药品中金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR精准快检 被引量：2

1

作者 闵红 蔡虎 +4 位作者 孙瑶 胡飞 王新旺 马鹏飞 苗保刚 《陕西师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期113-121,共9页

为实现药品中金黄色葡萄球菌的精准快速检测,通过加入内参(internal amplification control,IAC),优化PCR反应体系,建立能够实时监控过程的基于内参的金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR快检方法,并对方法的特异性、检测限、重现性、可行性... 为实现药品中金黄色葡萄球菌的精准快速检测,通过加入内参(internal amplification control,IAC),优化PCR反应体系,建立能够实时监控过程的基于内参的金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR快检方法,并对方法的特异性、检测限、重现性、可行性进行验证。验证结果表明,所建立方法的特异性良好,仅金黄色葡萄球菌呈现典型扩增曲线;对金黄色葡萄球菌基因组DNA的检测限为0.23 pg/μL;C_(t)值与模板拷贝数呈现出良好的线性关系(R^(2)=0.99);重现性实验的相对标准偏差均小于3.0%;人工污染药品增菌10 h后即可检出金黄色葡萄球菌。该方法不仅缩短了药品中金黄色葡萄球菌的检验时间,还可以实时监测PCR反应过程,有效防止“假阴性”结果的发生,能够作为确认金黄色葡萄球菌的补充方法。 展开更多

关键词 药品 金黄色葡萄球菌 内参 实时荧光定量pcr

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实时荧光定量PCR技术的操作实践 被引量：42

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作者 杨怡姝 孙晓娜 +3 位作者 王小利 沈思嗣 李泽琳 曾毅 《实验室研究与探索》 CAS 北大核心 2011年第7期15-19,共5页

采用Mx3000P型实时荧光定量PCR仪,以SYBRGreen I法相对定量技术为例,设计1例检测针对HIV-1 vpr基因的特异性siRNA基因沉默效果的实验。介绍了实时荧光定量PCR技术上机前样本的制备过程、检测程序及相关参数的设置方法等操作流程;结合... 采用Mx3000P型实时荧光定量PCR仪,以SYBRGreen I法相对定量技术为例,设计1例检测针对HIV-1 vpr基因的特异性siRNA基因沉默效果的实验。介绍了实时荧光定量PCR技术上机前样本的制备过程、检测程序及相关参数的设置方法等操作流程;结合熔解曲线、扩增曲线进行结果分析;强调了实验整体设计、引物设计与PCR反应体系的优化和内参的恰当选择在实时荧光定量PCR技术中的重要性。 展开更多

关键词 荧光定量pcr SYBRGreenI 扩增曲线 熔解曲线

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双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法 被引量：66

3

作者 徐丽华 刘春雷 +4 位作者 常玉梅 梁利群 刘金亮 高国强 韩启霞 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期70-75,共6页

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁... 实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁琐。阐述了一种改进的相对定量方法——双标准曲线法的试验原理和特点,描述了定量PCR体系的优化方式,探讨了试验误差分析方法及试验操作技巧,并就试验数据的处理方法进行讨论。试验证明,双标准曲线法是一种经济、简单而准确的定量方法。 展开更多

关键词 双标准曲线法 相对定量pcr 荧光扩增曲线 试验误差分析 归一化值

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水稻低丰度表达基因OsAMT1;3实时荧光定量PCR方法的建立及其应用 被引量：17

4

作者 孙淑斌 李宝珍 +1 位作者 胡江 徐国华 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期8-12,共5页

采用实时荧光定量PCR技术，通过使用特异引物，对水稻中的低丰度表达基因OsAMT1；3进行了转录水平上的定量分析，成功建立了可检测低丰度表达基因的SYBR Green实时荧光定量PCR技术平台。该方法具有很好的准确性和实用性。获得的荧光定量... 采用实时荧光定量PCR技术，通过使用特异引物，对水稻中的低丰度表达基因OsAMT1；3进行了转录水平上的定量分析，成功建立了可检测低丰度表达基因的SYBR Green实时荧光定量PCR技术平台。该方法具有很好的准确性和实用性。获得的荧光定量PCR扩增曲线，基线平整，指数区明显，斜率大且固定；线性范围广，17～36个循环都能测出；稳定性、重复性好，变异系数仅为0．47％；标准曲线表明，循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系，可对基因表达进行相对定量；缺氮条件下OsAMT1；3与纯NH4^＋处理相比表达量增加4倍以上。 展开更多

