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紫花苜蓿LEA蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化 被引量：2
1
作者 白永琴 康俊梅 +2 位作者 孙彦 杨青川 李燕 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期1484-1489,共6页
根据紫花苜蓿LEA蛋白MsLEA3-1基因(GenBank登录号为EU665182)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物LEAf1/LEAf2和LEAr1/LEAr2,以构建好的PMD-LEA质粒为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段pMD-F和pMD-R,将正反义片段分别插入... 根据紫花苜蓿LEA蛋白MsLEA3-1基因(GenBank登录号为EU665182)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物LEAf1/LEAf2和LEAr1/LEAr2,以构建好的PMD-LEA质粒为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段pMD-F和pMD-R,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,经过NotI酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体pART-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到16株阳性转基因植株,为MsLEA3-1基因的功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 紫花苜蓿 MsLEA3-1基因 RNA干扰 ihprna表达载体 烟草转化
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蒙古冰草MwLEA3基因ihpRNA表达载体的构建
2
作者 石凤敏 云锦凤 赵彦 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期87-92,共6页
采用RT-PCR方法从蒙古冰草中克隆出MwLEA3基因的特异性cDNA序列,并连入克隆载体pGM-T中。根据植物中ihpRNA原理,成功构建了35S启动子调控的具有MwLEA3基因反向重复结构的ihpRNA表达载体pART27-MwLEA3(HB)-MwLEA3(EX),并通过冻融法转化将... 采用RT-PCR方法从蒙古冰草中克隆出MwLEA3基因的特异性cDNA序列,并连入克隆载体pGM-T中。根据植物中ihpRNA原理,成功构建了35S启动子调控的具有MwLEA3基因反向重复结构的ihpRNA表达载体pART27-MwLEA3(HB)-MwLEA3(EX),并通过冻融法转化将MwLEA3基因的ihpRNA表达框架成功导入根癌农杆菌LBA4404中。 展开更多
关键词 蒙古冰草 MwLEA3基因 ihprna表达载体
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甘蔗黄叶病毒CP蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化 被引量：4
3
作者 张雨良 熊国如 +4 位作者 王健华 张树珍 官梅花 杨文君 刘志昕 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期537-542,共6页
为提高甘蔗抗病性,本研究根据甘蔗黄叶病毒海南分离物ScYLV-CHN-HN1全基因组序列(GenBank no.HQ342888),利用病毒CP蛋白介导的RNAi技术,针对病毒外壳蛋白CP,设计两对含有酶切位点的特异性引物,CPsf1/CPsr1和CPasf1/CPasr1,以构建好的pMD... 为提高甘蔗抗病性,本研究根据甘蔗黄叶病毒海南分离物ScYLV-CHN-HN1全基因组序列(GenBank no.HQ342888),利用病毒CP蛋白介导的RNAi技术,针对病毒外壳蛋白CP,设计两对含有酶切位点的特异性引物,CPsf1/CPsr1和CPasf1/CPasr1,以构建好的pMD19-T/CP质粒为模板,pRNAi1017为中间载体,分别合成构建干扰载体的正反向片段pRNAi-CP-F-R,将CP正反向片段分别插入表达载体pCAMBIA2300的相应位置,构建含有发卡结构的RNAi载体p2300-CP-F-R,经过PstⅠ酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体p2300-CP-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到12株阳性转基因植株,Southern blot杂交和半定量RT-PCR对其检测,证明干扰片段已经整合烟草基因组中并进行了转录,该结果为RNAi介导抗病毒甘蔗育种研究奠定基础。 展开更多
