牛分枝杆菌esat6和cfp10蛋白的表达及在临床检测中的应用

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作者 解晓莉 韩猛 +6 位作者 刘来兴 王基隆 杨美 张云飞 丁家波 张亮 杨宏军 《山东农业科学》 2017年第11期120-123,共4页

本研究以牛分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,扩增esat6和cfp10基因,构建重组表达载体p ET-32a(+)-esat6和p ET-32a(+)-cfp10,并通过原核表达系统分别表达重组esat6和cfp10蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化后,对目的蛋白进行SDS-PAGE和Western ... 本研究以牛分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,扩增esat6和cfp10基因,构建重组表达载体p ET-32a(+)-esat6和p ET-32a(+)-cfp10,并通过原核表达系统分别表达重组esat6和cfp10蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化后,对目的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot验证,BCA法测定目的蛋白浓度,最后将east6和cfp10蛋白混合后用于牛结核病临床检测,并对检测数据进行分析。结果表明,牛分枝杆菌esat6和cfp10蛋白在大肠杆菌系统中获得高效表达;其混合蛋白应用于结核病检测具有较高的特异性,且在皮肤变态反应和IFN-γ释放试验两种检测方法中具有较高的符合率。说明相较于提纯结核菌素(PPD),esat6和cfp10混合蛋白具有较高的特异性和稳定性,将有希望替代PPD用于牛结核病检测。 展开更多

关键词 牛分枝杆菌 esat6和cfp10蛋白 皮肤变态反应 IFN-γ释放试验

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基于牛分枝杆菌融合蛋白ESAT6-CFP10-TB27.4间接ELISA检测方法的建立

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作者 姜美奇 赵文娟 +11 位作者 许淑芸 魏京京 黎雪勤 徐雪可 周霞 吴桐忠 王莉莉 韩猛立 张星星 张倩 钟发钢 黄新 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期480-486,515,共8页

为建立检测牛分枝杆菌(MB)抗体的间接ELISA方法,本研究选取MB ESAT6、CFP10和TB27.4基因,通过柔性linker(GGGGS)连接,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-EC-27.4,经双酶切及测序鉴定正确后,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),并在不同温... 为建立检测牛分枝杆菌(MB)抗体的间接ELISA方法,本研究选取MB ESAT6、CFP10和TB27.4基因,通过柔性linker(GGGGS)连接,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-EC-27.4,经双酶切及测序鉴定正确后,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),并在不同温度和时间下经IPTG诱导表达并超声破碎。采用镍亲和层析方法纯化重组EC-27.4蛋白(rEC-27.4)后,通过SDS-PAGE检测rEC-27.4的表达及纯化效果,采用western blot检测其反应原性。SDS-PAGE结果显示,当IPTG浓度为0.3 mmol/L,温度为16℃时,诱导rEC-27.4的表达量最高且其以可溶性形式表达,且纯化后在75 ku处出现单一目的条带。Western blot结果显示在75 ku处出现特异性条带。经BCA试剂盒测定rEC-27.4的浓度为0.852 mg/mL。以纯化的该重组蛋白作为包被抗原,采用棋盘法优化各反应条件,初步建立检测MB抗体的间接ELISA方法。采用优化后的间接ELISA方法分别检测MB阳性和阴性血清以及沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副结核分枝杆菌、结核分枝杆菌、布鲁氏菌和牛病毒性腹泻病毒等阳性牛血清,评估该方法的特异性;将MB阳性血清2倍倍比稀释(1:50~1:6400)后,采用本研究建立的间接ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;以同批次和不同批次表达的rEC-TB27.4分别包被ELISA板,采用优化的间接ELISA方法检测5份MB阳性血清和3份阴性血清,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能检测到MB阳性血清,其他相关细菌及病毒阳性血清均为阴性结果;牛分枝杆菌阳性血清1:400稀释时仍为阳性结果;该方法对8份血清的批内、批间重复性试验的变异系数均小于7%。采用建立的间接ELISA方法检测377份临床牛血清样品,并同时采用动物结核分枝杆菌夹心ELISA抗体检测试剂盒及PPDB皮肤试验(TST)和BTB IFN-γ释放试验(IGRA)检测,结果显示,该间接ELISA方法的阳性检测率为6.90%(26/377),阴性样品数为351份;夹心ELISA试剂盒的阳性检测率为7.43%(28/377),阴性样品数为349份;TST和IGRA的阳性检测率均为52.52%(198/377),阴性样品数均为179份。本研究建立的间接ELISA与夹心ELISA抗体检测试剂盒的阳性和阴性符合率分别为53.6%和96.8%;与TST和IGRA的阳性和阴性符合率均为11.1%和97.8%。本研究基于MB r EC-27.4建立的间接ELISA抗体检测方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,在MB所致牛结核的早期检测中有一定的优势,为牛结核的检测和早期诊断提供了新的技术手段。 展开更多

