伪狂犬病病毒Bartha株gC膜外区部分基因的原核表达及纯化 被引量：1

1

作者 刘庆伟 邱亚峰 +6 位作者 王晓杜 郭林 刘超 沈阳 李向东 单虎 马志永 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第2期1-4,共4页

构建伪狂犬病病毒(PRV)gC膜外区部分基因的重组质粒,原核表达并纯化目的蛋白。根据GenBank已发表的伪狂犬病病毒Bartha(PRV Ba)株gC基因的序列(NC EU719641),设计并合成了1对引物,以PRV Ba株为模板,PCR扩增出PRV gC膜外区部分基因片段;... 构建伪狂犬病病毒(PRV)gC膜外区部分基因的重组质粒,原核表达并纯化目的蛋白。根据GenBank已发表的伪狂犬病病毒Bartha(PRV Ba)株gC基因的序列(NC EU719641),设计并合成了1对引物,以PRV Ba株为模板,PCR扩增出PRV gC膜外区部分基因片段;将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a上,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得大小为35 ku的重组蛋白,命名为pET-gCN813。按照His-Bind纯化试剂盒说明书纯化表达产物,获得融合蛋白的纯化产物。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 GC基因 原核表达 融合蛋白 纯化

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梨果实花青苷调控因子PyWRKY26蛋白表达分析

2

作者 颜龙飞 张华 +2 位作者 肖钰薇 姚改芳 胡康棣 《合肥工业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第2期227-231,共5页

花青苷是形成红皮梨的主要色素类物质,其合成受一系列转录因子的调控。PyWRKY26是参与红皮梨花青苷合成的主要转录因子,但是其蛋白结构特征并不清楚。文章以‘红茄梨’果皮为实验材料,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR... 花青苷是形成红皮梨的主要色素类物质,其合成受一系列转录因子的调控。PyWRKY26是参与红皮梨花青苷合成的主要转录因子,但是其蛋白结构特征并不清楚。文章以‘红茄梨’果皮为实验材料,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)克隆PyWRKY26基因的编码序列(coding sequence,CDS)全长;采用同源重组克隆技术将PyWRKY26与带His标签的pCOLD原核表达载体进行连接,将重组表达载体转化到大肠杆菌Rosetta(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)法诱导重组蛋白表达,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。结果表明:在‘红茄梨’果皮中能成功扩增出PyWRKY26基因的CDS全长,并构建了PyWRKY26-pCOLD重组表达载体;将重组质粒的大肠杆菌置于22℃条件下,用0.5 mmol/L IPTG诱导16 h,与对照相比,该诱导条件下能成功表达蛋白;通过His镍柱纯化法并结合SDS-PAGE检测技术得到了纯化后含量较高的PyWRKY26-pCOLD融合蛋白,为进一步研究转录因子PyWRKY26的蛋白结构及功能奠定了重要基础。 展开更多

关键词 红茄梨 PyWRKY26基因 基因克隆 原核表达 蛋白纯化

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草胺膦抗性基因bar的原核表达与蛋白质纯化 被引量：2

3

作者 薄慧杰 卢长明 +4 位作者 吴刚 武玉花 肖玲 白延红 陈耀锋 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2007年第2期83-87,共5页

通过PCR扩增,从pCAMBIA1300-bar质粒中获得bar基因编码区全长,经酶切鉴定和测序后证实,bar基因分离成功。用BamH和Hind酶切,将bar基因与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组质粒pET28bar。将重组质粒pET28 bar转化大肠杆菌菌株BL21(D... 通过PCR扩增,从pCAMBIA1300-bar质粒中获得bar基因编码区全长,经酶切鉴定和测序后证实,bar基因分离成功。用BamH和Hind酶切,将bar基因与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组质粒pET28bar。将重组质粒pET28 bar转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后,获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析显示,目的蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白质分子量约为27 ku。将包涵体离心、洗涤和纯化后,得到高纯度的目的蛋白。该蛋白可以替代植物外源蛋白进行转bar基因产品的食用安全性检测,也可用于转bar基因产品ELISA检测的抗体制备。 展开更多

关键词 抗除草剂基因bar原核表达 蛋白纯化 转基因产品检测

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牛种布鲁氏菌ArsR2蛋白的原核表达及磷酸化位点鉴定 被引量：1

