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数字PCR技术在动物疫病检测中的应用
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作者 孟晓琴 赵淑娟 张晓霞 《中兽医医药杂志》 2025年第2期54-59,共6页
近年来,随着纳米技术和微流体技术的进步,数字PCR(dPCR)技术逐渐突破瓶颈,展现出快速发展的趋势。dPCR通过将反应体系分割为数万个微小独立反应单元,实现核酸模板的绝对定量分析,具有无需标准曲线、对抑制剂耐受性高、灵敏度高、特异性... 近年来,随着纳米技术和微流体技术的进步,数字PCR(dPCR)技术逐渐突破瓶颈,展现出快速发展的趋势。dPCR通过将反应体系分割为数万个微小独立反应单元,实现核酸模板的绝对定量分析,具有无需标准曲线、对抑制剂耐受性高、灵敏度高、特异性强、重复性好等显著优势。目前,dPCR在猪、牛、羊、禽等动物疫病检测中展现出应用潜力,能够检测早期感染或混合感染,支持流行病学研究,监测治疗效果,并实现病原体核酸浓度的绝对定量分析。然而,与qPCR相比,dPCR在寄生虫病检测中的灵敏度和准确性有待进一步提高。另外,高成本也在一定程度上限制了dPCR技术的大规模推广应用。随着技术的进一步发展和检测成本的降低,dPCR有望在临床诊断、流行病学研究和无症状携带病原动物的识别等领域发挥更重要的作用。 展开更多
关键词 数字pcr技术 动物疫病诊断 定量检测
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犬巴贝斯虫和犬埃立克体双重纳米PCR方法的建立及初步应用
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作者 梁谦学 朱正 +4 位作者 王博永 李连燕 吴文德 李恭贺 郑喜邦 《动物医学进展》 北大核心 2025年第4期90-95,共6页
旨在建立一种同时检测犬巴贝斯虫(Babesia canis)和犬埃立克体(Ehrlichia canis)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法。以疑似犬巴贝斯虫病和埃立克体病血样DNA为模板,用常规双重PCR和双重纳米PCR检测犬巴贝斯虫18S rRNA和犬埃立克体16S rRNA... 旨在建立一种同时检测犬巴贝斯虫(Babesia canis)和犬埃立克体(Ehrlichia canis)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法。以疑似犬巴贝斯虫病和埃立克体病血样DNA为模板,用常规双重PCR和双重纳米PCR检测犬巴贝斯虫18S rRNA和犬埃立克体16S rRNA,并对PCR的退火温度和引物浓度等参数进行了优化。结果显示,双重纳米PCR方法具有良好特异性和灵敏性,与其他4种犬常见病原体无交叉反应,对犬巴贝斯虫和犬埃立克体的最低核酸检测量分别为2.07×10^(3)和1.92×10^(3)copies/μL,其灵敏性比常规PCR高100倍。为了解南宁地区犬巴贝斯虫和犬埃立克体的流行情况,采用该方法对来自南宁市5家宠物医院的152份血清样品进行了检测。结果显示,犬巴贝斯虫和犬埃立克体感染率分别为2.63%和9.87%,混合感染率为1.32%。该双重纳米PCR方法为犬巴贝斯虫和埃立克体病早期快速诊断提供了新方法。 展开更多
关键词 双重纳米pcr 犬巴贝斯虫 犬埃立克体 病原检测
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承德无角山羊双重PCR性别鉴定方法的建立
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作者 麻金凤 赵敏军 +1 位作者 李俊杰 陶晨雨 《中国畜禽种业》 2025年第7期7-14,共8页
该试验通过选用山羊雄性性别决定基因SRY及内参基因GAPDH,结合NCBI序列库,使用Primer Premier 5.0软件和NCBI引物设计工具Primer-BLAST设计特异性引物,对20只承德无角山羊样品进行性别鉴定检测,以期建立承德无角山羊双重PCR性别鉴定方... 该试验通过选用山羊雄性性别决定基因SRY及内参基因GAPDH,结合NCBI序列库,使用Primer Premier 5.0软件和NCBI引物设计工具Primer-BLAST设计特异性引物,对20只承德无角山羊样品进行性别鉴定检测,以期建立承德无角山羊双重PCR性别鉴定方法。结果表明,所有样本的性别鉴定结果与记录完全吻合,准确率达100%。此双重PCR方法为承德无角山羊生产中早期性别鉴定提供了可靠的技术支持。 展开更多
关键词 双重pcr 性别鉴定 承德无角山羊 SRY基因
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禽流感病毒H7和N2亚型nano-dPCR检测方法的建立和应用 被引量:2
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作者 李丹 谢芝勋 +7 位作者 李孟 罗思思 张民秀 谢丽基 华俊 粟永春 翟国胜 黄娇玲 《山西农业科学》 2023年第6期709-715,共7页