关键词 实时荧光定量pcr 扩增曲线 标准曲线 铵转运蛋白基因 基因表达 研究方法

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国产核酸扩增(PCR)试剂在献血者血液HBV DNA筛查中的应用研究 被引量：10

5

作者 叶贤林 曾昭鉴 +3 位作者 杨宝成 卢亮 商桂芳 李活 《中国感染控制杂志》 CAS 2007年第5期301-306,共6页

目的为了提高输血安全性,探讨国产核酸扩增试剂在血站血液乙型肝炎病毒(HBV)筛查中应用的可行性。方法在酶联免疫吸附试验(ELISA)常规筛查血液乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的基础上,采用荧光聚合酶链反应(PCR)技术(国产核酸扩增试剂)对初、... 目的为了提高输血安全性,探讨国产核酸扩增试剂在血站血液乙型肝炎病毒(HBV)筛查中应用的可行性。方法在酶联免疫吸附试验(ELISA)常规筛查血液乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的基础上,采用荧光聚合酶链反应(PCR)技术(国产核酸扩增试剂)对初、复检合格的献血者的血清汇集标本(8人份×150μL)进行HBV DNA检测,对初始反应阳性的汇集标本拆分后再进行单份检测,用国家标准质控品考评检测限量,用已知HBV DNA阳性血样评估检出情况。结果应用国家HBVDNA标准品考评,本方法的95%检测限量为98.0IU/mL,可信限范围为[55.8,548]。对9611份标本共1208个汇集池进行检测,初始检测阳性池7个,阳性率为0.58%,进一步拆分检测,未检出HBV DNA阳性标本;对检测阴性的汇集标本随机进行234份单份检测(1400μL上样浓缩),亦未检出HBV DNA阳性标本。结论同国际知名核酸检测试剂相比,国产核酸扩增试剂的灵敏度和特异性有待进一步提高。 展开更多

关键词 核酸扩增技术 荧光聚合酶链反应 肝炎病毒 乙型 血液筛查

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实时荧光PCR检测HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液中HBV DNA研究 被引量：10

6

作者 叶贤林 刘晓红 +3 位作者 马兰 张红 李活 曾劲峰 《中国感染控制杂志》 CAS 2009年第4期241-244,240,共5页

目的对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性、乙型肝炎核心抗体（抗HBc）阳性的献血者血液进行经输血传播乙型肝炎病毒（HBV）的风险评估，为完善HBV血液筛查模式及确保临床用血安全提供依据。方法对献血者血液常规检测阴性的标本进行8×... 目的对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性、乙型肝炎核心抗体（抗HBc）阳性的献血者血液进行经输血传播乙型肝炎病毒（HBV）的风险评估，为完善HBV血液筛查模式及确保临床用血安全提供依据。方法对献血者血液常规检测阴性的标本进行8×45μL汇集，应用实时荧光聚合酶链反应（PCR）进行混样核酸检测HBVDNA。对血液常规筛查和混样核酸检测合格的标本，进行随机乙型肝炎血清学5项标志物的酶联免疫吸附试验（ELISA）。对获得的HBsAg阴性、混样HBVDNA阴性、抗HBc阳性的标本，进一步采用单份样本（720μL）实时荧光PCR法检测并定量分析。结果混样标本共检测12552份，检出HBsAg阴性、HBVDNA阳性标本2份，阳性率为0．02％。随机筛查混样核酸检测阴性标本614份，检出抗HBc阳性标本320份，对此320份标本进行单份核酸检测，检出阳性标本1份，阳性率为0．31％。结论HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液存在输血传播HBV的风险，应用核酸扩增技术检测血液HBVDNA能大大提高血液安全性。 展开更多

关键词 输血 献血者 核酸扩增技术 实时荧光聚合酶链反应 肝炎病毒 乙型 乙型肝炎核心抗体

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对流实时荧光定量PCR系统设计 被引量：4

7

作者 翁振宇 闵小平 +2 位作者 王海 卓之豪 葛胜祥 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期130-136,共7页

