基于DNA染料EMA的PCR技术检测鉴别副溶血性弧菌死活细胞 被引量：14

1

作者 祝儒刚 吕淑霞 +1 位作者 刘月萍 张喆 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期144-149,共6页

将一种DNA染料(ethidium bromide monoazide,EMA)与传统的PCR技术相结合,建立了一种能有效检测纯培养条件下副溶血弧菌死活菌细胞的新方法(EMA-PCR)。研究结果表明,当用1.4μg/mL或更高浓度的EMA渗透处理含有108 CFU/mL的副溶血弧菌死... 将一种DNA染料(ethidium bromide monoazide,EMA)与传统的PCR技术相结合,建立了一种能有效检测纯培养条件下副溶血弧菌死活菌细胞的新方法(EMA-PCR)。研究结果表明,当用1.4μg/mL或更高浓度的EMA渗透处理含有108 CFU/mL的副溶血弧菌死细胞菌悬液后再经20 min曝光处理,其PCR结果呈阴性,而不经EMA处理的对照组其PCR结果则呈阳性;当EMA的用量等于或者小于2μg/mL时,副溶血弧菌活细胞的PCR扩增不会受到抑制。经EMA处理,含有不同比例的副溶血弧菌死细胞和活细胞的混合液中活的副溶血弧菌能够通过PCR被选择性的定量,最小的检测水平为10 CFU/PCR。而且,经研究发现在(10～2×105)CFU/PCR范围内,DNA相对荧光强度与死活细胞混合液中活细胞的对数具有线性关系。 展开更多

关键词 ethidium bromide monoazide 聚合酶链反应 副溶血弧菌 死活细胞

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金黄色葡萄球菌VBNC状态的诱导条件和EMA-qPCR检测 被引量：6

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作者 余以刚 田聪 +3 位作者 肖性龙 陶文扬 黎金霞 吴晖 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第1期127-132,共6页

为建立金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)活的非可培养(VBNC)状态的诱导条件模型,考察了温度、盐度和酸度3个因素对金黄色葡萄球菌细菌可培养数的影响,通过正交试验优化得到了VBNC状态的诱导条件,同时观察细菌可培养数的变化,建立... 为建立金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)活的非可培养(VBNC)状态的诱导条件模型,考察了温度、盐度和酸度3个因素对金黄色葡萄球菌细菌可培养数的影响,通过正交试验优化得到了VBNC状态的诱导条件,同时观察细菌可培养数的变化,建立了DNA结合染料叠氮溴乙锭(EMA)与qPCR技术相结合检测VBNC金黄色葡萄球菌的方法.实验结果表明:细菌可培养数受酸度的影响最大,VBNC状态的最佳诱导条件为菌液在含15%NaCl和0.3%乙酸的营养肉汤培养基中于4℃下培养12 d;通过正交试验诱导后的不可培养菌可由EMA-qPCR方法有效检出,其与qPCR法的Ct值(荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数)之差在1.29～8.56之间变化. 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌 活的非可培养状态 诱导条件 叠氮溴乙锭 qPCR

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利用EMA-qPCR建立快速检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法 被引量：13

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作者 周大祥 殷幼平 +1 位作者 王中康 熊书 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期143-148,共6页

利用叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-qPCR),建立了一种有效快速检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法。以猕猴桃溃疡病菌ITS序列为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行qPCR特异性扩增。结果显示,q... 利用叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-qPCR),建立了一种有效快速检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法。以猕猴桃溃疡病菌ITS序列为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行qPCR特异性扩增。结果显示,qPCR检测灵敏度为2cfu;当EMA的浓度为2.0μg/mL时,能有效抑制1.0×10~7 cfu/mL经高温灭活的死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×10~1~1.0×10~5 cfu范围内,每个qPCR反应体系中活菌数与Ct值呈线性相关(R^2=0.988)。不同温度处理活菌菌悬液后用EMA-qPCR检测猕猴桃溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,结果表明待检样品可在4℃和20℃短期保存。对疑似带病猕猴桃材料进行EMA-qPCR检测,结果表明能减少猕猴桃溃疡病菌PCR的假阳性结果。本研究建立的EMAqPCR方法是一种有效检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法,能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。 展开更多

关键词 猕猴桃溃疡病菌 叠氮溴乙锭 实时荧光定量PCR 活菌检测

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EMA-qPCR方法快速检测番茄溃疡病菌活菌研究 被引量：4