为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法,从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列,采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物,通过对nano-dPCR反应条件进行... 为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法,从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列,采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物,通过对nano-dPCR反应条件进行优化确定最佳反应体系;利用优化好的反应体系开展nano-dPCR方法的特异性和敏感性试验;采集活禽市场家禽咽喉及泄殖腔拭子样品进行临床样品检测并进行验证。结果表明,成功建立了一种同时检测H7亚型(723 bp)和N2亚型(314 bp)AIV的nano-dPCR方法,该方法特异性良好,其他亚型禽流感病毒及常见禽类呼吸道病毒均未出现特异性的条带,H7亚型AIV和N2亚型AIV的最低核酸检测量分别达到了5×103、5×103拷贝/μL,其敏感性是普通双重PCR检测方法的10倍,其对临床样品检测结果准确率达到100%,可以用于禽流感临床样品鉴别诊断和日常防控监测。 展开更多
关键词 禽流感病毒 双重纳米pcr H7亚型 N2亚型
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产黄曲霉毒素真菌双重荧光定量PCR检测技术的建立与应用 被引量:1
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作者 陈冠果 李可 +7 位作者 陆金虎 金晨晨 王龑 帅江冰 鲍维琪 程昌勇 宋厚辉 张晓峰 《中国粮油学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期188-195,共8页
为实现产黄曲霉毒素真菌的快速检测,本研究建立了检测产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因的双重荧光定量PCR方法。分别针对aflR基因和nor-l基因保守序列,各设计2对特异性引物和探针,通过引物对间的有效性实验各筛选出1对最优的aflR... 为实现产黄曲霉毒素真菌的快速检测,本研究建立了检测产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因的双重荧光定量PCR方法。分别针对aflR基因和nor-l基因保守序列,各设计2对特异性引物和探针,通过引物对间的有效性实验各筛选出1对最优的aflR引物探针和nor-1引物探针,随后建立并优化双重荧光定量PCR的反应条件,构建标准曲线,测定该方法的重复性、灵敏度和特异性。结果显示,成功筛选出aflR-2和nor1-2 2组引物/探针组合,并优化和确定了引物/探针的最佳反应终浓度。特异性实验结果显示,本研究建立的检测方法仅对产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因呈现特异性扩增,对黑曲霉、碳黑曲霉、赭曲霉和镰刀菌等常见产毒真菌的核酸样品均无扩增曲线。建立的方法重复性好,批内和批间变异系数均<3%,双重反应体系的检测灵敏度均低至1×10^(2)copies/μL。利用本研究所建立的方法与ELISA试剂盒分别对80份食品样品进行检测,结果显示,双重荧光定量PCR共检测出9份阳性样品,而ELISA试剂盒只检测出了7份阳性,表明本研究建立的方法具有更高的灵敏度和准确性。 展开更多
关键词 产黄曲霉毒素真菌 双重荧光定量pcr 快速检测
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数字PCR技术的发展和应用 被引量:45
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作者 詹成 燕丽 +4 位作者 王琳 金玉麟 陈力 时雨 王群 《复旦学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期786-789,共4页
数字PCR(digital PCR,dPCR)技术作为一种全新的核酸检测方法,通过把反应体系均分到大量反应单元中独立地进行PCR,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸数量。目前dPCR主要分为微滴式和芯片式两种。与传统PCR技术相比,dPCR具有高灵敏度、... 数字PCR(digital PCR,dPCR)技术作为一种全新的核酸检测方法,通过把反应体系均分到大量反应单元中独立地进行PCR,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸数量。目前dPCR主要分为微滴式和芯片式两种。与传统PCR技术相比,dPCR具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点。因此,dPCR技术在近年来得到了迅速的发展,广泛地应用于稀有突变检测、拷贝数变异分析和复杂样本基因表达检测等方面。 展开更多
关键词 数字pcr 微滴式dpcr 芯片式dpcr 突变检测 拷贝数变异 基因表达
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双重PCR检测携带有tl和tdh基因的副溶血弧菌毒力菌株 被引量:14
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作者 吴彩云 蔡俊鹏 +4 位作者 杨汝德 陈清 罗立新 吴后波 俞守义 《水产科学》 CAS 北大核心 2004年第5期5-9,共5页
在常规PCR技术的基础上优化条件 ,建立并完善双重PCR技术 ,并通过检测阳性对照和待检样品 ,进一步确定其检测的可行性。结果表明在常规PCR方法中为阳性的样品 ,包括阳性对照以及待检样品 ,在双重PCR方法中也呈现阳性 ,为阴性的样品在本... 在常规PCR技术的基础上优化条件 ,建立并完善双重PCR技术 ,并通过检测阳性对照和待检样品 ,进一步确定其检测的可行性。结果表明在常规PCR方法中为阳性的样品 ,包括阳性对照以及待检样品 ,在双重PCR方法中也呈现阳性 ,为阴性的样品在本方法中则也呈现阴性 ;能在血平板中出现溶血圈的在本法中也被印证含有tdh基因。由此证实本方法确实能对tl和tdh两种基因同时进行检测 ,成功地证明了同时检测tl和tdh两种基因的双重PCR方法的可行性。该法不但具有常规PCR的优点 ,而且还能节省耗材和时间 。 展开更多