设计了一种结合实时荧光定量技术和自然对流技术的PCR系统.主要介绍该系统的双通道荧光激发与检测结构及其工作原理,系统中使用光纤作为光路的传输媒介,采用电荷耦合元件(CCD)工业相机采集荧光信号变化,并自行设计电路和软件驱动整套系... 设计了一种结合实时荧光定量技术和自然对流技术的PCR系统.主要介绍该系统的双通道荧光激发与检测结构及其工作原理,系统中使用光纤作为光路的传输媒介,采用电荷耦合元件(CCD)工业相机采集荧光信号变化,并自行设计电路和软件驱动整套系统正常运行.最后通过对梯度稀释的巨细胞病毒(CMV)的基因模板进行扩增,展示了该系统可用于快速扩增和实时定量检测的潜力. 展开更多

关键词 实时荧光定量pcr 自然对流pcr 双通道 快速扩增

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三重实时荧光PCR检测纯培养物和环境水体中霍乱弧菌方法的建立及应用 被引量：2

8

作者 麻丽丹 王殿夫 +1 位作者 王多春 曹际娟 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期40-44,共5页

本研究建立了检测O1群、O139群、非O1和非O139群霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的三重实时荧光PCR方法,并进行纯培养物和环境水体标本的检测评价。根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列和霍乱弧菌种特异的溶血素编码基因hlyA序列... 本研究建立了检测O1群、O139群、非O1和非O139群霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的三重实时荧光PCR方法,并进行纯培养物和环境水体标本的检测评价。根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列和霍乱弧菌种特异的溶血素编码基因hlyA序列设计引物和探针,利用荧光标记物,建立同时检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1和非O139群的三重实时荧光PCR方法,对所建立的方法分别进行了灵敏度和特异性评价,同时与传统培养法进行了比较。研究建立的方法能特异扩增出O1群、O139群、非O1和非O139群霍乱弧菌;而对其它8种弧菌没有扩增;实时荧光PCR检测252份环境水体标本的增菌液,与常规分离方法相比显示了较高灵敏度,所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。本研究可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查和纯培养物的确认。 展开更多

关键词 霍乱弧菌 实时荧光pcr三重

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革胡子鲶MHC基因表达qPCR分析的引物设计与评估 被引量：1

9

作者 李转转 王妍 +4 位作者 高金伟 王晓梅 陈成勋 李涛 莫宝霖 《天津农学院学报》 CAS 2016年第4期33-37,42,共6页

为应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析革胡子鲶主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因的表达谱,本研究利用Primer 5软件设计扩增革胡子鲶MHC基因片段的引物并进行qPCR评估。结果显示:引物MHCF1-MHCR3在qPCR... 为应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析革胡子鲶主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因的表达谱,本研究利用Primer 5软件设计扩增革胡子鲶MHC基因片段的引物并进行qPCR评估。结果显示:引物MHCF1-MHCR3在qPCR扩增时,融解曲线为单一尖锐峰;标准曲线分析显示:引物的扩增效率为99.3%,R2值为0.998。上述结果说明该对引物具有良好的扩增特异性和扩增效率,满足了qPCR扩增的要求。本研究为革胡子鲶MHCⅠ基因表达的qPCR分析奠定了基础。 展开更多

关键词 革胡子鲶 主要组织相容性复合体 实时荧光定量pcr 融解曲线 扩增效率

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荧光PCR扩增相关技术 被引量：8

10

作者 张亚旭 刘紫烟 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期890-899,共10页

利用荧光PCR(FPCR)技术扩增DNA是现代生物学研究的重要内容。本文以FPCR的发明为起始,以其主要的发展历程为主线,介绍和阐述了实时定量式PCR(QPCR,包括染料法、水解探针法及其衍生种类、划分为分子信标和阴阳探针等类型的杂交探针法、... 利用荧光PCR(FPCR)技术扩增DNA是现代生物学研究的重要内容。本文以FPCR的发明为起始,以其主要的发展历程为主线,介绍和阐述了实时定量式PCR(QPCR,包括染料法、水解探针法及其衍生种类、划分为分子信标和阴阳探针等类型的杂交探针法、染料熔解曲线法和探针熔解曲线法)与数字式PCR(DPCR,主要是芯片式DPCR,cdPCR和微液滴DPCR,ddPCR)这2代阶段性方法的原理、要点、设计技巧及实际运用等,总结其主要应用领域与局限性,对比不同类型各自的特点,并对未来的发展进行展望。 展开更多

