鸭瘟病毒强毒株与弱毒株双重PCR鉴别检测方法的建立与应用

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作者 周婉婷 崔雪志 +9 位作者 毛秋艳 汪建华 李玉峰 李金平 刘朔 彭程 杨吉喆 侯广宇 刘华雷 蒋文明 《中国动物检疫》 2025年第8期108-114,共7页

鸭瘟是一种由鸭瘟病毒引起的急性、热性、高度接触性传染病,对养鸭业造成了严重威胁。目前,该病主要依靠鸭瘟弱毒活疫苗进行防控。鸭瘟病毒属于疱疹病毒科,其基因组为双链DNA,具有复杂的结构和多种变异类型。为建立一种能够区分鸭瘟病... 鸭瘟是一种由鸭瘟病毒引起的急性、热性、高度接触性传染病,对养鸭业造成了严重威胁。目前,该病主要依靠鸭瘟弱毒活疫苗进行防控。鸭瘟病毒属于疱疹病毒科,其基因组为双链DNA,具有复杂的结构和多种变异类型。为建立一种能够区分鸭瘟病毒强毒株与弱毒株的双重PCR鉴别检测方法,以提高临床诊断的准确性和效率,通过分析鸭瘟病毒基因组序列,设计针对UL2和LORF5基因的特异性引物,建立了双重PCR方法。该方法具有良好的特异性,能够准确区分鸭瘟病毒强毒株与弱毒株,同时对其他禽类病原无交叉反应:最低可检测到10拷贝的鸭瘟病毒DNA,表现出较高的灵敏度。使用建立的方法对2019-2024年收集的临床疑似鸭瘟病料进行检测,发现经典强毒株集中流行于2019-2022年,而变异强毒株在2023-2024年更为常见,表明鸭瘟病毒优势流行株可能正在发生变化。综上,本研究建立的双重PCR鉴别检测方法为鸭瘟病毒的快速、准确检测提供了技术支持,对鸭瘟防控及流行病学调查具有重要意义。 展开更多

关键词 鸭瘟病毒 UL2基因 LORF5基因 双重pcr 强毒株 变异株

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鹅星状病毒Ⅰ型与Ⅱ型双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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作者 姚展杏 王超 +6 位作者 林寅盛 赵丹 张嘉家 伍辉吉 朱婉君 张济培 陈济铛 《中国家禽》 北大核心 2025年第1期64-70,共7页

为建立一种快速检测鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)Ⅰ型(GAstV-1)与Ⅱ型(GAstV-2)的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR检测方法,试验根据GAstV-1的ORF1a特异保守序列与GAstV-2的ORF2特异保守序列分别设计1对引物,将PCR扩增的两个片... 为建立一种快速检测鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)Ⅰ型(GAstV-1)与Ⅱ型(GAstV-2)的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR检测方法,试验根据GAstV-1的ORF1a特异保守序列与GAstV-2的ORF2特异保守序列分别设计1对引物,将PCR扩增的两个片段分别克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒作为阳性质粒标准品,建立检测并鉴别GAstV-1与GAstV-2的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行评估,并运用该方法对28份疑似痛风雏鹅临床样品进行检测。结果显示:建立的SYBR GreenⅠ双重实时荧光定量PCR方法检测GAstV-1、GAstV-2的标准曲线相关系数均在0.99以上,批间、批内重复变异系数均小于0.7%,最低检测限度均为10 copies/μL;该方法对鸭肝炎病毒、禽流感病毒、鹅细小病毒均无特异性扩增,同时检测GAstV-1与GAstV-2未出现交叉反应;该方法检测28份临床样品的GAstV阳性率为92.8%,其中GAstV-1和GAstV-2均为阳性的有6份,仅GAstV-2阳性的有18份,仅GAstV-1阳性的有2份。研究表明,建立的荧光定量PCR检测方法可用于GAstV-1与GAstV-2的鉴别检测,并且当前引发GAstV感染的主要病原依然是GAstV-2,GAstV-1和GAstV-2混合感染情况也同时存在。 展开更多