关键词 甘蔗黄叶病毒 CP外壳蛋白 RNA干扰 ihp表达载体 烟草转化
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甘蓝型油菜PEPC基因ihpRNA表达载体的构建与遗传转化研究 被引量：4
4
作者 邢蔓 谭太龙 +3 位作者 李健 邬贤梦 官春云 熊兴华 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2016年第6期7-11,共5页
为提高油菜含油量,构建了基于油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的ihpRNA植物表达载体。分别从甘蓝型油菜基因组中克隆了种子储藏蛋白napin基因启动子(315 bp)、PEPC基因的外显子片段(246 bp)及PEPC基因的内含子(754 bp),包含了其... 为提高油菜含油量,构建了基于油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的ihpRNA植物表达载体。分别从甘蓝型油菜基因组中克隆了种子储藏蛋白napin基因启动子(315 bp)、PEPC基因的外显子片段(246 bp)及PEPC基因的内含子(754 bp),包含了其剪切位点之前4 bp和之后18 bp片段。通过中间载体pBluescriptⅡSK(+)再构建到pBI121中,构成种子特异表达的内含子剪接的PEPC基因的RNA干扰载体p BI121.NP+IP-。利用农杆菌介导法对湘油15号进行遗传转化,获得卡那霉素抗性转化植株9株,PCR检测证实外源片段成功导入其中7株油菜基因组中。对T2种子中含油量检测发现比对照提高10%左右。 展开更多
关键词 甘蓝型油菜 PEPC基因 ihprna载体 转基因油菜 含油量
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脑心肌炎病毒VP22A基因真核表达载体的构建 被引量：1
5
作者 邵帅 纪晓岚 +1 位作者 刘明启 李琼毅 《中国动物保健》 2025年第1期240-241,共2页
为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至... 为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至DH5α感受态细胞,菌液PCR鉴定阳性单克隆菌落,对阳性单克隆提取重组质粒并双酶切进行验证,对阳性重组质粒进行测序。重组质粒双酶切和测序结果表明,pc DNA3.1-Flag-VP2和pc DNA3.1-Flag-2A真核表达载体构建成功。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 VP2基因 2A基因 真核表达载体
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苏云金芽胞杆菌可视化快速表达载体的构建与特性分析
6
作者 张静安 胡孝龙 +5 位作者 曹蓓蓓 廖敏 束长龙 张杰 王奎 操海群 《生物技术通报》 北大核心 2025年第1期95-102,共8页
【目的】构建可以快速高效表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫基因的表达载体,提高Bt杀虫基因发掘及功能研究效率。【方法】以pUC18载体为基础,构建一个以cry1Ac基因启动子p1Ac指导、融合绿色荧光蛋白GFP的可视化快速... 【目的】构建可以快速高效表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫基因的表达载体,提高Bt杀虫基因发掘及功能研究效率。【方法】以pUC18载体为基础,构建一个以cry1Ac基因启动子p1Ac指导、融合绿色荧光蛋白GFP的可视化快速表达载体p1Ac-GFP,并从生物活性、碱溶性、抗胰蛋白酶稳定性、培养条件等方面对其进行分析。【结果】p1Ac-GFP在大肠杆菌中指导表达的Cry1Ac蛋白与Bt来源的蛋白在杀虫活性方面无明显差异。同时,p1Ac-GFP表达的Cry1Ac蛋白能够溶解于50 mmol/L Na_(2)CO_(3)溶液中,可溶性组分可被胰蛋白酶消化为60 kD大小的核心活性片段。此外,p1Ac-GFP大肠杆菌宿主菌株可以发出绿色荧光,培养菌液荧光强度与所表达的Bt蛋白浓度呈较好的线性关系。培养条件优化结果显示,37℃、培养液与装瓶体积比为5/5、48 h的培养时间最适合p1Ac-GFP表达Bt Cry1Ac蛋白。【结论】p1Ac-GFP表达Bt蛋白时可以直接使用菌液荧光强度作为生物活性测定的浓度指示依据,有助于Bt基因杀虫活性功能的快速批量筛选。 展开更多
关键词 苏云金芽胞杆菌 杀虫基因 cry1Ac启动子 大肠杆菌 表达载体