4

作者 周大祥 熊书 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第1期99-104,共6页

将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-q PCR),建立一种有效快速检测番茄溃疡病活菌的方法。以番茄溃疡病菌Pat-1基因为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行q PCR特异性扩增。结果显示,q PCR检测灵敏度为1.0×101CFU/m... 将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-q PCR),建立一种有效快速检测番茄溃疡病活菌的方法。以番茄溃疡病菌Pat-1基因为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行q PCR特异性扩增。结果显示,q PCR检测灵敏度为1.0×101CFU/m L;当EMA的浓度为2.0μg/m L时,能有效抑制1.0×107CFU/m L灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×101~1.0×105CFU内,每个q PCR反应体系中活菌CFU数与Ct值呈线性相关(R2=0.987)。不同温度处理后EMA-q PCR检测番茄溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,表明待检样品可在4和20℃短期保存。对疑似带病番茄种子样品进行EMA-q PCR检测,发现EMA-q PCR方法能减少番茄溃疡病菌PCR检测的假阳性结果。本研究建立的EMA-q PCR方法是一种能有效检测番茄溃疡病活菌的方法,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。 展开更多

关键词 番茄溃疡病菌 叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide EMA) 实时荧光定量PCR(q PCR)

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肠炎沙门氏菌EMA-PCR检测方法的建立 被引量：6

5

作者 颜成英 汤晓艳 +3 位作者 王敏 康大成 李朋颖 郑锌 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第6期90-93,共4页

将荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术相结合,用于肠炎沙门氏菌活菌的检测。实验参数优化结果表明,当EMA终质量浓度50μg/mL、曝光时间10 min时,可以抑制约107 CFU... 将荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术相结合,用于肠炎沙门氏菌活菌的检测。实验参数优化结果表明,当EMA终质量浓度50μg/mL、曝光时间10 min时,可以抑制约107 CFU/mL肠炎沙门氏菌死菌DNA的扩增;活菌灵敏度检测结果显示,EMA-PCR方法检测限与单一PCR方法一样均为27.5 CFU/mL,说明EMA处理既不会影响活菌DNA的扩增也不会影响PCR方法的灵敏度。利用EMA-PCR方法检测死活混合菌液时发现,添加EMA的实验组DNA条带亮度会随着活菌比例的降低而变暗,且当样品中全是死菌时,没有目标条带出现;而不添加EMA的对照组DNA条带亮度没有变化,当样品中全是死菌时,目标条带依然清晰可见。说明添加EMA可以达到区分死活菌的目的,EMA-PCR方法只检测样品中的活菌,避免了死菌DNA造成假阳性的可能性。 展开更多

关键词 叠氮溴乙锭 聚合酶链式反应 肠炎沙门氏菌

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荧光染料EMA在实时荧光PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用 被引量：7

6

作者 祝儒刚 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第20期206-210,共5页

将荧光染料——叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时荧光-聚合酶链式反应(real-time poly-merase chain reaction,RT-PCR)技术相结合,对其在RT-PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用进行研究。纯培养条件下... 将荧光染料——叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时荧光-聚合酶链式反应(real-time poly-merase chain reaction,RT-PCR)技术相结合,对其在RT-PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用进行研究。纯培养条件下,在2.2×102～2.2×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且不添加EMA时的检测灵敏度(22CFU)略大于添加EMA(2.2×102CFU)时的检测灵敏度;人工污染牡蛎样品,利用RT-PCR和EMA RT-PCR以及平板计数法分别进行副溶血弧菌定量检测,结果表明EMA RT-PCR更接近于平板计数的结果,单纯RT-PCR定量的结果偏大;在采集的45份海产品样品中,不经富集培养,利用EMA RT-PCR方法仅有一份牡蛎样品呈阳性,牡蛎样品污染程度为114CFU/g。该方法能够快速、灵敏、准确地进行海产品中致病性副溶血弧菌活细胞的定量检测,具有很好的应用价值。 展开更多

关键词 叠氮溴乙锭(EMA) 实时荧光聚合酶链式反应(RT-PCR) 海产品 活细胞 副溶血弧菌检测

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冷藏对虾中腐败希瓦氏菌活菌EMA-qPCR检测方法的建立