关键词 鹅星状病毒 GAstV-1 GAstV-2 双重荧光定量pcr 雏鹅 痛风

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猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30毒株鉴别诊断荧光RT-PCR检测方法的建立

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作者 覃国喜 米树运 +3 位作者 孙竹筠 刘德清 罗婷婷 熊炜 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期84-90,共7页

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的危害生猪养殖业的重要传染病之一。NADC30毒株是PRRSV的一种新毒株,其Nsp2存在131个不连续氨基酸缺失。该毒株在临床流行中致病力不同,且常规PRRSV疫苗免疫无法有效预... 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的危害生猪养殖业的重要传染病之一。NADC30毒株是PRRSV的一种新毒株,其Nsp2存在131个不连续氨基酸缺失。该毒株在临床流行中致病力不同,且常规PRRSV疫苗免疫无法有效预防其感染,给养殖企业防控PRRSV带来困难。本研究基于TaqMan探针技术,针对经典型PRRSV保守基因序列及PRRSV NADC30缺失区域保守序列,设计不同荧光标记探针,建立双重实时荧光RT-PCR鉴别方法,可区分经典型PRRSV与PRRSV NADC30毒株。结果表明,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可快速区分经典型PRRSV毒株与PRRSV NADC30毒株,对PRRSV经典型疫苗毒株及临床NADC30毒株样本检测效果良好,适用于猪场临床样品中PRRSV NADC30毒株的快速鉴别诊断。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 NDAC30毒株 双重实时荧光RT-pcr

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传染性造血器官坏死病毒和传染性胰脏坏死病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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作者 张文 徐立蒲 +7 位作者 吕晓楠 潘勇 王小亮 曹欢 王静波 王姝 阴鸿达 王澎 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期494-500,共7页

为建立一种快速、高效、敏感的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的双重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参照世界动物卫生组织(WOAH)最新推荐的IHNV RT-qPCR方法,根据IHNV N基因合成1对特异性引物和1条经... 为建立一种快速、高效、敏感的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的双重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参照世界动物卫生组织(WOAH)最新推荐的IHNV RT-qPCR方法,根据IHNV N基因合成1对特异性引物和1条经FAM标记的Taq Man探针;根据本研究室建立的6种基因型IPNV(VP2基因)RT-qPCR方法合成1对特异性引物和1条经VIC标记的Taq Man探针。经优化各反应条件,初步建立了IHNV的和IPNV双重RT-qPCR检测方法。分别以IHNV、IPNV、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的cDNA以及病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)的重组质粒作为模板,采用本研究建立的双重RT-qPCR检测,评估该方法的特异性;以终浓度分别为1.0×10^(1)拷贝/μL~1.0×10^(9)拷贝/μL pIHNV和p IPNV质粒标准品的混合物作为模板,采用建立的双重RT-qPCR方法扩增,评估该方法的敏感性;以3个不同终浓度的质粒标准品混合物作为模板,采用本研究建立的双重RT-qPCR分别于同一时间和不同时间检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增IHNV和IPNV及二者的质粒标准品混合物,其他相关水生动物病毒均无扩增曲线,特异性较强;对pIHNV和pIPNV质粒标准品的检测限均为1.25拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。将本实验室保存的45份虹鳟组织上清液传1~2代后,取出现典型CPE的细胞培养物,采用本实验建立的双重RT-qPCR方法和国标中的IHNV RT-PCR及已报道的IPNV RT-PCR方法同时检测。结果显示,3种方法均检出35份阳性样品,其中,IHNV的阳性检出率均为33.3%(15/45),IPNV的阳性检出率均为44.4%(20/45),3种方法的符合率均达100%。本研究首次建立了同时鉴别检测IHNV和IPNV的双重RT-qPCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好,可为IHNV和IPNV的鉴别检测及流行病学调查提供新的技术手段。 展开更多

关键词 传染性造血器官坏死病毒 传染性胰脏坏死病毒 双重荧光定量RT-pcr

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猪圆环病毒2型和弓形虫双重TaqMan荧光定量PCR法的建立及应用

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作者 王海燕 仇德洋 +5 位作者 蔺雅婷 杜建才 姚方方 吕延飞 刘洋 郑佳 《中国动物检疫》 2025年第6期92-98,共7页