4

作者 刘科蒙 耿好 +3 位作者 苏梦茹 许健 支飞杰 储岳峰 《动物医学进展》 北大核心 2024年第9期39-44,共6页

用原核表达系统表达并纯化牛种布鲁氏菌S2308株ArsR2蛋白,软件分析该蛋白相关信息,质谱鉴定该蛋白修饰位点。以牛种布鲁氏菌S2308株基因组为模板,通过PCR扩增arsR2基因,构建pET-32a-ArsR2重组质粒,经测序正确后,转化至大肠埃希氏菌感受... 用原核表达系统表达并纯化牛种布鲁氏菌S2308株ArsR2蛋白,软件分析该蛋白相关信息,质谱鉴定该蛋白修饰位点。以牛种布鲁氏菌S2308株基因组为模板,通过PCR扩增arsR2基因,构建pET-32a-ArsR2重组质粒,经测序正确后,转化至大肠埃希氏菌感受态细胞BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析法进行ArsR2蛋白的纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;对牛种布鲁氏菌ArsR2蛋白的理化性质和磷酸化位点进行预测,通过质谱鉴定ArsR2蛋白的修饰位点。结果显示,成功表达并纯化ArsR2蛋白,ArsR2蛋白无跨膜区,存在磷酸化修饰,质谱鉴定出ArsR2蛋白具有2个磷酸化位点。表明原核表达的牛种布鲁氏菌S2308株ArsR2蛋白存在磷酸化修饰位点,为探究该蛋白的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 arsR2基因 原核表达 蛋白纯化

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多花黄精查尔酮合酶PcCHS的原核表达、亚细胞定位及表达分析 被引量：1

5

作者 潘萍萍 徐志浩 +2 位作者 张怡雯 李青 王忠华 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期280-289,共10页

【目的】探究查尔酮合酶(chalcone synthase,PcCHS)基因在多花黄精类黄酮合成中的作用,为后续解析PcCHS功能以及多花黄精新品种选育提供可靠的理论依据。【方法】以多花黄精为cDNA模板,克隆多花黄精PcCHS基因的编码序列,对该基因进行生... 【目的】探究查尔酮合酶(chalcone synthase,PcCHS)基因在多花黄精类黄酮合成中的作用,为后续解析PcCHS功能以及多花黄精新品种选育提供可靠的理论依据。【方法】以多花黄精为cDNA模板,克隆多花黄精PcCHS基因的编码序列,对该基因进行生物信息学分析。通过构建PcCHS的原核表达载体,纯化目的重组蛋白,验证该酶的体外表达活性。利用瞬时超表达体系探究该基因过表达后总黄酮的含量变化。利用Gateway技术构建亚细胞定位载体35S::PcCHS-GFP,通过本氏烟草表达系统确定目的蛋白亚细胞定位情况。【结果】PcCHS基因的开放阅读框为1 251 bp,理论分子量为44.63 kD,等电点为5.89,属于亲水蛋白,与石刁柏(Asparagus officinalis)CHS亲缘关系较近。原核表达实验表明,pET28a-PcCHS经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达可溶性重组蛋白,Western-blot显示大小约为45 kD,与预期大小一致,且纯化的目的蛋白具有一定的酶活性,能催化对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A转化为柚皮素查尔酮。此外,PcCHS瞬时超表达中,PcCHS组的表达量显著高于空载K组,总黄酮含量也显著高于空载K组,最高可达1.83倍。亚细胞定位结果显示,该基因在细胞膜和细胞核中发挥作用。【结论】PcCHS基因原核表达的酶具有体外酶活性,其亚细胞定位于细胞膜和细胞核,且瞬时超表达能够显著提高多花黄精叶片总黄酮含量。 展开更多

关键词 多花黄精 查尔酮合酶基因(CHS) 原核表达 瞬时超表达 蛋白纯化 体外酶活 亚细胞定位

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家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)的基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备 被引量：14

6

作者 查宏贤 刘罡 +6 位作者 张晨 王彦云 卫正国 李兵 陈玉华 许雅香 沈卫德 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期642-647,共6页

丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员。本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyxmoriserpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础。首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技... 丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员。本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyxmoriserpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础。首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技术构建了pET28a-serpin-4原核表达载体,经IPTG诱导,获得原核表达重组融合蛋白,利用镍柱回收纯化技术,获得目的蛋白;经SDS-PAGE和抗His多抗检测,纯化蛋白的分子量大小与预测的一致,即获得了高纯度的目的蛋白,以此蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对昆明小鼠进行抗原免疫,最终获得抗serpin-4的多克隆抗体血清;该血清经ELISA和Westernblot验证,效价达到1:20000,特异性较好。家蚕serpin-4多克隆抗体的成功制备,一方面表明应用于其他生物的多克隆抗体制备所采用的方法对于家蚕serpin基因的研究同样适用;另一方面,也为深入研究家蚕serpin-4的生理功能打下了物质基础。 展开更多

关键词 家蚕 丝氨酸蛋白酶抑制剂 基因克隆 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体

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小麦TaPDK基因的序列分析、原核表达及纯化 被引量：8

7

作者 杨书玲 张龙雨 +5 位作者 张改生 桑青 刘红占 朱启迪 张新钵 赵新亮 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1081-1089,共9页

为研究TaPDK蛋白在小麦生理型雄性不育过程能量代谢途径中的调控机制。本试验提取小麦花药总RNA并反转录为cDNA,根据GenBank报道的已知小麦PDK基因序列设计引物,扩增TaPDK基因的编码区,采用生物信息学方法对其进行序列分析与功能预测,得... 为研究TaPDK蛋白在小麦生理型雄性不育过程能量代谢途径中的调控机制。本试验提取小麦花药总RNA并反转录为cDNA,根据GenBank报道的已知小麦PDK基因序列设计引物,扩增TaPDK基因的编码区,采用生物信息学方法对其进行序列分析与功能预测,得出TaPDK的ORF为1095bp,编码364个氨基酸,蛋白分子量为41kD。进一步构建原核表达载体PET23d-PDK,转化到大肠杆菌表达菌种E.coli BL21(DE3)中进行优化表达,融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot验证后利用亲和层析柱初步纯化,针对原核表达过程中出现的非特异蛋白,采用切胶处理的方法进行二次纯化。原核表达结果表明IPTG可诱导一个分子量约40kD的特异蛋白,且主要以包涵体的形式存在,优化表达条件为:28℃、0.8mmol.L-1IPTG、150r.min-1诱导表达4h,表达产物经两次纯化得到2mg的目的蛋白,为下一步制备多克隆抗体、寻找互作蛋白奠定基础。 展开更多

关键词 小麦 TaPDK基因 原核表达 蛋白纯化 WESTERN BLOT

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人S100A6-GST融合蛋白的原核表达和纯化 被引量：8

8

作者 苗静琨 赖天霞 +5 位作者 左国伟 李星星 王嫣 蒋薇 何通川 周兰 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2007年第10期1009-1012,共4页

目的:制备人S100A6-GST融合蛋白,为研究人S100A6((hS100A6)蛋白的功能奠定基础。方法:从pHAHA-hS100A6中双酶切获取hS100A6基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-moluc-hS100A6,转化BL21后,IPTG诱导重组菌表达hS100A6蛋白,SDS-... 目的:制备人S100A6-GST融合蛋白,为研究人S100A6((hS100A6)蛋白的功能奠定基础。方法:从pHAHA-hS100A6中双酶切获取hS100A6基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-moluc-hS100A6,转化BL21后,IPTG诱导重组菌表达hS100A6蛋白,SDS-PAGE及WesternBlot鉴定表达产物,Glutathion-Sepharose4B球珠分离纯化。结果:重组菌株表达出与理论预测值相符的一个约36ku的hS100A6融合蛋白,纯化后的融合蛋白的产量为3mg/L菌液,纯度约92%。结论:成功构建了hS100A6-GST原核表达质粒,在大肠杆菌中表达纯化后得到较高浓度的hS100A6-GST融合蛋白,为hS100A6蛋白功能的研究打下了基础。 展开更多

关键词 人S100A6基因 融合蛋白 原核表达 蛋白纯化

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毛白杨NBS型基因PtDRG01原核表达研究 被引量：6

9

作者 李琰 张谦 +3 位作者 李海霞 刘婷婷 安新民 张志毅 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期882-888,共7页

