脊髓神经元中m^(6)A甲基化修饰水平,并可诱导氧化应激和细胞凋亡;抑制Mettl3表达能够降低H_(2)O_(2)诱导的脊髓神经元m^(6)A甲基化修饰水平,进而缓解氧化应激和细胞凋亡。