7

作者 肖玲 唐廷廷 +1 位作者 李美良 韩国全 《四川农业大学学报》 CSCD 北大核心 2019年第2期247-252,共6页

【目的】将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光PCR技术相结合,建立快速检测腐败希瓦氏菌活菌的方法。【方法】用不同浓度的EMA和作用时间优化对腐败希瓦氏菌活菌的EMA-qPCR检测方法。研究该方法对活菌的最低检出限及能抑制死菌DNA扩增的最高浓... 【目的】将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光PCR技术相结合,建立快速检测腐败希瓦氏菌活菌的方法。【方法】用不同浓度的EMA和作用时间优化对腐败希瓦氏菌活菌的EMA-qPCR检测方法。研究该方法对活菌的最低检出限及能抑制死菌DNA扩增的最高浓度。研究该检测方法对不同比例死、活腐败希瓦氏菌的检测效果。用10株不同细菌验证该方法的特异性。检测101尾冷藏南美对虾中的腐败希瓦氏菌,并用平板培养法和qPCR方法对结果进行验证。【结果】EMA-qPCR检测最优方法为用终浓度20μg/mL的EMA处理细菌20 min。建立的EMA-qPCR法能够最低检测活菌的浓度为1 CFU/反应,能有效抑制1.0×10~7CFU/反应腐败希瓦氏菌死菌细胞DNA的扩增。对于死活混合菌,EMA-qPCR能够选择性扩增活菌DNA。该检测方法特异性良好。EMA-qPCR、平板培养和qPCR分别在16、12和19尾对虾中检测到腐败希瓦氏菌。【结论】EMA-qPCR检测技术能够快速、准确的区分腐败希瓦氏菌死菌和活菌,可作为水产品中腐败希瓦氏菌活菌的新检测方法。 展开更多

关键词 腐败希瓦氏菌 活菌检测 叠氮溴化乙锭 实时荧光定量PCR 南美白对虾

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EMA-PCR法快速检测啤酒中腐败短乳杆菌 被引量：4

8

作者 马艳琳 徐振波 +2 位作者 刘君彦 汪东风 邓阳 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第8期271-276,共6页

将叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术相结合,以酒花耐受基因hor C为靶基因,用啤酒腐败短乳杆菌基因组DNA作为模板进行扩增。结果发现,在前处理过程中加入EMA,当终质量浓... 将叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术相结合,以酒花耐受基因hor C为靶基因,用啤酒腐败短乳杆菌基因组DNA作为模板进行扩增。结果发现,在前处理过程中加入EMA,当终质量浓度小于20μg/m L时,对活的短乳杆菌中靶基因的扩增没有明显抑制作用;而当EMA终质量浓度为1.0μg/m L时可有效抑制10~5 CFU/m L短乳杆菌死细胞的扩增。本实验建立的EMA-PCR检测方法的灵敏度为10~4活细胞/m L酒液样品。验证实验结果表明,在13株乳酸菌中,建立的hor C特异性EMA-PCR能有效检测到其中的全部5株啤酒污染菌,同时可区分这5株菌的活/死细胞混合体系,降低检测过程中的假阳性。 展开更多

关键词 叠氮溴乙锭 聚合酶链式反应 啤酒腐败菌 短乳杆菌 酒花耐受基因

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表面活性剂脱氧胆酸钠在单增李斯特菌死活细胞EMA-PCR鉴别中的应用 被引量：6

9

作者 郝乐友 吕淑霞 +3 位作者 张超 于晓丹 马镝 曹慧颖 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期174-179,共6页

通过脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SD)结合染料叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与PCR反应体系相结合,建立纯培养条件下区分单增李斯特菌死活细胞的方法,即SD-EMA-PCR鉴别单增李斯特菌死活细胞检测法。结果表明:向浓度为2... 通过脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SD)结合染料叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与PCR反应体系相结合,建立纯培养条件下区分单增李斯特菌死活细胞的方法,即SD-EMA-PCR鉴别单增李斯特菌死活细胞检测法。结果表明:向浓度为2.0×108CFU/mL的单增李斯特死菌悬液中加入终浓度为1.5 mg/mL的表面活性剂脱氧胆酸钠后,EMA激活光解最佳曝光时间为25 min。SD-EMA-PCR检测体系中,对死菌细胞DNA的PCR扩增抑制的EMA最小浓度为1.6μg/mL;而对活菌细胞DNA的PCR扩增不抑制的EMA最大浓度为9μg/mL,活菌细胞的最低检出限为20 CFU/mL。SD-EMA-PCR检测法能够减小EMA-PCR漏检死菌细胞给检测结果带来假阳性的可能,降低了检测的成本,为单增李斯特菌的快速检测提供了一种新的有效途径。 展开更多

关键词 表面活性剂 脱氧胆酸钠 单增李斯特菌 死活细胞 叠氮溴乙锭

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发酵饲料中乳酸菌含量检测的EMA-qPCR方法 被引量：2

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作者 胡会龙 魏小兵 +4 位作者 王秋霞 欧长波 闫艺婷 吕玉琼 刘兴友 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期2166-2170,共5页