猪圆环病毒2型(PCV2)感染和弓形虫病(toxoplasmosis)在临床症状上具有一定的相似性因而难以准确辨别。为建立可同时鉴别PCV2和弓形虫(Toxoplasma gondii,Tox)的检测方法,针对PCV2 ORF2和Tox基因组529重复序列(Rep G529)设计特异性引物和... 猪圆环病毒2型(PCV2)感染和弓形虫病(toxoplasmosis)在临床症状上具有一定的相似性因而难以准确辨别。为建立可同时鉴别PCV2和弓形虫(Toxoplasma gondii,Tox)的检测方法,针对PCV2 ORF2和Tox基因组529重复序列(Rep G529)设计特异性引物和Taq Man探针,经过优化引物、探针浓度和反应条件,建立了同时检测这两种病原的双重Taq Man荧光定量PCR方法。该方法仅特异性扩增PCV2和Tox,与其他病原无交叉反应,特异性强;对PCV2质粒标准品的最低检测限为1.21×10~1 copies/μL,对Tox质粒的最低检测限为1.17×10~1 copies/μL,具有较高的敏感性;组内和组间变异系数均小于5%,具有良好的重复性。应用本试验建立方法和国标荧光定量PCR方法同时检测187份血清、脾脏临床样品,结果PCV2和Tox的阳性符合率分别为93.33%和100%。该方法的建立为PCV2和Tox的批量、快速和特异性鉴别检测提供了技术支撑。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 弓形虫 双重荧光定量pcr

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基于非洲猪瘟病毒B646 L和I177L基因双重实时荧光定量PCR鉴别ASFV-G-ΔI177 L疫苗株的检测方法

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作者 郭瑞 韩小改 +2 位作者 娄亚坤 杨楠 任宝红 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第12期52-57,共6页

为建立一种可鉴别非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株与ASFV-G-ΔI177L(I177L基因缺失株)疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法,本试验针对非洲猪瘟病毒B646L与I177L两种基因保守性高的区域,分别设计了引物和探针,通过引物、探针最佳工作浓度筛选和... 为建立一种可鉴别非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株与ASFV-G-ΔI177L(I177L基因缺失株)疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法,本试验针对非洲猪瘟病毒B646L与I177L两种基因保守性高的区域,分别设计了引物和探针,通过引物、探针最佳工作浓度筛选和退火温度优化,建立了一种双重实时荧光定量PCR核酸检测方法,并验证该方法的敏感性、特异性、重复性。结果显示,该检测方法建立的标准曲线线性关系良好,R2均>0.99;对pUC57-B646L和pUC57-I177L质粒标准品最低检出限均为10 copies/μL;与其他常见猪病病原无交叉反应,特异性强;批内变异系数为0.11%~1.39%,批间变异系数为0.21%~0.96%,均小于1.4%,重复性和稳定性良好。结果表明,本试验成功建立了一种性能良好的非洲猪瘟病毒B646L与I177L基因双重实时荧光定量PCR核酸检测方法,可为临床上非洲猪瘟病毒野毒株和ASFV-G-ΔI177L疫苗株的检测和鉴别提供技术支撑。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) B646L基因 I177L基因 双重实时荧光定量pcr

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双重抑制PCR技术分离鹅微卫星标记 被引量：13

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作者 杜文兴 虞德兵 +3 位作者 刘红林 练春兰 候水生 王林云 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期63-67,共5页

用双重抑制PCR技术分离11对鹅的特异微卫星引物,应用于浙东白鹅和太湖鹅的基因组PCR扩增。结果表明:11对引物在浙东白鹅和太湖鹅中分别扩增出37和36个清晰条带,20个等位基因为两品种所共有,11对引物中有5对呈中等多态、6对呈高度多态。... 用双重抑制PCR技术分离11对鹅的特异微卫星引物,应用于浙东白鹅和太湖鹅的基因组PCR扩增。结果表明:11对引物在浙东白鹅和太湖鹅中分别扩增出37和36个清晰条带,20个等位基因为两品种所共有,11对引物中有5对呈中等多态、6对呈高度多态。各位点产生2～6个等位基因,各位点的平均杂合度为0.456～0.772,以G07位点为最高,G06位点为最低;平均多态信息为0.375～0.737,以G07位点为最高,G01、G03和G11位点为最低。浙东白鹅和太湖鹅有效等位基因数分别为2.655和2.558,与实际测得的两品种平均值3.364和3.273较接近。研究结果表明,两品种的等位基因分布较为均匀,与鹅的实际品种特征一致,因此,双重抑制PCR技术适合于鹅的基因组结构研究。 展开更多