为了分析毛白杨NBS型抗病基因PtDRG01(EF157840)编码蛋白的特性,研究构建了该基因的原核表达载体pGEX-Pt01,并导入大肠杆菌XA90,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证明,该特异蛋白的分子量约为79kD。对原核表达体系以及融合蛋白的表达... 为了分析毛白杨NBS型抗病基因PtDRG01(EF157840)编码蛋白的特性,研究构建了该基因的原核表达载体pGEX-Pt01,并导入大肠杆菌XA90,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证明,该特异蛋白的分子量约为79kD。对原核表达体系以及融合蛋白的表达特性进行优化与分析表明:最佳诱导表达条件为1mmol/L IPTG在37℃下诱导4h,所表达的融合蛋白为胞内分泌的可溶性蛋白。利用谷胱苷肽-琼脂糖亲和层析柱纯化获得了电泳纯级的目标蛋白,为PtDRG01基因编码蛋白的功能鉴定研究奠定了基础。 展开更多

关键词 毛白杨 NBS型基因 原核表达 蛋白纯化

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山羊Sox2基因克隆、原核表达和GST融合蛋白纯化 被引量：4

10

作者 郑喜邦 杨照海 +4 位作者 刘平 赵华 卢晟盛 卢克焕 毕方方 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1454-1459,共6页

本研究旨在克隆山羊Sox2基因,构建pGEX-Sox2原核表达重组质粒,从大肠杆菌中获得纯化的GST-Sox2融合蛋白。应用RT-PCR方法从6周龄胎山羊生殖嵴扩增Sox2基因编码全序列,将其克隆到pMD18-T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体。重组质粒pGE... 本研究旨在克隆山羊Sox2基因,构建pGEX-Sox2原核表达重组质粒,从大肠杆菌中获得纯化的GST-Sox2融合蛋白。应用RT-PCR方法从6周龄胎山羊生殖嵴扩增Sox2基因编码全序列,将其克隆到pMD18-T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体。重组质粒pGEX-Sox2转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳及Western blotting检测GST-Sox2融合蛋白表达,用谷胱甘肽Sepharose 4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明,山羊Sox2基因编码序列全长为960 bp;在优化的表达条件(1 mmol.L-1IPTG,22℃诱导16h)下,重组质粒(pGEX-Sox2)在大肠杆菌得到了高效表达;谷胱甘肽Sepharose 4B颗粒纯化蛋白得到预期大小的融合蛋白(约60 ku)。结论,本研究克隆了山羊Sox2基因,获得了纯化的GST-Sox2融合蛋白,为制备其多克隆抗体奠定了基础,为进一步研究山羊iPS细胞(Induced pluripotent stem cells)创造了条件。 展开更多

关键词 Sox2基因 原核表达 蛋白纯化 山羊

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肿瘤转移抑制基因Nm23-H1融合蛋白的表达纯化及其功能的初步研究 被引量：4

11

作者 张志敏 杨雪琴 +5 位作者 许文 戴楠 曾林立 李增鹏 王东 王阁 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第17期1824-1827,共4页

目的利用人Nm23-H1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,并对蛋白其活性进行初步分析。方法将重组质粒pET28a-Nm23-H1转化入E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定。用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到Nm23-H1融合蛋白,用S... 目的利用人Nm23-H1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,并对蛋白其活性进行初步分析。方法将重组质粒pET28a-Nm23-H1转化入E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定。用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到Nm23-H1融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot鉴定纯化蛋白,并用RP-HPLC法、电泳迁移率变动分析实验检测Nm23-H1融合蛋白的核苷二磷酸激酶(NDPK)活性及核酸内切酶(AP)修复活性。结果转化溶原菌后能够表达目的蛋白,蛋白表达量高,为可溶性蛋白。Ni2+柱纯化后得到Nm23-H1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确。RP-HPLC法就及电泳迁移率变动分析实验证明所纯化的Nm23-H1融合蛋白具有NDPK活性,不具有AP修复活性,但可以增加APE1蛋白的AP修复活性。结论利用原核表达载体pET28a-Nm23-H1在E.coliBL21(DE3)中高效表达和纯化得到具有NDPK活性,但无AP修复活性的Nm23-H1融合蛋白,此蛋白可以增强APE1蛋白的AP修复活性,共同参与细胞的DNA损伤修复。 展开更多

关键词 NM23-H1基因 原核表达 蛋白纯化

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烟粉虱MED隐种气味结合蛋白基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA克隆及原核表达 被引量：4