关键词 荧光pcr(fpcr)扩增 实时定量式pcr(Qpcr) 熔解曲线 数字式pcr(Dpcr)

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经典猪瘟荧光PCR检测方法的建立与应用 被引量：1

11

作者 谷孝玉 李艳玲 +6 位作者 裴雅芳 伏显华 刘静 解云辉 周兆言 李润 李辰龙 《现代畜牧科技》 2023年第10期10-13,共4页

猪瘟(CSF)已被世界卫生组织确定为A类传染病,为减少猪瘟病毒(CSFV)带来的经济损失,新的有效的诊断技术的开发成为关键。根据CSFV的Zaozhuang-1毒株的5'UTR基因保守区域设计出特异性引物,建立了一种猪瘟病毒荧光PCR快速检测方法。结... 猪瘟(CSF)已被世界卫生组织确定为A类传染病,为减少猪瘟病毒(CSFV)带来的经济损失,新的有效的诊断技术的开发成为关键。根据CSFV的Zaozhuang-1毒株的5'UTR基因保守区域设计出特异性引物,建立了一种猪瘟病毒荧光PCR快速检测方法。结果表明,该方法在62℃条件下扩增40个循环,灵敏度最高,最低可检测限度为10拷贝/μL;且特异性良好,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)均无特异性扩增。对临床样本进行检测,结果显示,荧光定量PCR检测结果合格率为100%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性良好、符合率高,适用于经典猪瘟的快速检测。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 荧光pcr 扩增

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山羊绒和绵羊毛混合物荧光PCR法测试研究 被引量：2

12

作者 李典典 《针织工业》 北大核心 2023年第3期86-88,共3页

根据GB/T 36433—2018《纺织品山羊绒和绵羊毛的混合物DNA定量分析荧光PCR法》标准,通过试验计算得出羊绒和羊毛的扩增效率分别为95.26%和98.60%,并以此对方法中用到的引物、探针和扩增条件等进行进一步验证。此外,结合固相萃取技术,探... 根据GB/T 36433—2018《纺织品山羊绒和绵羊毛的混合物DNA定量分析荧光PCR法》标准,通过试验计算得出羊绒和羊毛的扩增效率分别为95.26%和98.60%,并以此对方法中用到的引物、探针和扩增条件等进行进一步验证。此外,结合固相萃取技术,探究常规不过柱法、常规过柱法和试剂盒法3种不同前处理方法对羊绒和羊毛混合物样品测试结果的影响。结果表明:常规不过柱法有局限性,仅适用于颜色较浅的样品;而常规过柱法和试剂盒法在测试颜色较深的样品方面有一定的优势,在定性和定量方面结果比较一致;这3种方法可以满足试验者的不同需求,进一步提高试验效率。 展开更多

关键词 羊绒 羊毛 纤维定量分析 荧光pcr法 固相萃取 扩增效率

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基于EB1基因的环介导等温扩增(LAMP)法检测感染家蚕微粒子病的蚕卵 被引量：9

13

作者 刘吉平 程伟 +2 位作者 晏育伟 魏建影 杨吉龙 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期846-855,共10页