关键词 双重抑制pcr技术 微卫星标记 鹅

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一种基于磁性纳米粒子PCR的高通量SNP分型方法 被引量：7

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作者 刘洪娜 李松 +2 位作者 王志飞 何农跃 贺全国 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2007年第6期1035-1038,共4页

利用磁性纳米粒子PCR扩增(MNPs-PCR)和等位基因特异性双色荧光探针(Cy3,Cy5)杂交,建立了一种单核苷酸多态性(SNP)分型的新方法.应用该方法对9个样本MTHFR基因的C677T多态进行检测,野生和突变型样本正错配信号比大于9·0,杂合型正错... 利用磁性纳米粒子PCR扩增(MNPs-PCR)和等位基因特异性双色荧光探针(Cy3,Cy5)杂交,建立了一种单核苷酸多态性(SNP)分型的新方法.应用该方法对9个样本MTHFR基因的C677T多态进行检测,野生和突变型样本正错配信号比大于9·0,杂合型正错配信号比接近1·0,分型结果经测序验证.此方法无须产物纯化、浓缩,扫描分型结果快速、直观,是一种操作简单、快速、高通量、高灵敏度的分型方法. 展开更多

关键词 磁性纳米粒子 pcr 双色荧光杂交 SNP分型

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猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒的研制 被引量：4

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作者 余波 谭诗文 +3 位作者 冉懋韬 徐景峨 史开志 杨丽娟 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期152-154,180,共4页

根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7 N基因、猪乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、特异性结... 根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7 N基因、猪乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、特异性结果显示,该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV 0.2 ng/L、JEV 0.4 ng/L,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明,该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪乙型脑炎病毒 双重一步法RT—pcr

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双重RT-PCR同时检测兰花两种主要病毒的研究 被引量：2

10

作者 张妙彬 潘丽晶 +1 位作者 肖杨 杨玉环 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期166-167,180,共3页

以利用Trizol试剂盒提取的蝴蝶兰组培苗叶片总RNA为模板,根据已报道的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglussm ringspot virus,ORSV)外壳蛋白基因(cp)的保守序列设计特异性引物,探索RT-PCR反应条件,建... 以利用Trizol试剂盒提取的蝴蝶兰组培苗叶片总RNA为模板,根据已报道的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglussm ringspot virus,ORSV)外壳蛋白基因(cp)的保守序列设计特异性引物,探索RT-PCR反应条件,建立了可同时检测CyMV和ORSV的双重RT-PCR体系。 展开更多

关键词 兰花 双重RT-pcr 建兰花叶病毒 齿兰环斑病毒 检测

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豇豆花叶病毒和黑眼豇豆花叶病毒RT-Realtime PCR及IC-RT-Realtime PCR检测方法研究 被引量：3

11

作者 李彬 粟寒 +3 位作者 李艳华 缪爱斌 吴翠萍 安榆林 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期105-109,共5页

建立了豇豆两种种传病毒豇豆花叶病毒(CPMV)和黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)RT-Realtime PCR检测方法以及双重RT-Realtime PCR检测方法。在此基础上,根据免疫学抗原抗体特异性吸附的特点,建立了CPMV和BlCMV免疫捕获反转录荧光定量(IC-RT-Real... 建立了豇豆两种种传病毒豇豆花叶病毒(CPMV)和黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)RT-Realtime PCR检测方法以及双重RT-Realtime PCR检测方法。在此基础上,根据免疫学抗原抗体特异性吸附的特点,建立了CPMV和BlCMV免疫捕获反转录荧光定量(IC-RT-Realtime)PCR检测方法以及双重IC-RT-Realtime PCR检测方法。该单重及双重IC-RT-Real-time PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点,适用于豆类种苗中对CPMV和BlCMV的检测。 展开更多