关键词 牛分枝杆菌 esat6-cfp10-TB27.4融合蛋白 原核表达 间接ELISA

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结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠免疫应答及其保护力 被引量：12

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作者 张海 师长宏 +3 位作者 薛莹 柏银兰 王丽梅 徐志凯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期443-446,共4页

目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原... 目的:研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力。方法:用预先转移到硝酸纤维素膜条的ES-AT6-CFP10融合蛋白采用皮下包埋的方法免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。末次免疫后,取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后计数脾脏中的细菌数。结果:ESAT6-CFP10融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6400。淋巴细胞刺激增殖指数为1.90±0.15,明显高于生理盐水组(0.90±0.15);IFN-γ和IL-2的含量分别为1.792±19ng/L和0.211±11ng/L,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时融合蛋白诱导的脾细胞杀伤率为36%。与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,融和蛋白免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为5.24±0.15,P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏中细菌负荷减少甚微。结论:ESAT6-CFP10融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 疫苗 esat6 cfp10 重组融合蛋白

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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 被引量：9

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作者 李娟 吴雪琼 +3 位作者 张俊仙 李香兰 张灵霞 梁建琴 《中国防痨杂志》 CAS 北大核心 2004年第4期204-208,共5页

目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法　通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a... 目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法　通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果　重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 cfp10-esat6融合蛋白 大肠杆菌 免疫学 基因表达

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CFP10/ESAT6融合蛋白-ELISPOT方法的建立及其在结核分枝杆菌感染诊断中的应用价值 被引量：17

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作者 李峤珂 吴雪琼 +9 位作者 阳幼荣 梁艳 张俊仙 李楠 叶丽萍 梁建琴 王安生 张广宇 张涛 王兰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期551-554,共4页

目的建立应用酶联免疫斑点试验（Enzyme Linked-Immunospot Assay,ELISPOT）检测结核分枝杆菌感染的方法 ,评价CFP10/ESAT6融合蛋白抗原在检测结核分枝杆菌感染中的应用价值。方法通过比较不同的实验条件确定ELIS-POT检测结核分枝杆菌... 目的建立应用酶联免疫斑点试验（Enzyme Linked-Immunospot Assay,ELISPOT）检测结核分枝杆菌感染的方法 ,评价CFP10/ESAT6融合蛋白抗原在检测结核分枝杆菌感染中的应用价值。方法通过比较不同的实验条件确定ELIS-POT检测结核分枝杆菌感染方法的最佳细胞浓度、孵育时间、蛋白抗原浓度等,建立ELISPOT方法。以PPD皮肤试验作对照。结果 ELISPOT方法的最佳实验条件为：每孔细胞浓度2×105,CFP10/ESAT6融合蛋白抗原浓度20~40μg/mL,细胞孵育时间20h。应用PPD皮试检测30例健康体检者、38例非结核疾病患者和40例结核病患者的阳性率分别为40.0%、0%、72.5%,而ELISPOT检测的阳性率分别为20.0%、10.5%、92.5%。应用ELISPOT检测40例结核病痰菌阳性组和阴性组的灵敏度分别为94.4%、90.9%。结论应用CFP10/ESAT6融合蛋白作为抗原建立的ELISPOT方法可初步应用于诊断结核分枝杆菌感染、辅助结核病诊断。 展开更多