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作者 谢红艳 万鲁长 +3 位作者 黄春燕 刘国霞 Jean-Francois Picimbon 宫志远 《环境昆虫学报》 CSCD 北大核心 2017年第4期752-761,共10页

采用RT-PCR和RACE技术成功克隆烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA全长。BtabOBP2(Gen Bank登录号:AIS71883)和BtabOBP4(Gen Bank登录号:AIS71884)的cDNA序列全长... 采用RT-PCR和RACE技术成功克隆烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA全长。BtabOBP2(Gen Bank登录号:AIS71883)和BtabOBP4(Gen Bank登录号:AIS71884)的cDNA序列全长分别为1107 bp和874 bp,完整开放阅读框(ORF)分别为744 bp和429 bp,分别编码247和142氨基酸,BtabOBP4有6个保守的半胱氨酸,属于典型OBP,而BtabOBP2除了具有典型OBP的6个半胱氨酸,增加了3个保守的半胱氨酸,属于Plus-C OBP。将得到的BtabOBP2和BtabOBP4重组到原核表达载体pET30a(+),转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,用IPTG诱导融合蛋白表达。采用亲和层析和凝胶过滤层析纯化融合蛋白,并进行Western blot分析。结果显示,BtabOBP2和BtabOBP4融合蛋白在大肠杆菌中均有可溶性表达,Western blot结果证实所表达的融合蛋白确实为目的蛋白。BtabOBP2融合蛋白在SDS-PAGE中的表观分子量比预测的分子量大了6.53 k Da,用重组肠激酶切掉6×His标签后,目的蛋白的表观分子量与预测分子量相近,偏差降低,说明6×His标签是造成融合蛋白表观分子量偏差的原因。本研究明确了烟粉虱气味结合蛋白基因BtabOBP2和BtabOBP4的核苷酸、氨基酸序列特征,并成功进行了原核表达和纯化,为进一步研究这两个OBP基因的分子结构和功能奠定了基础。 展开更多

关键词 烟粉虱 气味结合蛋白 基因克隆 原核表达 纯化

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家蚕孵化酶样基因BmHEL的原核表达及蛋白纯化与功能鉴定 被引量：4

13

作者 唐顺明 卢福浩 +5 位作者 沈兴家 王娜 丁丽平 赵巧玲 张国政 郭锡杰 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期407-412,共6页

孵化酶(hatchingenzyme,HE)是后生动物卵孵化过程中起关键作用的一类蛋白酶。在已完成全长967bp的家蚕孵化酶样基因(BmHEL)克隆及其转录特性分析的基础上,研究了该基因在原核表达系统的表达、产物纯化及其对家蚕卵壳的降解功能。以全长B... 孵化酶(hatchingenzyme,HE)是后生动物卵孵化过程中起关键作用的一类蛋白酶。在已完成全长967bp的家蚕孵化酶样基因(BmHEL)克隆及其转录特性分析的基础上,研究了该基因在原核表达系统的表达、产物纯化及其对家蚕卵壳的降解功能。以全长BmHEL质粒DNA为模板,用PCR方法分别获得了该基因的开放阅读框(BmHELORF,885bp)、缺失信号肽编码区(BmHELa,834bp)和推测成熟酶功能编码区(BmHELb,624bp)的3个片段,并亚克隆入原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌(E.coli)BL21中进行表达。表达的3种外源蛋白均以包涵体形式存在,获得含有6×His-Tag标签的融合蛋白,其分子质量分别为33.4、31.8、24.0kD。通过Westernblot方法检测到了用Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白。纯化复性后的3种孵化酶对家蚕卵壳底物有一定降解活性,其中BmHELORF的活性最高,BmHELb的活性最低。在pH7.1反应条件下3种酶的活性比pH9.5时高。研究结果在蛋白质水平上进一步证实家蚕孵化酶样蛋白参与了蚕卵孵化这一重要生命过程。 展开更多

关键词 家蚕 孵化酶样基因 原核表达 蛋白纯化 卵壳底物 降解

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新霉素磷酸转移酶基因npt Ⅱ的原核表达、蛋白纯化及其活性鉴定 被引量：3

14

作者 王玲 刘连盟 +1 位作者 傅强 黄世文 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期326-330,共5页