关键词 豇豆花叶病毒 黑眼豇豆花叶病毒 免疫捕获反转录实时荧光pcr 双重反转录实时荧光pcr

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猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立 被引量：3

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作者 谭飞 马士博 +6 位作者 王瑞翀 张希 姜艳平 崔文 孟柳 尹纪元 乔薪瑗 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2015年第10期28-30,共3页

本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术... 本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RT-PCR核酸检测技术,对某规模化猪场病料进行检测,结果表明,扩增出大小约311 bp和501 bp大小的特异性条带,为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。建立的CSFVPEDV双重RT-PCR核酸检测技术具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,该方法的建立为CSFV和PEDV的快速诊断、疫情监测及流行病学研究奠定了基础。 展开更多

关键词 双重RT-pcr 猪瘟 猪流行性腹泻

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二重PCR方法鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌 被引量：6

13

作者 彭小兵 李旭妮 +3 位作者 王楠 何宇 丁家波 蒋玉文 《中国兽药杂志》 2011年第3期20-22,共3页

用包含16S～23S rDNA间隔区和23S rDNA的部分序列作为气肿疽梭菌特异性标志,以α毒素部分序列作为腐败梭菌特异性标志,建立了鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌的二重PCR方法。结果显示:气肿疽梭菌C54-1株扩增出大小为509 bp的条带,腐败梭菌C55-... 用包含16S～23S rDNA间隔区和23S rDNA的部分序列作为气肿疽梭菌特异性标志,以α毒素部分序列作为腐败梭菌特异性标志,建立了鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌的二重PCR方法。结果显示:气肿疽梭菌C54-1株扩增出大小为509 bp的条带,腐败梭菌C55-1株、C55-16株均扩增出大小为148 bp的条带,均与预期吻合;而产气荚膜梭菌C57-1株、C59-37株,肉毒梭菌C62-4株,诺维梭菌C61-4株均未扩增出任何条带。扩增产物的测序结果进一步证实了本方法的特异性。菌株的生物学特性试验结果也符合相应气肿疽梭菌和腐败梭菌的特点。本研究所建立的二重PCR方法可用于气肿疽梭菌和腐败梭菌的快速鉴定。 展开更多

关键词 气肿疽梭菌 腐败梭菌 16S^23SrDNA 二重pcr

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沙门氏菌和大肠杆菌O_(157):H_7双重荧光PCR检测方法的研究 被引量：3

14

作者 许如苏 林彩华 +3 位作者 蔡颖 李辉 杨梓坚 陈冠武 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2008年第3期20-23,共4页

目的建立一种能同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的双重荧光PCR方法,应用于动物源性食品的快速检验。方法根据沙门氏菌invA基因和大肠杆菌O157:H7 RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应条件,建立可同时检测沙门氏菌和大肠... 目的建立一种能同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的双重荧光PCR方法,应用于动物源性食品的快速检验。方法根据沙门氏菌invA基因和大肠杆菌O157:H7 RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应条件,建立可同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的双重荧光PCR方法,应用于动物源性食品的检验,并与miniVIDAS快速初筛方法和SN标准方法进行比较。结果本研究建立的双重荧光PCR方法可同时快速检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7,对纯菌的检测灵敏度均低于10CFU/双重荧光PCR反应体系。应用本方法检测36株标准/参考菌株,结果只有9株目的菌标准/参考菌株出现特异性扩增,其余27株非目的菌均呈阴性反应。定量检测重复性试验结果,批内和批间的变异系数均小于2%。应用本方法检测人工染菌样品,结果与miniVIDAS和SN方法检测结果一致,但检测时间比miniVIDAS快了3倍,比SN标准快了10多倍。结论本研究建立的双重荧光PCR方法具有快速、灵敏、特异、重复性好的优点,可在8小时内完成样品沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的检验。 展开更多

关键词 沙门氏菌 大肠杆菌O157:H7 双重荧光pcr

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2种兰花主要病毒双重一步法RT-PCR检测的影响因素 被引量：3