关键词 酶联免疫斑点试验(ELISPOT) cfp10/esat6融合蛋白 结核病 Γ-干扰素 诊断

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以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值 被引量：11

6

作者 袁凯 梁德 +7 位作者 吴雪琼 姚珍松 晋大祥 杨志东 张顺聪 丁金勇 江晓兵 陈建庭 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期44-49,共6页

目的评价以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点(ELISPOT)技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值。方法选取2012年5月至2013年12月广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科和南方医科大学南方医院脊柱骨科收治的疑似脊柱结核患者91例... 目的评价以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点(ELISPOT)技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值。方法选取2012年5月至2013年12月广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科和南方医科大学南方医院脊柱骨科收治的疑似脊柱结核患者91例,根据临床和细菌性诊断结果分为脊柱结核组(n=52)和对照组(n=39)。采用ELISPOT试验检测脊柱结核组和对照组外周血单个核细胞,观察斑点形成细胞的数量。患者同时接受结核菌素(PPD)皮肤试验、血清抗结核抗体检测、病灶病理学检查、抗酸杆菌涂片和病灶结核分枝杆菌培养,比较不同检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值,分析不同检测结果的一致性。结果 52例脊柱结核患者中共47例接受病灶活检穿刺病理检查,其中41例病理证实为结核。ELISPOT试验在脊柱结核诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为82.7%、87.2%、89.6%和79.1%;PPD皮肤试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为61.5%、46.2%、60.4%和47.4%;血清抗结核抗体试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为55.8%、61.5%、65.9%和51.1%。在脊柱结核患者中,ELISPOT试验的阳性率显著高于PPD皮肤试验(82.7%比61.5%,χ2=5.786,P=0.016)和血清抗结核抗体试验(82.7%比55.8%,χ2=8.847,P=0.003),与病理学检查比较差异无统计学意义(82.7%比87.2%,χ2=0.396,P=0.529)。ELISPOT试验与病理学检查一致性较好(87.2%,κ=0.498,P=0.001)。结论以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的ELISPOT法应用于脊柱结核诊断有良好的敏感性和特异性,可作为脊柱结核感染辅助诊断的有效方法。 展开更多

关键词 脊柱结核 酶联免疫斑点试验 cfp10/esat6融合蛋白 辅助诊断

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结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用 被引量：5

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作者 王晓玮 程筱雯 +5 位作者 张焰 徐东芳 王东萍 韦薇 王庆 徐元宏 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2015年第9期1347-1351,共5页

以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础,建立稳定的ELISPOT方法;检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT,与临床诊断及T-SPOT·TB结果对比。表达所得重组蛋白浓度和纯度如下:CFP10为0.5 mg/ml,84%;ESAT6为4 mg... 以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础,建立稳定的ELISPOT方法;检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT,与临床诊断及T-SPOT·TB结果对比。表达所得重组蛋白浓度和纯度如下:CFP10为0.5 mg/ml,84%;ESAT6为4 mg/ml,98%。ELISPOT方法最佳实验条件为每孔细胞密度2×105/孔,CFP10、ESAT6蛋白抗原浓度分别为10μg/孔,细胞孵育时间20 h。ELISPOT的灵敏度与特异度分别为88.50%、82.35%,检测结果与TSPOT·TB方法结果一致(χ2=0.57)。 展开更多

关键词 结核病诊断 Γ-干扰素 ELISPOT cfp10 esat6

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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆表达及效价测定 被引量：6

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作者 都伟欣 陈保文 +2 位作者 沈小兵 苏城 王国治 《中国防痨杂志》 CAS 2006年第4期221-224,共4页