【目的】家蚕Bombyx mori微粒子病一直影响着蚕种业的健康发展,快速而准确地检测出寄生于蚕卵中的家蚕微孢子虫Nosema bombycis对于有效控制家蚕微粒子病危害意义重大。【方法】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,... 【目的】家蚕Bombyx mori微粒子病一直影响着蚕种业的健康发展,快速而准确地检测出寄生于蚕卵中的家蚕微孢子虫Nosema bombycis对于有效控制家蚕微粒子病危害意义重大。【方法】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法是一种快速、灵敏、特异的DNA体外恒温扩增方法,本文基于LAMP检测法的原理,依据家蚕微孢子虫孢子繁殖复制相关的EB1基因(Gen Bank登录号:KF421134.1)设计LAMP引物,对LAMP反应体系的最佳反应温度、内外引物浓度比、检测反应的特异性、灵敏度等进行研究,建立了一种检测蚕卵感染家蚕微粒子病的LAMP检测方法。【结果】结果表明,基于EB1基因建立的LAMP检测方法在63℃恒温下在1.5 h内就可完成对样品的有效检测,本LAMP法对家蚕微孢子虫孢子DNA的检测灵敏度为5.0×10-3ng/μL,对EB1-p MDTM19-T质粒标准品的检测灵敏度为1.0×102copies/μL,同时对人工感染家蚕微粒子病单个母蛾产下蚕卵的1/8卵圈量或1粒蚕卵均能检出阳性结果。上述结果都分别应用凝胶电泳法、恒温荧光检测仪以及SYBR GreenⅠ显色肉眼观察法得到同步判定。【结论】本研究建立的基于EB1基因LAMP法可用于蚕卵微粒子病的检测,LAMP法为蚕种质量检验及成品卵微粒子病现场检疫提供了新技术。 展开更多

关键词 家蚕 微粒子病 微孢子虫 环介导等温扩增 荧光指示剂 凝胶电泳 聚合酶链式扩增

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青稞C4H基因的克隆及组织表达分析 被引量：15

14

作者 罗小娇 刘新春 +2 位作者 杨晓云 袁金娥 冯宗云 《植物遗传资源学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期589-596,共8页

为揭示大麦中黄酮合成的分子调控机制,利用反转录PCR结合同源克隆和RACE技术首次从青稞(裸大麦)叶片中克隆获得肉桂酸-4-羟化酶基因(HvC4H)的全长cDNA序列(Genbank登录号:KF927086),总长度1951 bp,ORF为1518 bp,编码505个氨基酸,等电点P... 为揭示大麦中黄酮合成的分子调控机制,利用反转录PCR结合同源克隆和RACE技术首次从青稞(裸大麦)叶片中克隆获得肉桂酸-4-羟化酶基因(HvC4H)的全长cDNA序列(Genbank登录号:KF927086),总长度1951 bp,ORF为1518 bp,编码505个氨基酸,等电点PI=9.01,平均亲水指数(GRAVY)为-0.170,属于亲水性碱性蛋白,高级结构分析表明其具有细胞色素P450家族保守域及C4H特异的功能性活性位点。利用实时荧光定量PCR分析胚乳发育5个时期不同组织(茎、叶及子粒)的表达情况,结果显示HvC4H基因在青稞胚乳发育期的表达情况存在着明显的组织差异性,在茎中的表达量最高。本研究为通过调控C4H基因的表达从而提高大麦黄酮的含量奠定了分子生物学基础,对于改良大麦的品质、抗性、生长发育等性状具有重要意义。 展开更多

关键词 青稞(裸大麦) C4H基因 同源克隆 RACE 实时荧光定量pcr 胚乳发育期

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3种单增李斯特氏菌快速检测方法的比较 被引量：4

15

作者 周阳 祝长青 +8 位作者 郭桂萍 徐幸莲 徐宝才 薛建丽 蒋原 杨军 郭云昌 刘秀梅 付瑞燕 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2014年第8期119-124,共6页

【目的】确定适用于不同条件下快速检测单增李斯特氏菌的方法。【方法】以单增李斯特氏菌标准菌株CMCC54004和市售盐水鸭、凉拌菜为研究对象,按照国家食品安全标准(GB 4789.30-2010)对检测样品进行选择性增菌培养,选择阴性样品进行人工... 【目的】确定适用于不同条件下快速检测单增李斯特氏菌的方法。【方法】以单增李斯特氏菌标准菌株CMCC54004和市售盐水鸭、凉拌菜为研究对象,按照国家食品安全标准(GB 4789.30-2010)对检测样品进行选择性增菌培养,选择阴性样品进行人工布菌,比较单增李斯特氏菌蛋白条检测法、CPA恒温扩增法以及实时荧光PCR方法的检测效果,并以传统平板分离法进行验证。【结果】蛋白条检测法操作简单但灵敏度低,最低检测限为106cfu/mL;实时荧光PCR方法灵敏度高,最低检测限为101 cfu/mL,但操作繁琐,对操作技术及实验室条件要求较高;CPA恒温扩增方法灵敏度相对较高,最低检测限为105 cfu/mL,操作相对简单。【结论】实时荧光PCR方法适合灵敏度要求高、且具备良好实验条件时使用;CPA恒温扩增法适于对灵敏度要求不高、实验室条件简单的基层实验室使用。 展开更多