15

作者 黎园 吴竹妍 +3 位作者 孙洁 孙辉 向梅梅 饶雪琴 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第5期1205-1206,共2页

兰花是花卉产业最重要的观赏植物之一[1],一旦感染上病毒,其观赏价值和经济价值将受到严重影响。近年来,随着兰花产业的迅速发展,兰花国际国内贸易和种质交流十分频繁,建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CyMV）和齿兰环斑病毒（Odon... 兰花是花卉产业最重要的观赏植物之一[1],一旦感染上病毒,其观赏价值和经济价值将受到严重影响。近年来,随着兰花产业的迅速发展,兰花国际国内贸易和种质交流十分频繁,建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CyMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）是严重影响兰花生产的2种主要病毒[2-3],有必要建立这两种病毒的高效检测方法。一些研究者对这2种病毒建立了双重RT-PCR检测方法[4-6],但对其检测体系的影响因素研究不多[5]。本试验对此进行了研究,旨在为兰花进出口贸易和安全生产奠定基础。 展开更多

关键词 建兰花叶病毒 齿兰环斑病毒 双重一步法RT-pcr

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发酵支原体、穿通支原体双重套式PCR检测研究 被引量：6

16

作者 糜祖煌 秦玲 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2000年第4期50-52,共3页

目的　应用双重套式 PCR技术同时检测发酵支原体 (Mf)和穿通支原体 (Mpe)。方法　以支原体 16 Sv RNA基因为靶基因 ,外套引物为 Mf 与 Mpe共用、内套引物则分别为 Mf 种特异和 Mpe种特异 ,建立双重套式扩增体系。结果　本双重套式 PCR... 目的　应用双重套式 PCR技术同时检测发酵支原体 (Mf)和穿通支原体 (Mpe)。方法　以支原体 16 Sv RNA基因为靶基因 ,外套引物为 Mf 与 Mpe共用、内套引物则分别为 Mf 种特异和 Mpe种特异 ,建立双重套式扩增体系。结果　本双重套式 PCR不仅能分别扩增 Mf 和 Mpe的特异性 DNA,并能同时扩增 Mf 和 Mpe出现二条特征性条带 ,产物经测序证实。结论　双重套式 PCR是一种灵敏、特异和快速的 Mf 和 展开更多

关键词 发酵支原体 穿通支原体 双重套式聚合酶链反应

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植物乳杆菌的DPO引物实时荧光PCR检测方法 被引量：1

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作者 孙凯 魏霜 +5 位作者 刘玉莉 许如苏 刘中勇 鄞杰平 袁俊杰 吴希阳 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期178-183,共6页

根据已报道的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的23S rRNA基因保守序列,设计用于检测植物乳杆菌的特异性DPO（dual priming oligonucleotide）引物,结合SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术,建立植物乳杆菌的DPO引物实时荧光PCR检测方法... 根据已报道的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的23S rRNA基因保守序列,设计用于检测植物乳杆菌的特异性DPO（dual priming oligonucleotide）引物,结合SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术,建立植物乳杆菌的DPO引物实时荧光PCR检测方法,对其特异性和灵敏度进行了评价,并将建立的检测方法用于实际样品的检测中。结果显示,该方法对2株植物乳杆菌能得到阳性扩增,其余11株乳酸菌及阴性对照没有扩增曲线,灵敏度高达0.001 ng/μL,而且在退火温度为50~60℃范围内不影响其特异性,表明该方法对退火温度不敏感;用微生物菌制剂和酸奶共13种益生菌产品进行了验证,检出情况与产品标识一致。因此,该研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR能够快速、准确、高效地检测微生物菌制剂及其他益生菌产品中的植物乳杆菌。 展开更多

关键词 植物乳杆菌 实时荧光pcr DPO引物 检测

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等位基因特异性引物和TaqMan-MGB探针双抑制野生等位基因扩增的实时荧光定量PCR检测JAK2V617F突变率 被引量：2

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作者 梁国威 邵冬华 +1 位作者 何美琳 曹清芸 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期1486-1491,共6页