关键词 双重pcr 副溶血弧菌 不耐热溶血素 水产食品 毒力 菌株
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多重荧光PCR同时检测转基因成分35S和Nos方法的建立 被引量:33
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作者 刘光明 李庆阁 +4 位作者 王群力 梁基选 陈伟铃 栾国彦 苏文金 《厦门大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期493-497,共5页
根据商品化转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子 (Nos)的序列特点 ,设计并合成了两对引物和相对应的荧光双链探针 ,建立一种应用荧光双链探针的多重荧光PCR同时检测转基因成分 35S启动子和Nos终止子... 根据商品化转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子 (Nos)的序列特点 ,设计并合成了两对引物和相对应的荧光双链探针 ,建立一种应用荧光双链探针的多重荧光PCR同时检测转基因成分 35S启动子和Nos终止子的方法 .并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等 11份实物样品进行了检测 ,其中有 5份样品结果阳性 .结果表明所建立的多重荧光PCR方法能同时检测出 35S和Nos双组分 ,较常规PCR技术更为简便、快速、准确 ,有很好的应用前景 . 展开更多
关键词 多重荧光pcr 35S NOS 转基因作物 荧光双链探针 花椰菜花叶病毒启动子 极癌农杆菌终止子 检测方法
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PCR方法检测食品中的转基因成分35S和NOS的研究 被引量:14
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作者 刘光明 苏文金 +2 位作者 栾国彦 宋思扬 梁基选 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2002年第5期94-99,共6页
根据转基因农作物中最常用的花椰菜叶病毒启动子(CaMV35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列,设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针(FDCP),分别建立了常规PCR、应用FDCP的新型实时荧光PCR检测转基因成分35S启动子和NOS终... 根据转基因农作物中最常用的花椰菜叶病毒启动子(CaMV35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列,设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针(FDCP),分别建立了常规PCR、应用FDCP的新型实时荧光PCR检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法。利用该套方法对冷冻马铃薯条、大豆、冷冻玉米棒、甜椒、番茄等实物样品进行了检测,发现11份样品中有5份检出35S启动子、NOS终止子,6份样品结果为阴性。结果表明我们建立的两种PCR方法均能有效检测出35S和NOS片段,其中常规PCR方法具有灵敏度高、特异性好的特点;应用FDCP的新型实时荧光PCR方法则更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值。 展开更多
关键词 pcr方法 检测 食品 转基因成分 35S NOS 荧光双链探针
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牛冠状病毒和轮状病毒的双重RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:19
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作者 柳强 侯喜林 +2 位作者 车车 刘双翼 刘合义 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期701-704,共4页
为建立一种快速诊断牛病毒性腹泻疾病的方法,利用本研究室分离鉴定的牛冠状病毒(BCV)和牛轮状病毒(BRV)毒株,根据GenBank中登录的BCV、BRV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增BCV、BRV的引物,经过条件优化,建立了检测BCV、BRV... 为建立一种快速诊断牛病毒性腹泻疾病的方法,利用本研究室分离鉴定的牛冠状病毒(BCV)和牛轮状病毒(BRV)毒株,根据GenBank中登录的BCV、BRV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增BCV、BRV的引物,经过条件优化,建立了检测BCV、BRV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为244bp和382bp。该方法检测BCV和BRV的敏感度分别为1个和100个TCID50/100μL。应用这一方法能从病料中检测出这2种病毒。结果表明该双重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于这2种病毒性疾病的快速诊断。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 牛轮状病毒 双重pcr