通过PCR方法从pCAMBIA1305载体上克隆了新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ的全编码序列,并插入到原核表达载体pET30a(+)中,构建了重组质粒pET30a-nptⅡ。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,获得了相对分子量为35kD的表达蛋白,... 通过PCR方法从pCAMBIA1305载体上克隆了新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ的全编码序列,并插入到原核表达载体pET30a(+)中,构建了重组质粒pET30a-nptⅡ。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,获得了相对分子量为35kD的表达蛋白,约占全菌总蛋白的45%。表达蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。用5mmol/L二硫苏糖醇和1%十二烷基肌氨酸钠变性溶解包涵体,经透析后复性获得了可溶性重组蛋白。将可溶的表达蛋白用Ni 2+-NTA亲和层析纯化,获得纯化的NPTⅡ蛋白,电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度达95%以上。体外活性检测显示,NPTⅡ蛋白具有良好的生物活性,在浓度30μg/mL以上时可使卡拉霉素失去抑菌活性。 展开更多

关键词 新霉素磷酸转移酶基因 原核表达 包涵体 可溶性蛋白 纯化

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胃癌相关基因GCRG213在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化 被引量：2

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作者 伍银桥 王刚石 +3 位作者 王孟薇 吴本俨 尤纬缔 王卫华 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期406-408,共3页

目的　利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG2 13,制备高纯度的GCRG2 13蛋白。方法　采用PCR技术从pGEM T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG2 13cDNA序列 ,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体 pET10 2 /D TOPO中 ,转化大肠杆菌BL2... 目的　利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG2 13,制备高纯度的GCRG2 13蛋白。方法　采用PCR技术从pGEM T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG2 13cDNA序列 ,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体 pET10 2 /D TOPO中 ,转化大肠杆菌BL2 1,经IPTG诱导表达融合蛋白 ,凝胶回收目的蛋白。结果　SDS PAGE证实在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约 2 9 4kD的Thioredoxin/GCRG2 13融合蛋白。薄层凝胶扫描显示 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 8 7%。经凝胶回收法得到纯度近 10 0 %的蛋白产品。结论　在大肠杆菌中成功表达了Thioredoxin/GCRG2 13融合蛋白 ,并制备出高纯度蛋白产品 。 展开更多

关键词 胃肿瘤 基因 GCRG213 融合蛋白 原核表达 纯化

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红鳍东方鲀FoxO1基因的原核表达及纯化 被引量：3

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作者 张伟 李翠萍 +1 位作者 杨志军 何广杰 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期81-84,共4页

采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总RNA,采用RT–PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀FoxO1基因的ORF,并构建其原核表达载体p ET–32/FoxO1,在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,通过IPTG诱导表达,对重组FoxO1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定,结果表明... 采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总RNA,采用RT–PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀FoxO1基因的ORF,并构建其原核表达载体p ET–32/FoxO1,在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,通过IPTG诱导表达,对重组FoxO1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定,结果表明:重组质粒p ET32a/FoxO1被成功构建;用IPTG进行诱导表达,融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应;纯化出了融合表达蛋白,获得了相对分子质量约为110 000的重组蛋白。 展开更多

关键词 红鳍东方鲀 FoxO1基因 原核表达 蛋白纯化

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贵州黑山羊MSTN基因原核表达条件优化及蛋白纯化 被引量：3

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作者 石照应 曲月秀 +1 位作者 陈蓉 田兴贵 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第6期2343-2346,共4页

为进一步研究MSTN重组蛋白的表达及相关功能奠定基础,利用RT-PCR克隆贵州黑山羊MSTN基因cDNA序列,构建原核表达载体pET-32a(+)-MSTN69,并对重组菌表达条件进行优化和Ni亲和层析纯化His-MSTN69蛋白。结果表明:表达产物与预期大小相符,His... 为进一步研究MSTN重组蛋白的表达及相关功能奠定基础,利用RT-PCR克隆贵州黑山羊MSTN基因cDNA序列,构建原核表达载体pET-32a(+)-MSTN69,并对重组菌表达条件进行优化和Ni亲和层析纯化His-MSTN69蛋白。结果表明:表达产物与预期大小相符,His-MSTN69蛋白分子量为57.8 kD;在温度31℃和IPTG 0.8 mmol/L的条件下表达5h时,BL21-pET-32a(+)-MSTN69重组菌蛋白表达量最高。 展开更多