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山药生长素运输载体基因的表达特点及其对N-(1-奈基)邻氨甲酰苯甲酸的响应
7
作者 尹冬 徐升胜 +4 位作者 段延碧 程园 郭凤根 王仕玉 龙雯虹 《山东农业科学》 北大核心 2025年第4期32-39,共8页
为了探讨生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药(Dioscorea opposita)生长发育过程中的作用,本研究采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,通过筛选合适的内参基因,系统研究了生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药不同部位茎蔓及其他组织中的... 为了探讨生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药(Dioscorea opposita)生长发育过程中的作用,本研究采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,通过筛选合适的内参基因,系统研究了生长素运输载体基因AUXs和PINs在山药不同部位茎蔓及其他组织中的表达模式,以及其对N-(1-奈基)邻氨甲酰苯甲酸(NPA)的响应。结果如下:利用Delta Ct、NormFinder、geNorm和Comparative△Ct软件对8个候选内参基因(MYB、GADPH、TRX-2、ACT-1、EF-1α、F-box、HIS、α-TUB)的稳定性进行评价,筛选出MYB基因可用作山药不同部位茎蔓中生长素运输载体基因表达分析的内参基因。RT-qPCR分析结果表明,DoAUX2、DoAUX3、DoPIN1、DoPIN3和DoPIN7基因在山药茎蔓幼嫩部位的上端表达量高于下端表达量;DoAUX1、DoAUX2和DoPIN3基因在茎蔓成熟部位的上端表达量高于下端表达量;DoPIN3基因在茎蔓幼嫩部位和成熟部位的上端表达量高于下端。生长素运输载体基因在山药茎尖、叶片、根系、珠芽、雄花及雌花中均有表达,其中,DoAUX1、DoAUX2和DoPIN7基因在叶片中的表达量最高,DoAUX3和DoPIN1基因在茎尖中的表达量显著高于其他组织,DoPIN3和DoPIN6基因在根系中的表达量显著高于其他组织,表现出明显的组织特异性。与清水对照相比,NPA处理显著影响DoAUX1、DoAUX2、DoAUX3、DoPIN1、DoPIN3、DoPIN6和DoPIN7基因的表达,且大多表现为下调表达。综上,生长素运输载体基因通过调控生长素在山药不同组织中的分布调控其生长发育,NPA能通过调控生长素运输载体基因的表达影响生长素在山药植株中的运输。 展开更多
关键词 生长素运输载体基因 山药 表达特点 茎蔓 N-(1-奈基)邻氨甲酰苯甲酸(NPA)
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MAVS全长及其截短体真核表达载体的构建和鉴定
8
作者 玉妹 毕冬琳 +1 位作者 郑天倚 李琼毅 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第1期49-60,共12页
建立线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS)全长及截短体的真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达,为后续探索MAVS在病毒逃逸机制研究中的作用提供重要的实验材料。首先,根据NCBI数据库中人源MAVS的... 建立线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS)全长及截短体的真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达,为后续探索MAVS在病毒逃逸机制研究中的作用提供重要的实验材料。首先,根据NCBI数据库中人源MAVS的全长序列,设计截短体引物,通过PCR从cDNA模板中扩增出MAVS全长及不同截短体的基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1-3xflag载体中。随后,将构建好的载体转染到HEK-293细胞中,利用RT-PCR技术检测扩增产物大小,与目的大小进行对比,用Western blot技术检测MAVS蛋白在293细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了全长MAVS(MAVS-FL)及其截短体MAVS-△C、MAVS-△CP、MAVS-PBD、MAVS-△Tm的真核表达载体,Western blot结果表明,构建的载体蛋白在HEK-293中能够有效表达。本研究成功构建了MAVS全长及其截短体的真核表达载体,并在HEK-293细胞中表达了这些蛋白,为后续研究MAVS蛋白的功能和抗病毒机制提供了实验材料。 展开更多
关键词 线粒体抗病毒蛋白 真核表达载体 截短体构建 蛋白表达
