A型牛轮状病毒(BRV-A)是引起牛腹泻的重要病原之一,对养牛业危害最大。为建立一种针对BRV-A的快速、高通量、低成本检测方法,根据BRV-A的VP6基因保守区设计特异性引物,建立了检测BRV-A的SYBR Green I RT-qPCR方法。该方法对浓度梯度为4....A型牛轮状病毒(BRV-A)是引起牛腹泻的重要病原之一,对养牛业危害最大。为建立一种针对BRV-A的快速、高通量、低成本检测方法,根据BRV-A的VP6基因保守区设计特异性引物,建立了检测BRV-A的SYBR Green I RT-qPCR方法。该方法对浓度梯度为4.41×10^(8)~4.41×10^(2) copies/μL质粒标准品的扩增Ct值与拷贝数浓度呈良好的线性关系,熔解曲线为单峰;与其他引起牛腹泻的常见病原无交叉反应,最低检测限为4.41×10^(1) copies/μL,批内、批间重复性试验Ct值变异系数均低于1%;对临床粪便样品的阳性检出率高于地方标准中的PCR方法,且检测结果符合性较好。综上,本研究建立的BRV-A SYBR Green I RT-qPCR检测方法灵敏、特异、稳定,且操作简单、成本低,为临床样品的大规模BRV-A检测及其感染的早期诊断提供了技术支撑。展开更多
为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38....为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。展开更多
为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、...为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×101拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。展开更多
灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR...灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。展开更多
根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法,...根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测。展开更多
为检测比格犬α和β-干扰素(CaIFN-α和CaIFN-β),本研究根据GenBank中登录的IFN-α和IFN-β基因序列,分别设计合成特异性引物,以犬3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增IFN...为检测比格犬α和β-干扰素(CaIFN-α和CaIFN-β),本研究根据GenBank中登录的IFN-α和IFN-β基因序列,分别设计合成特异性引物,以犬3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增IFN-α、IFN-β和GAPDH的基因片段,并克隆于pMD19-T载体中制备标准品,建立荧光定量RT-PCR标准曲线。结果表明:IFN-α和IFN-β和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×102拷贝/μL^1×108拷贝/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.994。组内组间变异系数均小于3%,特异性和重复性较好。同时采用常规RT-PCR方法与本研究建立的方法对30份临床样品检测,结果显示IFN-α和IFN-β的阳性符合率分别为96.43%和96.55%。本研究建立的检测方法为比格犬IFN mRNA的定量分析提供了有效手段。展开更多
Class Ⅱ Transactivator(CIITA)作为重要的MHCⅡ类分子反式激活因子在抗原递呈细胞的成熟和功能实现过程中发挥关键作用,为建立一种快速检测猪源CIITA基因的方法,本研究根据GenBank中猪源CIITA基因序列设计引物,从猪肺泡巨噬细胞的总c...Class Ⅱ Transactivator(CIITA)作为重要的MHCⅡ类分子反式激活因子在抗原递呈细胞的成熟和功能实现过程中发挥关键作用,为建立一种快速检测猪源CIITA基因的方法,本研究根据GenBank中猪源CIITA基因序列设计引物,从猪肺泡巨噬细胞的总cDNA中扩增CIITA基因,并克隆到pCold-TF载体中获得重组质粒pCold-TF-CIITA。利用重组质粒pCold-TF-CIITA作为标准品建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。试验结果显示:该方法在1.68×10^(1)~1.68×10^(7) copies/μL范围内呈现出良好的线性关系,检测灵敏度可达16.8 copies/μL,组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对不同细胞中的CIITA基因进行检测,结果显示该方法仅能够检测到猪源细胞中的CIITA基因。本试验结果表明,利用pCold-TF-CIITA作为标准品建立的CIITA基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于CIITA基因的定量检测。展开更多
为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并...为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×10^(1)拷贝/μL~8.3×10^(8)拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I q PCR以及常规PCR检测,比较两种方法的敏感性;以3个不同浓度的质粒标准品作为模板,利用该方法分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。建立的该q PCR方法的标准曲线显示,各浓度的质粒标准品的拷贝数与其Ct值均呈良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.998。特异性试验结果显示,该方法仅能检出VpAHPND,而其他病原均为阴性结果,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为83拷贝/μL,敏感性是水产行业标准常规PCR的1000倍。重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验变异系数分别在0.31%~0.81%和2.05%~4.34%,重复性好。利用该方法对61株虾源弧菌样品检测,结果显示阳性检出率为29.5%(18/61),阴性样品检测率为70.5%(43/61),与行业标准的常规PCR检测方法结果完全一致,二者的阳性符合率为100%,总符合率为100%。本研究建立了一类致对虾VpAHPND的SYBR Green I q PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为AHPND的诊断、监测与流行病学调查提供技术支撑。展开更多
