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呋虫胺残留检测核酸适配体的筛选与鉴定
1
作者 张栋园 崔新仪 +3 位作者 张志鹏 李金丽 李宁 程伟霞 《农药学学报》 北大核心 2025年第2期248-256,共9页
呋虫胺的广泛使用对农产品安全及生态环境具有潜在风险,快速、准确检测呋虫胺残留具有重要意义。本研究通过氧化石墨烯-指数富集配体系统进化技术(GO-SELEX),从ssDNA(单链DNA)文库中筛选并获得了呋虫胺的核酸适配体Seq1、Seq12和Seq14... 呋虫胺的广泛使用对农产品安全及生态环境具有潜在风险,快速、准确检测呋虫胺残留具有重要意义。本研究通过氧化石墨烯-指数富集配体系统进化技术(GO-SELEX),从ssDNA(单链DNA)文库中筛选并获得了呋虫胺的核酸适配体Seq1、Seq12和Seq14。对适配体二级结构进行预测并检测了适配体的亲和力,结果表明:适配体Seq1、Seq12和Seq14的解离常数分别为164.23±25.41、201.68±17.42及237.10±29.17 nmol/L。采用适配体Seq1与纳米金粒子(AuNPs)建立了纳米金比色检测方法,对呋虫胺进行定量检测,检出限为0.002 mg/kg。相对于传统的检测方法,本研究基于GO-SELEX建立的纳米金比色法可以实现更加快速、方便的现场检测,在注重时效性和新鲜度的农业生产实践中具有很好的应用潜力。 展开更多
关键词 呋虫胺 核酸适配体 氧化石墨烯 指数富集配体系统进化 纳米金颗粒 比色法
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基于氧化石墨烯-SELEX技术对氟苯尼考核酸适配体的筛选及其结构分析 被引量：1
2
作者 肖海华 王君雁 李劼 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期468-476,共9页
氟苯尼考(FFC)具有胚胎毒性,在食用动物组织中残留会严重危害消费者的健康与安全。为建立快速检测动物性食品中FFC残留的方法奠定基础,本研究根据引物设计原则,设计了上下游引物,根据引物序列构建长度为80 bp的随机单链寡核苷酸(ssDNA)... 氟苯尼考(FFC)具有胚胎毒性,在食用动物组织中残留会严重危害消费者的健康与安全。为建立快速检测动物性食品中FFC残留的方法奠定基础,本研究根据引物设计原则,设计了上下游引物,根据引物序列构建长度为80 bp的随机单链寡核苷酸(ssDNA)文库,其3'端和5'端为固定的20 bp引物结合位点,中间为40 bp的随机序列。通过氧化石墨烯-富集配体系统进化技术(GO-SELEX)筛选,即将经过预处理的ssDNA文库与等摩尔量的FFC及氧化石墨烯(GO)沉淀共孵育。通过GO的π-π共轭键吸附未结合靶标FFC的ssDNA,已结合靶标的ssDNA(FFC-ssDNA)则留在上清液中,通过离心获得FFC-ssDNA复合物。将每一轮筛选的FFC-ssDNA复合物经离心、抽提、醇沉淀回收所得到的ssDNA做为模板进行PCR扩增,通过链霉亲和素将PCR产物的双链DNA(dsDNA)彻底裂解为单链,作为次级ssDNA文库进入下一轮筛选。每一轮的筛选均计算一次回收率,当回收率变化趋于稳定时,引入反筛选物氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP),以去除与FFC特异性结合较差的ssDNA。当回收率达到饱和,筛选停止。最终,根据回收率的计算结果共进行了12轮核酸适配体的筛选,其中有10轮为正筛选,第7轮和第11轮为反筛选。PCR结果显示,经12轮筛选均得到了所需要的目的ssDNA片段。对第9轮和第12轮的筛选产物克隆并测序,共得到46条不同的核酸适配体序列。经对46条核苷酸序列的二级结构、自由能(△G)预测和亲缘性分析,最终得到A1、A26、A27、A31、B18、B28、B30、B37共8条候选核酸适配体。通过测定8条候选适配体的解离常数(Kd值)分析其与FFC的亲和性。结果显示,8条候选适配体的Kd值在11.811 nmol/L~54.097 nmol/L;利用相同浓度的FFC、CAP、TAP对其中亲和性较高的A26和B18进行特异性试验,结果表明两条核酸适配体均可以与FFC特异性结合,且B18与FFC的特异性结合作用更强,可作为FFC的特异性核酸适配体。本研究首次对FFC的核酸适配体进行SELEX筛选,为建立快速检测动物性食品中FFC残留方法奠定基础。 展开更多
关键词 氧化石墨烯 氟苯尼考 核酸适配体 指数富集配体系统进化技术
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基于核酸适配体功能化氧化石墨烯荧光传感器检测氯胺酮及去甲氯胺酮
3
作者 韦丽霞 刘波 +8 位作者 杨小圆 张茜 兰艺凤 张潮 贾娟 张丹 尉志文 贠克明 陈哲 《法医学杂志》 2025年第4期326-339,共14页
目的利用能同时识别氯胺酮及其代谢物去甲氯胺酮的核酸适配体,构建核酸适配体羧基化氧化石墨烯(carboxylated graphene oxide,CGO)荧光传感器,实现氯胺酮及去甲氯胺酮的高灵敏、高特异性检测。方法采用氧化石墨烯-指数富集配体系统进化... 目的利用能同时识别氯胺酮及其代谢物去甲氯胺酮的核酸适配体,构建核酸适配体羧基化氧化石墨烯(carboxylated graphene oxide,CGO)荧光传感器,实现氯胺酮及去甲氯胺酮的高灵敏、高特异性检测。方法采用氧化石墨烯-指数富集配体系统进化技术(graphene oxide-systematic evolution of ligand by exponential enrichment,GO-SELEX)结合分子对接技术筛选出能同时识别氯胺酮及去甲氯胺酮的特异性核酸适配体。将适配体标记Cy5荧光并通过化学偶联反应与CGO结合,构建核酸适配体功能化CGO荧光传感器。通过优化CGO质量浓度、核酸适配体浓度、反应温度及孵育时间等检测条件,利用加入靶标前后的荧光强度变化比率实现目标物的定量分析。通过检测传感器在空白血液、尿液中荧光强度随孵育时间的变化,评估其与传统物理吸附CGO荧光传感器在生物检材中的稳定性;通过空白血液、尿液加标回收实验,比较其与HPLC-MS/MS的检测性能。结果筛选得到特异性核酸适配体A5,并与CGO化学偶联构建荧光传感器。在优化条件下,该荧光传感器对氯胺酮的线性检测范围为1.0~5.0 ng/mL,检出限(limit of de⁃tection,LOD)为0.86 ng/mL;对去甲氯胺酮的线性检测范围为1.0~5.0 ng/mL,LOD为0.70 ng/mL。与物理吸附构建的CGO荧光传感器相比,本传感器在血液、尿液中表现出更高的生物稳定性。空白血液、尿液中氯胺酮及去甲氯胺酮的加标回收率为81.50%~110.03%,表现出与HPLC-MS/MS相当的检测性能。结论核酸适配体筛选方法可为毒(药)物原体及其代谢物的适配体筛选提供新的思路,所构建的核酸适配体功能化CGO荧光传感器可为氯胺酮及去甲氯胺酮的高效、可靠检测提供新方法。 展开更多
关键词 法医学 毒物分析 氯胺酮 去甲氯胺酮 氧化石墨烯-指数富集配体系统进化技术 核酸适配体 化学偶联 荧光传感器
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