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小鼠SGK1基因真核表达载体的构建及鉴定
9
作者 张丽娜 巴隆 孟峻 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第1期51-57,共7页
目的:构建含有小鼠血清和糖皮质激素诱导激酶(SGK)1基因的真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry,并观察载体在转染HEK293细胞后的表达情况。方法:PCR法扩增SGK1目的基因片段,并与经过HindⅢ和SbfⅠ双酶切的pcDNA3.1-MYC-C-mcherry载... 目的:构建含有小鼠血清和糖皮质激素诱导激酶(SGK)1基因的真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry,并观察载体在转染HEK293细胞后的表达情况。方法:PCR法扩增SGK1目的基因片段,并与经过HindⅢ和SbfⅠ双酶切的pcDNA3.1-MYC-C-mcherry载体连接。酶切和测序验证成功后,采用脂质体转染法将pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry转染至HEK293细胞中,Western blotting法测定HEK293细胞中真核表达载体的表达情况。结果:酶切载体条带位于5200 bp,目的基因条带位于3100 bp,与预期结果相符。Snap Gene软件比对,pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry的测序结果与预期序列一致,表明真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry构建成功。Western blotting法观察到转染后的HEK293细胞在相对分子质量49000附近显现出明显的条带,真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry成功表达。结论:成功构建真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry,为后续研究SGK1基因对小鼠受精卵细胞早期发育的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 血清和糖皮质激素诱导激酶1 真核表达载体 HEK293细胞 载体构建 质粒
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基于VIGS的不同表达载体混合接种对烤烟烟碱代谢的影响
10
作者 卜亚艇 李伟 +9 位作者 许燕彪 谢可 徐秉聪 吴剑平 叶性荣 周建军 祖琼瑶 杨再军 郑聪 徐世晓 《江苏农业科学》 北大核心 2025年第3期16-23,共8页
烟碱的代谢具有复杂的基因调控网络,其中众多基因间存在相互影响,为探究不同基因共同沉默后对烟碱代谢通路以及叶片烟碱含量的影响。使用前期构建的烟碱代谢途径中3个功能基因(NtA622、NtPMT、NtBBL)和1个调控基因(NtMYB305a)病毒载体,... 烟碱的代谢具有复杂的基因调控网络,其中众多基因间存在相互影响,为探究不同基因共同沉默后对烟碱代谢通路以及叶片烟碱含量的影响。使用前期构建的烟碱代谢途径中3个功能基因(NtA622、NtPMT、NtBBL)和1个调控基因(NtMYB305a)病毒载体,利用病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术依据基因在烟碱代谢中的作用性质和作用阶段,设置不同载体组合浸染液接种处理,测定各处理的基因相对表达量、酶活性、烟碱含量,系统分析目的基因沉默效率以及沉默后对其他基因表达的影响,并探究各处理的基因平均沉默效率对烟碱降低率的贡献度。结果表明,各处理沉默相应目的基因,会在一定程度上影响本研究中其他目的基因的表达,其中NtA622基因受影响较小,而NtPMT、NtBBL基因受影响较大;各处理烟碱含量均得到降低,其中D6处理4个基因共同沉默后烟碱含量降低幅度最大,PMT、BBL活性与烟碱含量趋势基本一致,A622活性与烟碱含量趋势不完全一致;基因平均沉默效率低于烟碱含量降低率越多,说明对烟碱降低的贡献度越大,基因平均沉默效率高于烟碱含量降低率越多,说明对烟碱降低的贡献度越小。由此可知,利用VIGS技术可有效沉默目的基因的表达,进而降低叶片中烟碱含量,其中4个基因共同沉默后,烟碱含量降低最多;在烟碱代谢途径上,NtA622基因相对较稳定,而NtPMT与NtBBL基因相对不稳定;PMT、BBL活性与烟碱含量趋势基本一致。本研究为烤烟烟碱的分子调控提供了理论和技术支撑。 展开更多
关键词 VIGS 混合载体 烟碱 基因表达量 酶活性 基因平均沉默效率
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牛源IFI6基因的克隆及其蛋白生物信息学分析与真核表达载体构建
11
作者 肖芳 嵇辛勤 《贵州畜牧兽医》 2025年第1期30-34,共5页