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达... 目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达融合蛋白,离子层析柱分离纯化融合蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,融合蛋白占总菌体蛋白的30%以上,经离子层析柱纯化纯度达95%以上。重组蛋白可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,2.5μg/ml重组蛋白诱导豚鼠皮试反应与TB-PPD(50 IU/ml)等效。结论重组融合蛋白有望成为结核感染皮试诊断用新试剂。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 重组cfp10-esat6融合蛋白 豚鼠 皮试

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结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响 被引量：5

9

作者 赵勇 师长宏 +4 位作者 张彩勤 毛峰峰 白冰 伍静 张海 《中国比较医学杂志》 CAS 2010年第6期13-16,共4页

目的研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬细胞后加入纯化的重组ESAT6-CFP10融合蛋白,通过透射电镜检测自噬体的形成。提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR及Western b... 目的研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬细胞后加入纯化的重组ESAT6-CFP10融合蛋白,通过透射电镜检测自噬体的形成。提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR及Western blot方法检测自噬相关基因(atg)分子水平和蛋白表达水平。结果ESAT6-CFP10融合蛋白可抑制小鼠巨噬细胞自噬体的形成,并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降最为明显。结论MTB ESAT6-CFP10融合蛋白通过调控atg分子表达水平影响小鼠巨噬细胞自噬功能。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 esat6-cfp10融合蛋白 自噬 自噬相关基因(atg)

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融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用 被引量：3

10

作者 刘冬光 廖娟红 +3 位作者 于清龙 陈颖钰 陈焕春 郭爱珍 《中国奶牛》 2009年第10期7-11,共5页

本研究通过融合表达Rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,... 本研究通过融合表达Rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG0.4mmol/L诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中,Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份,检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94%(17/18)。因此,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下,敏感性获得了显著提高,这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。 展开更多

关键词 牛结核 Rv3872 cfp-10 esat-6 诊断

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ESAT6和CFP10融合蛋白抑制巨噬细胞自噬体形成的实验研究

11

作者 师长宏 毛峰峰 +4 位作者 赵勇 张海 张彩琴 白冰 赵善民 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期414-417,共4页

目的观察ESAT6和CFP10融合蛋白对感染MTB的巨噬细胞自噬体形成的抑制作用。方法雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞自噬体形成后,用MTB毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用25μg/mL的ESAT6-CFP10融合蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,计数MT... 目的观察ESAT6和CFP10融合蛋白对感染MTB的巨噬细胞自噬体形成的抑制作用。方法雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞自噬体形成后,用MTB毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用25μg/mL的ESAT6-CFP10融合蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,计数MTB的菌落数。提取巨噬细胞总RNA和蛋白,以RT-PCR和免疫印迹方法检测自噬相关基因(atg)表达水平的变化。结果 ESAT6-CFP10融合蛋白后可抑制巨噬细胞中自噬体的形成,显著提高CFU指数(P<0.05),并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降最为明显(P<0.05)。结论 ESAT6和CFP10融合蛋白可通过调控atg表达水平影响巨噬细胞自噬功能。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 自噬 esat6 cfp10 自噬相关基因

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融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠的免疫应答及其保护力

12

作者 张海 师长宏 +3 位作者 薛莹 柏银兰 王丽梅 徐志凯 《中国比较医学杂志》 CAS 2006年第9期574-574,共1页

目的研究融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导的小鼠体液和细胞免疫应答水平。方法以106CFU/0.1 mL重组M.S通过尾静脉途径免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。取部... 目的研究融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导的小鼠体液和细胞免疫应答水平。方法以106CFU/0.1 mL重组M.S通过尾静脉途径免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。结果融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6 400。淋巴细胞刺激增殖指数为2.8,明显高于生理盐水组(0.90);IFN-γ和IL-2的含量分别为2230±11 pg/mL和221±17 pg/mL,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时重组耻垢分枝杆菌诱导的脾细胞杀伤率为45%。结论融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌能诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,可作为结核新型疫苗使用。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 疫苗 esat6 cfp10 融合蛋白 耻垢分枝杆菌