文摘A型牛轮状病毒(BRV-A)是引起牛腹泻的重要病原之一,对养牛业危害最大。为建立一种针对BRV-A的快速、高通量、低成本检测方法,根据BRV-A的VP6基因保守区设计特异性引物,建立了检测BRV-A的SYBR Green I RT-qPCR方法。该方法对浓度梯度为4.41×10^(8)~4.41×10^(2) copies/μL质粒标准品的扩增Ct值与拷贝数浓度呈良好的线性关系,熔解曲线为单峰;与其他引起牛腹泻的常见病原无交叉反应,最低检测限为4.41×10^(1) copies/μL,批内、批间重复性试验Ct值变异系数均低于1%;对临床粪便样品的阳性检出率高于地方标准中的PCR方法,且检测结果符合性较好。综上,本研究建立的BRV-A SYBR Green I RT-qPCR检测方法灵敏、特异、稳定,且操作简单、成本低,为临床样品的大规模BRV-A检测及其感染的早期诊断提供了技术支撑。
文摘为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。
文摘为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×101拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。
文摘灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。
文摘根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测。
文摘为检测比格犬α和β-干扰素(CaIFN-α和CaIFN-β),本研究根据GenBank中登录的IFN-α和IFN-β基因序列,分别设计合成特异性引物,以犬3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增IFN-α、IFN-β和GAPDH的基因片段,并克隆于pMD19-T载体中制备标准品,建立荧光定量RT-PCR标准曲线。结果表明:IFN-α和IFN-β和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×102拷贝/μL^1×108拷贝/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.994。组内组间变异系数均小于3%,特异性和重复性较好。同时采用常规RT-PCR方法与本研究建立的方法对30份临床样品检测,结果显示IFN-α和IFN-β的阳性符合率分别为96.43%和96.55%。本研究建立的检测方法为比格犬IFN mRNA的定量分析提供了有效手段。
文摘Class Ⅱ Transactivator(CIITA)作为重要的MHCⅡ类分子反式激活因子在抗原递呈细胞的成熟和功能实现过程中发挥关键作用,为建立一种快速检测猪源CIITA基因的方法,本研究根据GenBank中猪源CIITA基因序列设计引物,从猪肺泡巨噬细胞的总cDNA中扩增CIITA基因,并克隆到pCold-TF载体中获得重组质粒pCold-TF-CIITA。利用重组质粒pCold-TF-CIITA作为标准品建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。试验结果显示:该方法在1.68×10^(1)~1.68×10^(7) copies/μL范围内呈现出良好的线性关系,检测灵敏度可达16.8 copies/μL,组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对不同细胞中的CIITA基因进行检测,结果显示该方法仅能够检测到猪源细胞中的CIITA基因。本试验结果表明,利用pCold-TF-CIITA作为标准品建立的CIITA基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于CIITA基因的定量检测。
文摘为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×10^(1)拷贝/μL~8.3×10^(8)拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I q PCR以及常规PCR检测,比较两种方法的敏感性;以3个不同浓度的质粒标准品作为模板,利用该方法分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。建立的该q PCR方法的标准曲线显示,各浓度的质粒标准品的拷贝数与其Ct值均呈良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.998。特异性试验结果显示,该方法仅能检出VpAHPND,而其他病原均为阴性结果,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为83拷贝/μL,敏感性是水产行业标准常规PCR的1000倍。重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验变异系数分别在0.31%~0.81%和2.05%~4.34%,重复性好。利用该方法对61株虾源弧菌样品检测,结果显示阳性检出率为29.5%(18/61),阴性样品检测率为70.5%(43/61),与行业标准的常规PCR检测方法结果完全一致,二者的阳性符合率为100%,总符合率为100%。本研究建立了一类致对虾VpAHPND的SYBR Green I q PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为AHPND的诊断、监测与流行病学调查提供技术支撑。