为构建牛源IFI6基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法扩增牛肾细胞(MDBK)的IFI6基因,对其蛋白的理化性质、蛋白亲/疏水性、信号肽、跨膜结构域、二/三级结构进行预测分析,并构建牛源IFI6基因真核表达载体pEGFP-N1-IFI6。结果:牛源IFI6... 为构建牛源IFI6基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法扩增牛肾细胞(MDBK)的IFI6基因,对其蛋白的理化性质、蛋白亲/疏水性、信号肽、跨膜结构域、二/三级结构进行预测分析,并构建牛源IFI6基因真核表达载体pEGFP-N1-IFI6。结果:牛源IFI6基因开放读码框序列长度为405 bp,编码134个氨基酸,蛋白分子质量为32425.61 u,等电点为5.20,不稳定系数为57.75(>40),属于不稳定疏水性蛋白质,存在信号肽和跨膜结构域;Eco RⅠ、Bam HⅠ双酶切的pEGFP-N1-IFI6重组质粒扩增出4700、405 bp条带,分别与pEGFP-N1、IFI6基因相符。结论:pEGFP-N1-IFI6真核表达载体构建成功,可为家畜的抗病毒研究奠定基础。 展开更多
关键词 IFI6基因 生物信息学分析 表达载体构建
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多根紫萍SpLAR基因的克隆、表达分析及表达载体构建
12
作者 刘文英 左研熙 +2 位作者 何舒萍 杨璞 向蓓蓓 《湖北农业科学》 2025年第7期120-127,共8页
为探究多根紫萍(Spirodela polyrrhiza)中无色花青素还原酶编码基因SpLAR在原花青素生物合成中的作用,基于多根紫萍转录组数据获取SpLAR全长cDNA序列,成功克隆该基因;对SpLAR蛋白的特性进行预测,并检测了不同培养天数及营养胁迫条件下Sp... 为探究多根紫萍(Spirodela polyrrhiza)中无色花青素还原酶编码基因SpLAR在原花青素生物合成中的作用,基于多根紫萍转录组数据获取SpLAR全长cDNA序列,成功克隆该基因;对SpLAR蛋白的特性进行预测,并检测了不同培养天数及营养胁迫条件下SpLAR基因的表达水平;通过测定相应条件下原花青素的积累量,进一步分析了SpLAR基因表达量与原花青素积累量之间的相关性;并采用同源重组技术构建了pCAMBIA1301-SpLAR植物表达载体。生物信息学分析结果显示,该基因全长1059 bp,编码352个氨基酸,预测分子质量为38 ku,为亲水性不稳定蛋白,含有一个跨膜结构域,无信号肽,属于NADB_Rossmann超家族,SpLAR蛋白与芋(Colocasia esculenta)同源蛋白相似性最高;RT-qPCR及含量测定结果表明,SpLAR基因的表达量呈先升高后降低的动态变化趋势,且与原花青素积累量呈正相关,Datko处理下,在9 d时SpLAR基因表达量最高,此时原花青素积累量达到峰值20.6 mg/g。营养胁迫处理可显著促进SpLAR基因的表达及原花青素的生物合成,使积累量在9 d提升至24.8 mg/g。 展开更多
关键词 多根紫萍(Spirodela polyrrhiza) SpLAR基因 生物信息学 表达分析 载体构建
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蛋鸡CCND1基因真核表达载体的构建及在卵泡不同发育时期的时空表达模式研究
13
作者 邹贤群 余静 +1 位作者 刘永杰 陈晓霞 《饲料研究》 北大核心 2025年第9期64-69,共6页
试验旨在探究细胞周期蛋白D1(CCND1)基因在蛋鸡卵泡不同发育时期的时空表达模式,进一步研究CCND1基因的分子生物学作用,构建真核表达载体,并预测CCND1基因在蛋鸡卵泡发育过程中的具体分子作用。选用150日龄海兰褐蛋鸡不同大小的卵泡为... 试验旨在探究细胞周期蛋白D1(CCND1)基因在蛋鸡卵泡不同发育时期的时空表达模式,进一步研究CCND1基因的分子生物学作用,构建真核表达载体,并预测CCND1基因在蛋鸡卵泡发育过程中的具体分子作用。选用150日龄海兰褐蛋鸡不同大小的卵泡为试验材料,运用半定量RT-PCR、免疫组化等技术,在分子水平上进行时空表达模式研究与分析。通过酶切位点BamH I和XhoI的双酶切验证连接产物的正确性后进行测序,将测序正确的真核表达载体转染至鸡卵巢的颗粒细胞,利用实时荧光定量PCR技术对转染效果进行确认。结果显示,卵泡直径为5~6 mm和6~7 mm的CCND1的mRNA表达量显著高于其他各卵泡(P<0.05)。在前等级卵泡的卵母细胞和间质中可以观察到CCND1蛋白定位。经过菌落PCR扩增和测序分析,成功构建了真核表达载体pYr-adshuttle-4-CCND1,并将其有效转染至鸡卵泡的颗粒细胞。研究表明,试验可推测CCND1基因在蛋鸡卵泡生长发育过程中发挥一定的作用,为未来的基因功能研究和潜在应用提供了必要的分子基础和工具支持。 展开更多
关键词 蛋鸡 细胞周期蛋白D1(CCND1) 卵泡 真核表达载体 时空表达