本研究建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的荧光定量PCR检测方法并探讨其临床应用价值。在实时荧光定量PCR分析系统中,应用等位基因突变引物和等位基因野生TaqMan-MGB探针共同抑制JAK2V617F野生等位基因扩增,从而特异性... 本研究建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的荧光定量PCR检测方法并探讨其临床应用价值。在实时荧光定量PCR分析系统中,应用等位基因突变引物和等位基因野生TaqMan-MGB探针共同抑制JAK2V617F野生等位基因扩增,从而特异性地扩增JAK2V617F突变等位基因。通过测定不同JAK2V617F突变率标准品及其循环阈值(Ct值),建立JAK2V617F突变率定量测定方法,并对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测。结果表明,建立的方法定量检测JAK2V617F突变率的下限为0.1%,检测JAK2V617F突变率的批内、批间平均变异率分别为4.1%和6.1%。对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中2例为JAK2V617F阳性,突变率分别为0.64%和0.98%。结论:建立的JAK2V617F突变率定量检测方法具有检测灵敏度高和重复性好的特性,适合骨髓增殖性疾病的诊断及疾病进程和疗效监测。本方法检测原理可用于各种单碱基突变率的检测,具有广泛的应用前景。 展开更多

关键词 JAK2V617F突变 骨髓增殖性疾病 实时荧光定量pcr 等位基因特异性引物 TAQMAN-MGB探针 双抑 制扩增 野生等位基因

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食源性动物组织中CSFV和PRRSV双重双色荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：1

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作者 魏文康 吕殿红 +5 位作者 温肖会 罗胜军 黄忠 周秀蓉 贾春玲 袁洁 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期620-624,共5页

为建立同时检检测食源性动物组织中猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)的双色荧光定量RT-PCR方法。本研究根据SCFV和PRRSV基因序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应的体系和扩增条件,建立了能够检测食源... 为建立同时检检测食源性动物组织中猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)的双色荧光定量RT-PCR方法。本研究根据SCFV和PRRSV基因序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应的体系和扩增条件,建立了能够检测食源性动物组织中SCFV和PRRSV的双重双色荧光定量PCR的方法。其检测下限为1×102拷贝/μL,而且与其他一些猪病病毒无交叉反应,具有良好的特异性。该方法重复性和稳定性试验表明其组内和组间的变异系数最高分别为4.2和4.5。对比试验表明,该方法对CSFV和PRRSV检验的敏感性为常规RT-PCR方法的200倍;该方法的建立为食源性动物组织中CSFV和PRRSV提供了有效手段,该方法特异性和敏感性较好,能够应用于临床检测。 展开更多

关键词 食源性动物组织 猪瘟病毒 猪蓝耳病病毒 双重双色荧光定量pcr

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双重PCR检测黄秋葵储藏期间青霉和链格孢菌条件的优化

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作者 董彩文 汤久停 +1 位作者 王浩瑾 吴凯 《粮食与油脂》 北大核心 2019年第4期76-80,共5页

以黄秋葵为材料,分离纯化在贮藏过程中引起腐烂的主要病原真菌青霉和链格孢菌。根据基因库上的序列,针对青霉和链格孢菌在18SRNA的序列设计2对引物,建立了用于检测黄秋葵青霉和链格孢菌双重PCR检测方法,并对PCR扩增条件进行了优化,优化... 以黄秋葵为材料,分离纯化在贮藏过程中引起腐烂的主要病原真菌青霉和链格孢菌。根据基因库上的序列,针对青霉和链格孢菌在18SRNA的序列设计2对引物,建立了用于检测黄秋葵青霉和链格孢菌双重PCR检测方法,并对PCR扩增条件进行了优化,优化条件如下:引物Alt4、Alt5和Pen F'、Pen R的比例为2∶1、退火温度为52℃、Mg^(2+)浓度为2.5 mmol/L、d NTP浓度为0.08 mmol/L、循环数为35、延伸时间为50 s、退火时间为30 s。结果表明,该方法灵敏度较高、特异性强。该试验可以为黄秋葵在储藏期间的病害防治提供重要指导依据。 展开更多

关键词 黄秋葵 青霉 链格孢菌 双重pcr

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