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枸杞内生嗜线虫镰刀菌NQ8GII4效应蛋白FnE14152的克隆及其原核表达
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作者 郭苗苗 闫思远 +1 位作者 张强强 顾沛雯 《核农学报》 北大核心 2025年第9期1896-1905,共10页
为探究枸杞内生嗜线虫镰刀菌NQ8GII4(Fusarium nematophilum)分泌的效应蛋白FnE14152的功能,本研究分析了该蛋白的结构特征,利用逆转录PCR(RT-PCR)法克隆了NQ8GⅡ4菌株效应蛋白编码基因FnE14152,并将该编码基因构建到pET30a载体中,重组... 为探究枸杞内生嗜线虫镰刀菌NQ8GII4(Fusarium nematophilum)分泌的效应蛋白FnE14152的功能,本研究分析了该蛋白的结构特征,利用逆转录PCR(RT-PCR)法克隆了NQ8GⅡ4菌株效应蛋白编码基因FnE14152,并将该编码基因构建到pET30a载体中,重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)表达菌株。采用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同诱导时间及温度下诱导表达重组蛋白,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测上清及沉淀中蛋白的表达。通过镍柱亲和层析法纯化蛋白并进行蛋白质免疫印迹(Western blot)鉴定,进一步将纯化的目的蛋白注射到烟草叶片中。生物信息分析结果表明,该基因编码274个氨基酸,分子量为29.04 kD,等电点为4.58,平均亲水值为-0.043,是偏亲水蛋白质,推测为糖苷水解酶16家族(glycoside hydrolase 16,GH16)转糖基化酶。成功克隆得到长度为774 bp的去信号肽效应蛋白FnE14152基因,将该基因构建到原核表达载体pET30a-14152^(ΔSP),经0.2 mmol·L^(-1)IPTG诱导得到重组蛋白pET30a-14152^(ΔSP);在20℃条件下培养13 h时,上清中的蛋白表达量最高,灰度分析结果极显著。生测试验结果表明重组蛋白注射4 d后可以诱发烟草叶片组织产生细胞坏死反应。本研究获得了枸杞内生嗜线虫镰刀菌NQ8GⅡ4效应蛋白FnE14152,为进一步明确内生真菌效应蛋白诱发植物的免疫机制奠定了基础。 展开更多
关键词 枸杞内生嗜线虫镰刀菌 效应蛋白FnE14152 原核表达 条件优化 细胞坏死反应
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枸杞内生嗜线虫镰刀菌对灵武长枣采后致腐真菌的抑制作用 被引量:3
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作者 张强强 任苗苗 顾沛雯 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2022年第12期137-145,154,共10页
【目的】研究枸杞内生嗜线虫镰刀菌(Fusarium nematophilum)NQ8GⅡ4对灵武长枣致腐真菌的抑制作用和保鲜效果,为灵武长枣采后保鲜提供参考。【方法】以灵武长枣采后优势致腐真菌交链格孢(Alternaria alternata)和灰葡萄孢(Botrytis cine... 【目的】研究枸杞内生嗜线虫镰刀菌(Fusarium nematophilum)NQ8GⅡ4对灵武长枣致腐真菌的抑制作用和保鲜效果,为灵武长枣采后保鲜提供参考。【方法】以灵武长枣采后优势致腐真菌交链格孢(Alternaria alternata)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)为靶标菌,采用皿内对峙试验,设同时接种NQ8GⅡ4和靶标菌、接种NQ8GⅡ44 d后再接种靶标菌和接种靶标菌4 d后再接种NQ8GⅡ43个处理,测定NQ8GⅡ4的抑菌率;采用盖玻片对峙法培养NQ8GⅡ4和靶标菌,显微观察NQ8GⅡ4对靶标菌的拮抗作用。制备NQ8GⅡ4培养液,检测其对靶标菌丝生长(培养液体积分数为10%,15%,20%,25%,30%和40%)和孢子萌发(培养液体积分数10%,20%,30%,40%和50%)的抑制作用。采用皿内对峙法测定NQ8GⅡ4对米根霉(Rhizopus oryzae)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)和球派伦霉(Peyronellaea glomerata)的抑菌广谱性。采用平板对扣法测定NQ8GⅡ4挥发物质对靶标菌丝生长的抑制作用。将灵武长枣用NQ8GⅡ4培养液体积分数分别为10%,20%,30%,40%和50%的液体浸泡1 min后晾干,15℃冷藏,以无菌水浸泡处理为对照,每隔5 d观察腐烂情况并统计腐烂率,分析NQ8GⅡ4培养液对灵武长枣的保鲜作用。【结果】接种NQ8GⅡ44 d后再接种靶标菌处理的抑菌效果显著高于其他2个处理,该处理对交链格孢和灰葡萄孢的抑菌率分别达71.25%和68.75%。光学显微观察发现,菌株NQ8GⅡ4可使病原真菌菌丝出现畸形、干瘪和崩解等现象。菌株NQ8GⅡ4培养液对交链格孢和灰葡萄孢的菌丝抑制率分别为71.25%和62.00%;菌株NQ8GⅡ4培养液体积分数为50%时,对交链格孢和灰葡萄孢的分生孢子萌发抑制率分别达92.81%和88.72%。NQ8GⅡ4挥发物质对交链格孢和灰葡萄孢的抑菌率分别达94.34%和95.95%。菌株NQ8GⅡ4对出芽短梗霉、球派伦霉和米根霉抑制率分别达87.91%,75.42%和30.95%。在15℃贮藏条件下,体积分数20%的NQ8GⅡ4培养液处理30 d后,灵武长枣的腐烂率较对照处理下降了77.09%,货架期延长了15~30 d。【结论】枸杞内生嗜线虫镰刀菌NQ8GⅡ4是极具应用前景的果蔬保鲜剂出发菌种。 展开更多
关键词 枸杞内生真菌 嗜线虫镰刀菌 灵武长枣 致腐病原真菌
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