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猪伪狂犬病病毒及猪细小病毒二联PCR检测方法的建立 被引量:6
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作者 郁宏伟 杨润德 +2 位作者 崔弈杰 秦彤 刘晓慧 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期216-219,共4页
根据猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)2种病原体的基因保守序列,分别设计并合成了与PRV的gp50基因序列和PPV的VP2基因互补的两对引物,进行单相PCR,分别扩增出预期的217bp片段及158bp片段;同时,用这两对引物对混合的样品中的PRV和PP... 根据猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)2种病原体的基因保守序列,分别设计并合成了与PRV的gp50基因序列和PPV的VP2基因互补的两对引物,进行单相PCR,分别扩增出预期的217bp片段及158bp片段;同时,用这两对引物对混合的样品中的PRV和PPV的DNA模板进行二联PCR扩增及二联PCR反应条件的优化,结果得到2条与试验设计相符的217bp(PRV)和158bp(PPV)特异性条带:敏感性检测结果表明,对PRV的检测可以达到10-6.11/20μLTCID50、对PPV的检测可以达到0.008HA单位的核酸模板。本文建立的PCR方法,可以在24h内对样品进行快速检测,可作为PRV、PPV感染和临床样品检测的可靠手段。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 猪细小病毒 二联pcr
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多重PCR方法检测食品中转基因成分 被引量:16
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作者 刘光明 苏文金 +3 位作者 梁基选 高榕 宋思扬 陈伟铃 《无锡轻工大学学报(食品与生物技术)》 CSCD 北大核心 2002年第4期379-383,共5页
根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 3 5S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列 ,设计合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针 (FDCP) ,分别建立了多重PCR、应用FDCP的实时荧光PCR同时检测转基因成分 3 5S启动子... 根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 3 5S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列 ,设计合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针 (FDCP) ,分别建立了多重PCR、应用FDCP的实时荧光PCR同时检测转基因成分 3 5S启动子和NOS终止子的方法 .并利用该套方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测 ,发现 1 3份样品中有 6份检出3 5S启动子、NOS终止子 ,其余 7份样品的检测结果为阴性 .表明作者建立的多重PCR方法能有效检测出 3 5S和NOS成分 ,其中多重PCR法具有灵敏度高、特异性好的特点 ,多重荧光PCR法则更为简便、快速。 展开更多
关键词 多重pcr方法 检测 食品 转基因成分
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PRV、PPV双重PCR检测方法的建立及其应用 被引量:11
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作者 曲光刚 沈志强 +3 位作者 管宇 王金良 唐娜 谢金文 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第11期22-23,共2页
为建立一种能够快速诊断猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的方法,根据GenBank上发表的PRV、PPV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增PRV、PPV的引物,经过条件优化后,建立检测PRV、PPV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为5... 为建立一种能够快速诊断猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的方法,根据GenBank上发表的PRV、PPV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增PRV、PPV的引物,经过条件优化后,建立检测PRV、PPV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为570bp、748bp。试验证明,该方法具有良好的特异性和敏感性,省时、省力、快速、敏感、高效的特点,为PRV与PPV的快速诊断试剂盒组装及流行病学的研究提供了技术支持。 展开更多
关键词 双重pcr 猪伪狂犬病毒 猪细小病毒
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PCV2和PCV3双重纳米PCR方法的建立及初步应用 被引量:6