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结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白的融合表达及其细胞免疫学特性 被引量：2

13

作者 孟闯 万婷 +6 位作者 徐正中 单法 解晓莉 申峻松 范峰 陈祥 焦新安 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期789-794,共6页

本研究旨在原核表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白,分析其在小鼠模型中的细胞免疫应答特性,并评价其作为牛结核外周血IFN-γ释放试验特异性刺激原的能力。首先,通过构建pET30a(+)-esat6-linker-lhp重组质粒,BL21(DE3)中诱导表达ESAT6... 本研究旨在原核表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白,分析其在小鼠模型中的细胞免疫应答特性,并评价其作为牛结核外周血IFN-γ释放试验特异性刺激原的能力。首先,通过构建pET30a(+)-esat6-linker-lhp重组质粒,BL21(DE3)中诱导表达ESAT6-CFP10融合蛋白并纯化,随后经细胞表面分子的FACS分析、ELISPOT试验等分析其在小鼠中的细胞免疫应答特性,同时作为刺激原用于奶牛IFN-γ释放试验,评价其用于牛结核病诊断的潜能。结果表明:SDS-PAGE显示目的蛋白成功表达,Western blotting证实其对ESAT6、CFP10单克隆抗体有良好免疫反应性。FACS结果显示其上调树突状细胞表面CD80和CD86分子以及小鼠脾CD4+和CD8+T细胞表面CD69的表达,ELISPOT结果表明其诱导的特异性IFN-γ分泌细胞数显著高于IL-4分泌细胞数,显示其诱导产生Th1型免疫应答的能力。在479份奶牛外周血样本的γ-干扰素释放试验中,ESAT6-CFP10蛋白与PPD作为刺激原的阳性符合率为70.0%,阴性符合率为95.2%。本研究成功表达ESAT6-CFP10融合蛋白,其具备诱导Th1型免疫应答特性,在牛结核外周血γ-干扰素释放试验中可作为候选刺激抗原。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 esat6 cfp10 细胞免疫 牛结核病 刺激原

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结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因稳定表达细胞系的建立 被引量：3

14

作者 张海 薛莹 +5 位作者 姜泓 高雪 师长宏 柏银兰 王丽梅 徐志凯 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第10期892-894,共3页

目的筛选并建立稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为结核杆菌DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型。方法以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切pGEM610获得esat6-cfp10融合基因,克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴... 目的筛选并建立稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为结核杆菌DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型。方法以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切pGEM610获得esat6-cfp10融合基因,克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞,多轮筛选过后分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pCDNA610,RT-PCR结果证明esat6-cfp10融合基因已稳定整合在转染P815细胞染色体上,间接免疫荧光检测后表达有ESAT6-CFP10蛋白的阳性细胞着染。结论获得了稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为今后在小鼠体内检测结核杆菌DNA疫苗激发的CTL反应奠定了基础。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 esat6 cfp10 稳定表达

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复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核辅助诊断中的价值 被引量：9

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作者 陈翠翠 叶娟 +3 位作者 赵俊伟 张舒林 孙战强 汤兵祥 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2014年第2期211-214,共4页

目的:评价结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核诊断中的应用价值。方法:选取初治肺结核病患者70例和健康体检者34例作为结核组和健康对照组,分离PBMCs,分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10... 目的:评价结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核诊断中的应用价值。方法:选取初治肺结核病患者70例和健康体检者34例作为结核组和健康对照组,分离PBMCs,分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库作为抗原进行ELISPOT实验,检测斑点形成细胞数。结果:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库检测结核分枝杆菌感染的阳性率依次为85.7%(60/70)、77.1%(54/70)、72.9%(51/70),特异性依次为82.4%(28/34)、85.3%(29/34)、88.2%(30/34)。结论:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315作为抗原建立的ELISPOT检测方法在活动性肺结核的辅助诊断中有较高的应用价值。 展开更多