关键词 MSTN基因 原核表达 蛋白纯化 贵州黑山羊

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橡胶树3个可溶性无机焦磷酸酶基因的原核表达 被引量：2

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作者 朱家红 徐靖 +2 位作者 于晓惠 畅文军 张治礼 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2013年第1期41-45,共5页

焦磷酸酶对橡胶的生物合成具有重要的调控作用。将已克隆的3个可溶性无机焦磷酸酶基因的编码区插入到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建3个焦磷酸酶基因表达载体(pGEX-HbSIP1、pGEX-HbSIP2和pGEX-HbSIP3),再将表达载体转入大肠杆菌表达菌株... 焦磷酸酶对橡胶的生物合成具有重要的调控作用。将已克隆的3个可溶性无机焦磷酸酶基因的编码区插入到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建3个焦磷酸酶基因表达载体(pGEX-HbSIP1、pGEX-HbSIP2和pGEX-HbSIP3),再将表达载体转入大肠杆菌表达菌株进行诱导表达。结果表明:pGEX-HbSIP1、pGEX-HbSIP2表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,pGEX-HbSIP3只在补充稀有密码子的大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,表达率分别为35.4%、43.7%和18.5%。对原核表达的蛋白质进行纯化,获得3种可溶性重组蛋白GST-HbSIP1、GST-HbSIP2和GST-HbSIP3,总回收率分别约为7%、8%、3%。该结果为进一步研究这3种焦磷酸酶蛋白的分子特性、抗体制备及功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 橡胶树 焦磷酸酶 基因 原核表达 蛋白纯化

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香蕉MaASR1基因的生物信息学分析及原核表达 被引量：2

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作者 张丽丽 徐碧玉 +3 位作者 刘菊华 贾彩红 张建斌 金志强 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期1129-1135,共7页

为了深入研究MaASR1基因的分子生物学功能,利用RT-PCR技术从拟南芥转基因株系L14中克隆到MaASR1基因的cDNA序列,该序列含有1个432 bp的开放阅读框,编码143个氨基酸的蛋白质,并对该序列进行了生物信息学分析。将该基因克隆到原核表达载体... 为了深入研究MaASR1基因的分子生物学功能,利用RT-PCR技术从拟南芥转基因株系L14中克隆到MaASR1基因的cDNA序列,该序列含有1个432 bp的开放阅读框,编码143个氨基酸的蛋白质,并对该序列进行了生物信息学分析。将该基因克隆到原核表达载体PET-30a中,经酶切和测序鉴定后,将正确的重组质粒p ET30aMaASR1导入大肠杆菌BL21(DE3),成功构建了该基因的原核表达载体。利用所构建的原核表达载体进行原核表达,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测,结果表明表达蛋白质与预期蛋白质大小基本一致。利用Ni柱亲和层析方法进一步获得了纯度较高的重组蛋白质,并用Western blot方法确定此重组蛋白质为目的蛋白质。 展开更多

关键词 MaASR1基因 原核表达 生物信息学 蛋白质纯化

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小麦品种“陕253”PDI基因的克隆、原核表达及蛋白纯化 被引量：2

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作者 臧闻 董剑 +4 位作者 高翔 陈其皎 王延鹏 李志业 史红飞 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期799-804,共6页

为进一步研究控制小麦蛋白二硫键形成的关键蛋白即蛋白质二硫键异构酶(PDI),运用RT-PCR方法克隆出小麦品种"陕253"PDI基因的cDNA序列,基因登陆号为HQ911363。序列分析表明,HQ911363全长为1 539 bp,编码512个氨基酸,含有PDI典... 为进一步研究控制小麦蛋白二硫键形成的关键蛋白即蛋白质二硫键异构酶(PDI),运用RT-PCR方法克隆出小麦品种"陕253"PDI基因的cDNA序列,基因登陆号为HQ911363。序列分析表明,HQ911363全长为1 539 bp,编码512个氨基酸,含有PDI典型的异构酶活性的催化位点-CGHC-和内质网驻留信号肽-KDEL-。构建该基因的原核表达载体,在宿主菌E.coliBL21(DE3)中经IPTG诱导表达融合蛋白,并对表达蛋白进行了纯化。SDS-PAGE及Western-blot检测证实融合蛋白诱导表达并纯化成功。 展开更多

关键词 小麦 蛋白质二硫键异构酶(PDI) 基因克隆 原核表达 蛋白纯化

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