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作者 梁琳 逄春华 +5 位作者 罗亚坤 周灵 王静 刘畅 刘琪 崔尚金 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第12期3440-3445,共6页
本研究旨在建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重纳米PCR(nanodPCR)方法,同时应用该方法对PCV2和PCV3进行检测。参考GenBank中登录的PCV2和PCV3型基因序列分别设计特异性引物,对nano-dPCR的反应条件进行优化... 本研究旨在建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重纳米PCR(nanodPCR)方法,同时应用该方法对PCV2和PCV3进行检测。参考GenBank中登录的PCV2和PCV3型基因序列分别设计特异性引物,对nano-dPCR的反应条件进行优化;同时考察所建立的nano-dPCR检测方法的特异性和敏感性。结果显示,所建方法的特异性和敏感性良好,对PCV2和PCV3两种病毒的最低核酸检测量分别为93.2和91.6拷贝/μL,其敏感性比普通PCR高100倍。应用该方法对送检的265份临床样本进行检测,结果显示,PCV2和PCV3在猪群中存在普遍感染,PCV3和PCV2的阳性率分别为16.6%和14.7%,混合感染阳性率为6.8%。临床样品的检测结果表明,本试验建立的nano-dPCR方法为PCV2和PCV3早期感染进行快速、敏感鉴别诊断提供了新方法。 展开更多
关键词 双重纳米pcr 猪圆环病毒2型(PCV2) 猪圆环病毒3型(PCV3) 病原检测
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双重PCR检测罗非鱼源无乳链球菌方法的建立 被引量:7
15
作者 樊海平 吴斌 +4 位作者 张新艳 邓志武 郑磊 钟全福 曾占壮 《福建农业学报》 CAS 2014年第1期8-11,共4页
根据罗非鱼源无乳链球菌16SrRNA基因和sip基因序列,设计、合成2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,建立快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。该方法扩增无乳链球菌可获得1 305bp和121bp 2个特异性片段;对6株链球菌属的菌株进行... 根据罗非鱼源无乳链球菌16SrRNA基因和sip基因序列,设计、合成2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,建立快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。该方法扩增无乳链球菌可获得1 305bp和121bp 2个特异性片段;对6株链球菌属的菌株进行特异性分析,仅无乳链球菌能扩增出16SrRNA基因和sip基因2条特异性条带,而海豚链球菌无条带检出;经灵敏度试验,可检测到无乳链球菌菌株070717LL的最小量为1.05×102 CFU;同时,双重PCR可以检测出无乳链球菌菌株070717LL人工感染的罗非鱼脾、脑、肾组织中细菌DNA,特别是脾脏和肾脏组织的样品检测效果好。结果证明所建立的方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对罗非鱼源无乳链球菌病的流行病学调查。 展开更多
关键词 无乳链球菌 16S RRNA基因 sip基因 罗非鱼
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产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立 被引量:10
16
作者 曲泽慧 陈佩佩 +6 位作者 张爱芹 郭东春 林欢 姜骞 刘家森 师东方 曲连东 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第7期65-68,共4页
为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314bp;最终确定dNTP终浓... 为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314bp;最终确定dNTP终浓度0.4mmol/L,K88、K99的引物终浓度均为25μmol/L,退火温度为52℃。试验结果表明,该方法具有良好的灵敏性和特异性。用所建立的双重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果显示,K88单重PCR阳性2株,K99单重PCR阳性3株,K88和K99双重PCR阳性5株。本研究建立的双重PCR检测方法为致幼畜腹泻产肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供了方法。 展开更多
关键词 产肠毒素大肠杆菌 双重pcr K88菌毛 K99菌毛
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快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立 被引量:15
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作者 李书光 李天芝 +2 位作者 李峰 胡琳琳 沈志强 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第7期43-46,共4页