关键词 肺结核 结核分枝杆菌 esat-6 cfp-10 Rv0315

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结核分枝杆菌ESAT6、CFP10基因DNA疫苗对小鼠免疫原性的初步研究 被引量：4

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作者 王慧勤 李跃峰 +6 位作者 李志强 温书香 陈鹏博 赵庆亮 纪太旺 曹旭东 陈创夫 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期458-463,共6页

目的研究ESAT6、CFP10基因DNA疫苗分别与卡介苗联合免疫小鼠,以诱导免疫效果。方法以构建的真核表达载体pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10与卡介苗共同免疫随机分成8组的80只小鼠,分别标记为:生理盐水组(SLYS)、卡介苗组(KJM)、pEGFP-N1... 目的研究ESAT6、CFP10基因DNA疫苗分别与卡介苗联合免疫小鼠,以诱导免疫效果。方法以构建的真核表达载体pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10与卡介苗共同免疫随机分成8组的80只小鼠,分别标记为:生理盐水组(SLYS)、卡介苗组(KJM)、pEGFP-N1组(P-N1)、pEGFP-N1-ESAT6组(P-N1-E)、pEGFP-N1-CFP10组(P-N1-C)、卡介苗加pEGFP-N1组(K+P-N1)、卡介苗加pEGFP-N1-ESAT6组(K+P-N1-E)和卡介苗加pEGFP-N1-CFP10组(K+P-N1-C)。每只小鼠皮内注射100μL卡介苗,每只小鼠肌肉注射50μg质粒,每组共注射3次。以纯化的ESAT6、CFP10蛋白作为抗原,用DOT-ELISA方法检测小鼠血清中的抗体;用ELISA方法检测小鼠血清中IFN-γ的变化。结果免疫3次后的小鼠血清中检测到针对CFP10蛋白的抗体,未检测到针对ESAT6蛋白的抗体。但二者血清中IFN-γ水平都有显著上升,K+P-N1-C和K+P-N1-E免疫3次后,测得的IFN-γ平均含量为(107.591±7.3281)pg/mL和(95.7503±9.0184)pg/mL,显著高于免前、一免、二免(P<0.01)。结论结核分枝杆菌ESAT6,CFP10基因DNA疫苗和卡介苗联合应用后可诱导小鼠产生有效的细胞免疫应答,为DNA疫苗的研究奠定一定的基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 esat6 cfp10 DNA疫苗 卡介苗

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牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的克隆与序列分析 被引量：4

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作者 雷剑明 谢芝勋 +4 位作者 谢志勤 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢丽基 《广西农业科学》 CAS CSCD 2009年第9期1229-1233,共5页

根据GenBank上牛分枝杆菌(M.bovis)CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定... 根据GenBank上牛分枝杆菌(M.bovis)CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定及分析,结果显示,可以从广西分离株MBT359扩增出大小与预期相符的基因片段,经测序证实,扩增出的片段即为3个目的基因片段。序列分析表明,广西分离株MBT359的CFP-10、ESAT-6、MPB70基因片段与国际标准强毒株AF2122/97相应基因核苷酸同源性为100%。该研究结果为广西牛分枝杆菌流行株主要基因测序、建立广西牛结核病流行株遗传多态性数据库奠定了基础。 展开更多

关键词 牛分枝杆菌 cfp-10 esat-6 MPB70 克隆 序列分析

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牛分枝杆菌ESAT-6-CFP-10融合基因重组腺病毒载体的构建及表达 被引量：3

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作者 房红莹 鲁俊鹏 +4 位作者 曾小娜 王雷 陈钜豪 刘健 罗满林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期159-164,共6页

目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延... 目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到融合基因。将融合基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-CFP-10,限制性内切酶消化、菌液PCR、序列分析验证无误后,PmeⅠ酶切,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-ESAT-6-CFP-10。PacI酶切线性化的重组质粒pAd-CMV-ES-AT-6-CFP-10转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。PCR、Western blot检测包装病毒的融合基因及其表达情况。结果成功构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,包装病毒用PCR、Western blot检测到包装病毒的融合基因及其表达。结论本研究成功地构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒,为下一步在动物体内进行免疫效果研究打下基础。 展开更多