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PRDM5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染Neuro-2a细胞的建立
14
作者 吴钊淳 李友 +2 位作者 何嘉文 廖科棋 李胜男 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第1期1-8,共8页
目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列... 目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列,将其与Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶双酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-PRDM5过表达重组质粒,采用PCR法筛选并鉴定出的与目的基因片段长度相近的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序正确的GV492-control质粒和GV492-PRDM5过表达重组质粒分别转染至人胚胎肾细胞HEK293T中,转染48 h后离心收集慢病毒,分别为GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒,采用慢病毒滴度测定法检测上述2种慢病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-control组和GV492-PRDM5组,分别使用GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后使用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))对成功感染GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的Neuro-2a细胞进行筛选,通过荧光显微镜观察GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平;Western blotting法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平。结果:PCR法,GV492-PRDM5重组质粒阳性转化子的长度约为684 bp,GV492-PRDM5过表达重组质粒基因序列与设计合成的PRDM5过表达序列一致;GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的滴度均为2.5×108 TU·mL^(-1)。荧光显微镜,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态均良好,且能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-qPCR法,与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞在相对分子质量为75000附近出现特异性条带;与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平升高(P<0.01)。结论:成功构建PRDM5过表达慢病毒载体,建立了稳定转染的GV492-PRDM5-Neuro-2a细胞。 展开更多
关键词 PR锌指区域蛋白 过表达慢病毒载体 稳定表达 Neuro-2a细胞
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九龙牦牛ELOVL3基因克隆、真核表达载体构建及组织表达谱分析
15
作者 司比努尔·牙生江 者玉琦 +2 位作者 钟金城 武志娟 柴志欣 《华北农学报》 北大核心 2025年第2期201-209,共9页
极长链脂肪酸延伸酶3(ELOVL3)主要参与合成极长链脂肪酸(VLCFA),在脂肪酸代谢过程中扮演重要角色。旨为克隆九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列,构建ELOVL3基因真核表达载体,并预测分析其生物学功能,通过PCR技术扩增九龙牦牛ELOVL3基因的... 极长链脂肪酸延伸酶3(ELOVL3)主要参与合成极长链脂肪酸(VLCFA),在脂肪酸代谢过程中扮演重要角色。旨为克隆九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列,构建ELOVL3基因真核表达载体,并预测分析其生物学功能,通过PCR技术扩增九龙牦牛ELOVL3基因的CDS区序列,并通过同源重组将其插入到pcDNA3.1载体中以构建重组质粒。采用限制性酶切及PCR技术验证重组质粒,结合测序结果,利用在线预测软件分析其蛋白编码序列的生物学功能。另外,针对ELOVL3基因在mRNA水平和蛋白水平的表达量,进行qPCR和Western Blot检测。结果表明:九龙牦牛ELOVL3基因的蛋白编码序列全长813 bp,共编码270个氨基酸;酶切、PCR及测序鉴定,确认成功构建pcDNA3.1-ELOVL3真核表达载体。生物信息学分析结果显示,ELOVL3基因编码蛋白属于疏水性蛋白,共有6个跨膜结构域及27个磷酸化位点。系统发育树显示,与九龙牦牛亲缘关系最近的是普通牛,最远的是原鸡。此外,ELOVL3基因在九龙牦牛肺脏组织中表达量最高。 展开更多