关键词 单增李斯特氏菌 检测方法比较 蛋白条检测法 CPA恒温扩增法 实时荧光pcr方法

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马氏珠母贝(Pinctada fucata)组织蛋白酶L基因的克隆与表达分析 被引量：2

16

作者 王忠良 简纪常 +4 位作者 鲁义善 丁燏 王蓓 陈刚 吴灶和 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期1604-1611,共8页

根据已构建的溶藻弧菌(Vibro alginolyticus)诱导的马氏珠母贝(Pinctada fucata)血淋巴cDNA差减文库得到的ESTs序列,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了其组织蛋白酶L基因(PFCatL),并对其进行了生物信息学分析;应用实时荧光定量P... 根据已构建的溶藻弧菌(Vibro alginolyticus)诱导的马氏珠母贝(Pinctada fucata)血淋巴cDNA差减文库得到的ESTs序列,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了其组织蛋白酶L基因(PFCatL),并对其进行了生物信息学分析;应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术,研究了PFCatL基因在溶藻弧菌刺激前后马氏珠母贝足、外套膜、鳃、闭壳肌等8个组织中的表达变化。结果表明,PFCatL基因cDNA全长2004bp,其中5′非编码区(5′-UTR)50bp,3′非编码区(3′-UTR)865bp,开放阅读框(ORF)1089bp,编码362个氨基酸,其分子量计算值(MW)为40.52kDa,理论等电点(IP)为5.20;生物信息学分析表明,PFCatL含有16个氨基酸残基组成的信号肽序列以及组织蛋白酶前体抑制功能域I29;Clustalw2多重比对发现PFCatL氨基酸序列在催化三联体Cys-His-Asn、底物结合位点以及二硫键形成相关的半胱氨酸残基位点高度保守;Real-time PCR研究发现,PFCatL在马氏珠母贝各组织中均有表达,但各组织间的表达量存在差异,其中以肾和闭壳肌中的表达量最高;溶藻弧菌感染4h后,外套膜、鳃以及血淋巴中PFCatL基因的表达较感染前显著上调。 展开更多

关键词 马氏珠母贝 组织蛋白酶L CDNA末端快速扩增 实时荧光定量pcr

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基于细菌酯酶活性的叠氮噻唑橙分子设计与特性验证

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作者 余以刚 黄韵 +2 位作者 李晓凤 肖性龙 吴晖 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第10期53-59,共7页

为了建立一种新型、高效的活菌检测技术,以细菌酯酶代谢活性为判断依据,设计合成了一种新型噻唑橙荧光染料——TOMA,其结构经核磁共振谱、高分辨质谱确证.对TOMA的细胞膜穿透性、酯酶敏感性及对DNA的PCR扩增的抑制作用3方面特性进行了... 为了建立一种新型、高效的活菌检测技术,以细菌酯酶代谢活性为判断依据,设计合成了一种新型噻唑橙荧光染料——TOMA,其结构经核磁共振谱、高分辨质谱确证.对TOMA的细胞膜穿透性、酯酶敏感性及对DNA的PCR扩增的抑制作用3方面特性进行了初步验证.结果显示:10 mg/L的TOMA于室温、黑暗条件下与活的大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7混合孵育10 min后菌体发出强烈荧光,表明该分子能有效穿透细菌壁膜,并与核酸有良好的结合能力;用固定化脂肪酶对TOMA进行体外水解,水解率达83%,说明该分子的酯键能在相关酶作用下断裂;TOMA与实时荧光定量PCR联用时,该分子对细菌DNA扩增具有明显的抑制作用.以上结果证明TOMA分子设计基本达到预期目的. 展开更多