旨在快速检测发酵饲料中乳酸菌含量,将叠氮溴乙锭(EMA)与q-PCR技术相结合,通过对诸如EMA浓度、曝光时间等影响EMA的因素进行探索,确定EMA的作用条件。在试验条件下用EMA处理已知浓度的乳酸菌菌液,提取乳酸菌DNA,结合q-PCR建立Ct值与乳... 旨在快速检测发酵饲料中乳酸菌含量,将叠氮溴乙锭(EMA)与q-PCR技术相结合,通过对诸如EMA浓度、曝光时间等影响EMA的因素进行探索,确定EMA的作用条件。在试验条件下用EMA处理已知浓度的乳酸菌菌液,提取乳酸菌DNA,结合q-PCR建立Ct值与乳酸菌含量对数值之间的标准曲线。利用标准曲线,快速计算发酵饲料中的乳酸菌含量。结果表明EMA浓度在3~4μg·mL-1曝光10min可有效抑制死菌DNA的扩增,从而消除死菌DNA扩增对Ct值的影响。通过对8份发酵饲料进行检测,其结果与平板计数具有较高的符合度。EMA-qPCR方法可用于快速准确地检测发酵饲料中活的乳酸菌含量。 展开更多

关键词 叠氮溴乙锭 实时荧光定量PCR 乳酸菌含量

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双重PCR结合EMA检测副溶血性弧菌及携带trh相关毒性的活菌细胞 被引量：1

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作者 刘月苹 吕淑霞 +1 位作者 李雪彤 林英 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期1580-1587,共8页

为建立一种有效鉴别副溶血性弧菌及trh相关毒性活菌细胞的方法,本研究针对副溶血性弧菌种属特异的tlh基因以及trh毒性基因设计引物进行双重PCR检测,采用双重PCR与DNA染料叠氮溴化乙锭(EMA)结合,在鉴定副溶血性弧菌活细胞的同时检测trh... 为建立一种有效鉴别副溶血性弧菌及trh相关毒性活菌细胞的方法,本研究针对副溶血性弧菌种属特异的tlh基因以及trh毒性基因设计引物进行双重PCR检测,采用双重PCR与DNA染料叠氮溴化乙锭(EMA)结合,在鉴定副溶血性弧菌活细胞的同时检测trh毒性。结果表明,该检测方法对海产品中的副溶血性弧菌及trh相关毒性活菌细胞的检测具有特异性,且灵敏度较高。在浓度为2.0×108CFU·m L-1,EMA浓度为1.0~8.0μg·m L-1的副溶血性弧菌悬液中,EMA激活光解20 min时,可抑制死菌细胞DNA的双重PCR扩增而不能抑制活菌细胞DNA的双重PCR扩增,从而实现副溶血性弧菌活细胞及trh基因相关毒性的鉴别。本研究建立的方法可以特异、高效的针对副溶血性弧菌及trh相关毒性活菌细胞进行检测,为食品检测提供了参考依据。 展开更多

关键词 副溶血性弧菌 毒性 活细胞 双重PCR 叠氮溴化乙锭

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牛奶中活沙门氏菌BCAC-EMA-Rti-LAMP快速检测方法的研究 被引量：3

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作者 张天添 陈鹄 +3 位作者 吴国平 舒梅 林丽萍 钟婵 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1192-1199,共8页

研究以沙门氏菌的invA基因序列设计特异性引物,结合蒙脱石封闭的活性炭(BCAC)吸附、叠氮溴化乙锭(EMA)前处理牛奶样品,建立了一种基于实时荧光环介导等温扩增法(Rti-LAMP)非预增菌快速检测牛奶中低浓度活沙门氏菌的方法。以每份25 mL牛... 研究以沙门氏菌的invA基因序列设计特异性引物,结合蒙脱石封闭的活性炭(BCAC)吸附、叠氮溴化乙锭(EMA)前处理牛奶样品,建立了一种基于实时荧光环介导等温扩增法(Rti-LAMP)非预增菌快速检测牛奶中低浓度活沙门氏菌的方法。以每份25 mL牛奶样品,人工模拟不同浓度沙门氏菌污染,用4.0 g蒙脱石封闭的活性炭吸附处理样品,然后对回收精制的细菌样品用4.0μg/mL EMA终浓度作用处理,提取细菌样品DNA用于RtiLAMP扩增检测,该方法检测灵敏度为1×10^1CFU/mL活沙门氏菌,整个检测过程约5 h。以沙门氏菌国标检测法为参照,采用BCAC-EMA-Rti-LAMP检测生鲜牛奶样品27份,结果显示:2种方法均检测到同一份沙门氏菌阳性牛奶样品,而BCAC-EMA-Rti-LAMP另检测到3份牛奶样品沙门氏菌阳性。研究表明,建立的BCAC-EMARti-LAMP检测方法较国标检测法更灵敏、快速,可用于牛奶沙门氏菌污染的快速检测。 展开更多

关键词 牛奶 沙门氏菌 实时荧光环介导等温扩增法 蒙脱石封闭的活性炭 叠氮溴化乙锭

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