关键词 牦牛 ELOVL3基因 基因克隆 真核表达载体构建
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木薯Ⅴ型几丁质酶MeCHITV基因生物信息学分析及其表达载体构建
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作者 刘沁雲 向春瑜 蔡杰 《福建农林大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第3期289-298,共10页
【目的】研究木薯Ⅴ型几丁质酶基因MeCHITV,以为后续阐明其在共生中的功能奠定基础,并为木薯高效栽培与养分利用提供理论依据。【方法】通过RT-PCR技术成功克隆了SC8木薯中的Ⅴ型几丁质酶基因MeCHITV,并采用生物信息学方法对其蛋白结构... 【目的】研究木薯Ⅴ型几丁质酶基因MeCHITV,以为后续阐明其在共生中的功能奠定基础,并为木薯高效栽培与养分利用提供理论依据。【方法】通过RT-PCR技术成功克隆了SC8木薯中的Ⅴ型几丁质酶基因MeCHITV,并采用生物信息学方法对其蛋白结构、组织特异性表达模式和遗传进化关系进行了全面分析。构建了MeCHITV基因的原核表达载体、过表达载体和基因编辑载体。【结果】MeCHITV基因的编码序列(CDS)全长1137 bp,编码378个氨基酸。MeCHITV蛋白的分子质量为42.09 ku,等电点为6.92,不稳定系数为33.97,是稳定蛋白且具有亲水性。其N端含有一个由21个氨基酸组成的信号肽序列。二级结构由33.33%的α螺旋、4.76%的β折叠、41.01%无规则卷曲和20.90%延伸链构成。与截形苜蓿Ⅴ型几丁质酶MtNFH1的同源性最高,亲缘关系最近。MeCHITV基因在木薯须根中表达量最高。此外,成功构建了原核表达载体pET28a-MeCHIV、过表达载体pCAMBIA1300-35S-MeCHITV和基因编辑载体pYAO:hSpCas9-MeCHITV,并分别成功转化至原核表达菌株Rossetta(DE3)和根癌农杆菌LBA4404。【结论】根据MeCHITV基因在须根中的高表达及对其所编码蛋白的结构,推断MeCHITV在根际发挥功能。结合同源性蛋白功能的分析,推测MeCHITV参与了木薯与丛枝菌根真菌(AMF)共生信号的调控。 展开更多
关键词 木薯 丛枝菌根真菌 Ⅴ型几丁质酶 MeCHITV 表达载体 基因编辑
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甘蓝型油菜种子特异性表达fad2基因的ihpRNA载体构建 被引量：9
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作者 陈松 张杰夫 +4 位作者 陈峰 陈新军 龙卫华 浦惠明 戚存扣 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期251-256,共6页
旨在通过转基因途径诱导油菜种子中fad2基因发生转录后基因沉默,本文构建了fad2基因的ihpRNA植物表达载体。通过PCR扩增分离到甘蓝型油菜种子特异性表达的Nap in启动子序列(1147bp)以及油酸脱饱和酶基因(fad2)的一个537bp的片段,并将它... 旨在通过转基因途径诱导油菜种子中fad2基因发生转录后基因沉默,本文构建了fad2基因的ihpRNA植物表达载体。通过PCR扩增分离到甘蓝型油菜种子特异性表达的Nap in启动子序列(1147bp)以及油酸脱饱和酶基因(fad2)的一个537bp的片段,并将它们分别克隆到pGEM-T easy载体中。利用中间载体pHurrican构建fad2基因的反向重复框。将fad2基因片段以正向的方式连接在一个可剪切的内含子的5’末端,而以反向的方式连接到该内含子的3’末端;然后将Nap in启动子序列连接到该反向重复框的5’端,而在其3’端接有一个nos终止子序列;最后将fad2基因的反向重复表达框分两步克隆到植物双元载体pCAMB IA2300的pUC18多克隆位点,构建具有种子特异性表达的fad2基因的ihpRNA表达载体pCNFIRnos。限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。 展开更多
关键词 甘蓝型油菜 FAD2基因 ihprna表达载体
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大豆BBi基因ihpRNA种子特异性表达载体的构建 被引量：5