关键词 细菌 酯酶 代谢活性 噻唑橙荧光染料 pcr DNA扩增 荧光

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红罗非鱼Na^+-K^+-ATPase α基因的克隆及其在不同盐度条件下mRNA表达差异

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作者 王忠良 张健东 +6 位作者 黄建盛 汤保贵 周晖 施钢 潘传豪 吴灶和 陈刚 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期137-145,共9页

为获知红罗非鱼(Oreochromis sp.)Na+-K+-ATPaseα基因的全长分子结构及其在不同盐度条件下的表达情况,采用同源克隆及cDNA末端快速扩增(RACE-PCR)方法,首次在红罗非鱼鳃组织中克隆到了全长为3 379 bp的Na+-K+-ATPaseα基因全长cDNA序列... 为获知红罗非鱼(Oreochromis sp.)Na+-K+-ATPaseα基因的全长分子结构及其在不同盐度条件下的表达情况,采用同源克隆及cDNA末端快速扩增(RACE-PCR)方法,首次在红罗非鱼鳃组织中克隆到了全长为3 379 bp的Na+-K+-ATPaseα基因全长cDNA序列,该序列包含3 072 bp的开放阅读框(ORF),143 bp的5'末端非编码区(UTR)和164 bp的3'末端非编码区(UTR),编码1023个氨基酸,预测分子量为112.5 kD,理论等电点为5.26。BLAST分析显示红罗非鱼Na+-K+-ATPaseα基因编码的氨基酸序列与其它已知物种相应基因编码的氨基酸序列的同源性达到97%-99%;系统进化分析显示,红罗非鱼Na+-K+-ATPaseα亚基与萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)和莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)亲缘关系较近。应用Real-time PCR技术,以β-actin基因为内参,对不同盐度(0、15、25、32 g/L)条件下鳃组织中Na+-K+-ATPaseα基因的表达情况进行了比较分析,结果表明,当盐度为25 g/L时,Na+-K+-ATPaseα基因的表达量达到峰值,而盐度升至32 g/L时,其表达量呈下降趋势;各盐度处理组中,养殖12 h后Na+-K+-ATPaseα基因的mRNA表达量显著上升(P<0.05)并达到最高;随着养殖时间的延长,24 h后该基因mRNA表达量开始降低,但仍然显著高于对照组的表达量值(P<0.05)。 展开更多

关键词 红罗非鱼 Na+-K+-ATPase α 基因 CDNA 末端快速扩增 实时荧光定量 pcr

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桃拉综合征病毒的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)检测方法的建立 被引量：4

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作者 李伟哲 刘露 +1 位作者 李丽娜 肖勤 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期79-85,共7页

桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)是威胁虾类养殖业的主要病毒之一。本试验建立了一种快速检测TSV的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)方法,并与荧光定量PCR(qPCR)进行了对比。基于TSV的衣壳蛋白VP2核酸序列,设计3... 桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)是威胁虾类养殖业的主要病毒之一。本试验建立了一种快速检测TSV的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)方法,并与荧光定量PCR(qPCR)进行了对比。基于TSV的衣壳蛋白VP2核酸序列,设计3对特异性引物(外引物:FIP/BIP,内引物:F3/B3,环引物:LF/LB),进行LAMP反应体系的优化。其中引物LF以BIO标记,LB以FAM标记,用于横向流动试纸条(LFD)的检测。结果表明:LAMP最佳反应可在63℃恒温条件下40 min内完成。整个扩增反应到LFD结果判定可在45 min内完成。LAMP-LFD可特异性检出TSV特异性片段,未与其它病毒和细菌发生交叉反应,且其检测限为22.9 fg。与qPCR相比,本研究所建立的LAMP-LFD检测体系虽然检测限高于qPCR 10倍,但比qPCR检测时间缩短近1 h,且LAMP-LFD特异性强、操作简单,无需特殊仪器设备,可快捷、方便地检测出TSV,满足TSV基层快速检测的需要。 展开更多

关键词 横向流动试纸条 环介导等温扩增 桃拉综合征病毒 荧光定量pcr

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