本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类M蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双... 本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类M蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1μL(20pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。 展开更多
关键词 猪链球菌 马链球菌兽疫亚种 双重pcr
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鸡白痢与鸡伤寒沙门菌双重PCR方法的建立和初步应用 被引量:5
18
作者 朱春红 陶志云 +5 位作者 刘宏祥 徐文娟 章双杰 李非 唐燕飞 蒋莲华 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第8期74-76,共3页
分析不同血清型/生物型沙门菌全基因组序列筛选出鸡白痢和鸡伤寒沙门菌特异性基因组序列,设计两对引物,建立双重PCR方法鉴别检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌不同生物型,并进行初步的临床应用。双重PCR方法结果显示,鸡白痢沙门菌显示417 bp条带... 分析不同血清型/生物型沙门菌全基因组序列筛选出鸡白痢和鸡伤寒沙门菌特异性基因组序列,设计两对引物,建立双重PCR方法鉴别检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌不同生物型,并进行初步的临床应用。双重PCR方法结果显示,鸡白痢沙门菌显示417 bp条带,鸡伤寒沙门菌显示417 bp和636 bp两个条带,而阴性对照未出现条带,与预期设计相符。双重PCR体系对56株不同血清型沙门菌鉴定结果与细菌学分离的血清型鉴定结果完全一致,说明本试验建立的双重PCR体系特异性良好,应用上述方法检测鸡场疑似20份临床样本,结果发现8株鸡白痢沙门菌阳性,1株鸡伤寒沙门菌阳性。上述结果表明,已建立双重PCR方法特异性检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。本试验为鸡白痢和鸡伤寒不同生物型沙门菌的检测提供了一种简洁、敏感、特异的新方法。 展开更多
关键词 鸡白痢沙门菌 鸡伤寒沙门菌 检测 双重-pcr
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双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法 被引量:66
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作者 徐丽华 刘春雷 +4 位作者 常玉梅 梁利群 刘金亮 高国强 韩启霞 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期70-75,共6页
实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁... 实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁琐。阐述了一种改进的相对定量方法——双标准曲线法的试验原理和特点,描述了定量PCR体系的优化方式,探讨了试验误差分析方法及试验操作技巧,并就试验数据的处理方法进行讨论。试验证明,双标准曲线法是一种经济、简单而准确的定量方法。 展开更多
关键词 双标准曲线法 相对定量pcr 荧光扩增曲线 试验误差分析 归一化值
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鹅星状病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量:6
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作者 王宏宇 朱寅初 +2 位作者 云涛 张存 鲍恩东 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1616-1623,共8页
鹅星状病毒(goose astroviruses,GAstV)作为一种雏鹅新发病原,对养鹅业造成巨大经济损失,在尚无有效治疗手段情况下,加强疫病及时检测和防控十分重要。为建立快速、特异且灵敏的鉴别GAstVⅠ型和GAstVⅡ型的病毒检测方法,本研究根据GAst... 鹅星状病毒(goose astroviruses,GAstV)作为一种雏鹅新发病原,对养鹅业造成巨大经济损失,在尚无有效治疗手段情况下,加强疫病及时检测和防控十分重要。为建立快速、特异且灵敏的鉴别GAstVⅠ型和GAstVⅡ型的病毒检测方法,本研究根据GAstVⅠ和GAstVⅡ的保守区域RdRp基因序列,设计合成2对特异性引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了一种双重荧光定量PCR检测方法,以达到在同一反应体系中同时定量检测GAstVⅠ和GAstVⅡ的目的。结果显示,GAstVⅠ和GAstVⅡ的最小检出量分别为43.3、6.49 copies·μL^(-1);重复试验的变异系数不超过0.5%;该方法对DPV、GPV、GTMUV、GRV、AIV(H9N2)等病毒核酸无交叉反应。综上表明,本研究建立的可鉴别GAstVⅠ和GAstVⅡ的双重荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好。可用于临床GAstVⅠ和GAstVⅡ的快速鉴别诊断,也可用于两种基因型GAstV的定量分析。 展开更多
关键词 鹅星状病毒Ⅰ型 鹅星状病毒Ⅱ型 双重荧光定量RT-pcr TAQMAN探针
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