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作者 付永平 张君 +2 位作者 王丕武 周海涛 曲静 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2010年第1期83-89,96,共8页
【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和... 【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GFP基因片段,分别连入克隆载体pMD18-T Vector中。然后根据植物中ihpRNA原理,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将组成RNAi载体的4个目的片段分别连入其中,然后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。【结果】PCR扩增得到组成RNAi载体的4个目的片段,分别构建成重组克隆载体和ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,并转化得到含有p7αP-GFP-BBiS的农杆菌EHA101和EHA105。【结论】成功构建了具有BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,BBi基因的ihpRNA表达框架成功转入到农杆菌中。 展开更多
关键词 大豆 蛋白酶抑制剂BBi基因 ihprna表达载体 种子特异性启动子
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Floral-dip转化法将PEPC基因ihpRNA干扰表达载体导入甘蓝型油菜 被引量：4
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作者 付绍红 张汝全 牛应泽 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期764-769,共6页
根据磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)基因控制油菜籽中蛋白质与脂肪酸合成的原理,构建了PEPC基因片段ihpRNA干扰表达载体,该载体包含了一个PEPC基因片段正反向序列的回文结构.表达RNA干扰的载体结构(ihpRNA),在大肠杆菌体内进行克隆的过程... 根据磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)基因控制油菜籽中蛋白质与脂肪酸合成的原理,构建了PEPC基因片段ihpRNA干扰表达载体,该载体包含了一个PEPC基因片段正反向序列的回文结构.表达RNA干扰的载体结构(ihpRNA),在大肠杆菌体内进行克隆的过程中易被大肠杆菌自身携带的某种酶剪切,剪切位点不确定,可能是一种随机性的剪切.通过反复实验,最终获得了一个与我们设计一致的PEPC基因片段正反向序列结构,RNA干扰表达载体构建获得成功.利用花序浸渍法(floral-dip)转基因将构建的PEPC基因ihpRNA干扰表达载体转移到甘蓝型油菜中,并通过抗性筛选、PCR特异扩增、PCR-Southern杂交和克隆测序,对获得的转基因植株进行了鉴定,转化率达到了0.69%,说明floral-dip方法有效地实现了ihpRNA干扰表达载体的遗传转化. 展开更多
关键词 花序浸渍法(floral-dip) 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因 ihprna表达载体 甘蓝型油菜 遗传转化
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鸡柔嫩艾美耳球虫EtIMP1基因的克隆与表达载体的构建
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作者 廖加磊 《福建畜牧兽医》 2025年第2期54-56,共3页
本研究对鸡柔嫩艾美耳球虫RNA进行提取及反转录,克隆鸡柔嫩艾美耳球虫IMP1基因,并将PCR产物连接于pEasy-Blunt-Simple载体中,PCR鉴定正确后送公司测序,进行序列分析。结果:成功克隆鸡柔嫩艾美耳球虫EtIMP1基因,其ORF长度为1 194 bp,并... 本研究对鸡柔嫩艾美耳球虫RNA进行提取及反转录,克隆鸡柔嫩艾美耳球虫IMP1基因,并将PCR产物连接于pEasy-Blunt-Simple载体中,PCR鉴定正确后送公司测序,进行序列分析。结果:成功克隆鸡柔嫩艾美耳球虫EtIMP1基因,其ORF长度为1 194 bp,并验证了其正确性;构建鸡柔嫩艾美耳球虫EtIMP1基因表达载体pEasy-Blunt-Simple-IMP1,并得到重组质粒,可为体外表达IMP1基因提供技术方法,也为疫苗候选基因的筛选奠定基础。 展开更多
关键词 鸡柔嫩艾美耳球虫 IMP1基因 克隆 表达载体 PCR
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