关键词 牛分枝杆菌 esat-6 cfp-10 重组腺病毒载体

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基于结核菌素与CFP10/ESAT6的牛IFN-γ检测法在牛结核病诊断中的比较研究 被引量：7

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作者 陈颖钰 邓铨涛 +4 位作者 郭爱珍 晁彦杰 匡有吉 于清龙 陈焕春 《中国奶牛》 2008年第6期12-14,共3页

本研究通过比较三种刺激物(牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原CFP10/ESAT6对结核菌素皮内变态反应阳性牛的IFN-γ刺激反应,探讨IFN-γ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集22头结核菌素皮内变态反应阳性牛的血液... 本研究通过比较三种刺激物(牛结核菌素、禽结核菌素和牛型结核菌特异性抗原CFP10/ESAT6对结核菌素皮内变态反应阳性牛的IFN-γ刺激反应,探讨IFN-γ检测法在我国牛结核病诊断中的应用前景。无菌采集22头结核菌素皮内变态反应阳性牛的血液,肝素抗凝。每1mL全血与1mLRPMI1640完全培养基混合均匀,并加入0.1mL(20μg)PHA(阳性对照孔)、0.1mL(20μg PHA)CFP10/ESAT6融合蛋白、0.1mL(2000U)牛结核菌素(PPD/B)、0.1mL(2500U)禽结核菌素(PPD/A)或等量PBS(无刺激阴性对照),37℃培养过夜。次日用夹心ELISA法检测各刺激组0.1mL培养上清的IFN-γ,以OD630表示IFN-γ浓度。结果,特异性抗原CFP10/ESAT6刺激组与牛结核菌素(PPD/B)刺激组的IFN-γ反应具有良好的相关性,相关系数为0.84。但CFP10/ESAT6刺激组IFN-γ浓度与牛和禽PPD的比较反应(以两刺激组IFN-γ浓度差值表示)间无相关性,相关系数为-0.11。分析禽PPD组的IFN-γ反应,发现实验牛中有少数牛对禽PPD有反应。以OD630=0.17为阳性反应切割值,牛PPD检出阳性牛21头,CFP10/ESAT6检出20头,牛和禽PPD比较反应(以OD值差值表示)检出14头,禽PPD阳性反应3头。扣除禽PPD阳性反应牛后,牛和禽PPD比较反应与牛PPD刺激组的相关系数增至0.54。结果表明,牛PPD的IFN-γ释放反应检测灵敏度最高。当出现牛型结核菌与环境分枝杆菌混合感染时,应用牛和禽PPD比较反应检测牛结核的准确度低,混合感染牛被误判为结核阴性牛。而基于CFP10/ESAT6的IFN-γ释放反应不受环境分枝杆菌的影响,检测具有良好的特异性与敏感性。 展开更多

关键词 牛结核 IFN—γ 牛结核菌素 cfp10 esat6 禽结核菌素

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结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的克隆表达及纯化 被引量：2

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作者 张海 师长宏 +5 位作者 范雄林 薛莹 柏银兰 姜泓 高雪 徐志凯 《科学技术与工程》 2005年第1期19-22,共4页

获得esat6-cfp10重组蛋白,为研究其在结核病诊断和预防中的作用奠定一定基础。以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-7ZF(+)克隆载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的克隆载体pGEM-e6c10。酶... 获得esat6-cfp10重组蛋白,为研究其在结核病诊断和预防中的作用奠定一定基础。以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-7ZF(+)克隆载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的克隆载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pPROEXTM HTb原核表达载体,经IPTG诱导后,可表达出分子量约28 kD的esat6-cfp10融合蛋白,重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的esat6-cfp10融合蛋白。Western blot证明表达重组蛋白有较好的免疫原性。 展开更多

关键词 esat6 cfp10 融合基因 表达 结核分枝杆菌

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