猪流行性腹泻病毒N蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及单克隆抗体制备

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作者 柴茂 马震原 +8 位作者 杨海波 王淑娟 刘影 王东方 赵雪丽 王翠 谢彩华 王华俊 闫若潜 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期124-131,共8页

利用昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白,并制备单克隆抗体。构建PEDV N基因重组穿梭质粒pFastBac-N,转化至感受态细胞DH10Bac中获取重组杆粒Bacmid-N,将Bacmid-N转染至SF9昆虫细胞中制备重组蛋白。将重组蛋白... 利用昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白,并制备单克隆抗体。构建PEDV N基因重组穿梭质粒pFastBac-N,转化至感受态细胞DH10Bac中获取重组杆粒Bacmid-N,将Bacmid-N转染至SF9昆虫细胞中制备重组蛋白。将重组蛋白免疫小鼠,经融合、筛选、纯化出单克隆抗体,并测定单克隆抗体相关特性。获得重组杆状病毒rBV-N,获得大小为59 kDa重组N蛋白(rN),制备出抗N蛋白单克隆抗体3C8E3,该单克隆抗体为IgG1亚类,效价为1∶1.024×10^(5),效价高、特异性强、稳定性好,更具实用性。本研究为PEDV抗原/抗体诊断试剂盒、PEDV亚单位疫苗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 昆虫杆状病毒表达系统 猪流行腹泻病毒 单克隆抗体

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ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

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作者 代鹏钰 杨蕊 +2 位作者 章婷婷 马昕芸 刘会玲 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期669-674,共6页

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM... 目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。 展开更多

关键词 α-烯醇化酶 昆虫杆状病毒表达系统 蛋白表达 酶活性位点缺失

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杆状病毒表达系统及其应用进展 被引量：16

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作者 韦永龙 李轶女 +1 位作者 张志芳 沈桂芳 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期1-7,14,共8页

杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大... 杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转移,RNA干扰等方面取得了重要的成果。就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。 展开更多

关键词 杆状病毒 bevs 表达

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昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望 被引量：8

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作者 李卫国 王厚伟 +1 位作者 牟志美 石连辉 《山东农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2003年第1期134-138,共5页

本文综述了昆虫重组病毒获得技术的研究进展以及在生产应用上的改进 。

关键词 昆虫重组杆状病毒 获得技术 表达载体系统 应用前景 发展方向

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猪生长激素基因在昆虫细胞中的分泌表达 被引量：8

5

作者 欧阳菁 龙綮新 +1 位作者 杨林 王珣章 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期482-485,共4页

将PCR扩增得到的 pGH基因插入到带有 polh启动子和 gp6 7强信号肽序列的杆状病毒转移载体pAcGP6 7 A中 ,构建重组质粒 pGP6 7pGH ,并与线性化致死缺失型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 (AcMNPV OCC-)基因组DNA共转染Sf9细胞 ,构建出重组病毒A... 将PCR扩增得到的 pGH基因插入到带有 polh启动子和 gp6 7强信号肽序列的杆状病毒转移载体pAcGP6 7 A中 ,构建重组质粒 pGP6 7pGH ,并与线性化致死缺失型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 (AcMNPV OCC-)基因组DNA共转染Sf9细胞 ,构建出重组病毒AcMNPV pGP6 7 pGH OCC-。感染重组病毒的Hi5细胞的表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,细胞可溶蛋白和培养液上清中均有一条分子量约为 2 2kDa的猪生长激素特异性反应带 ,且培养液上清中的目的蛋白分子量比天然pGH略大一些。薄层扫描仪扫描估测可知 ,重组pGH分别占细胞可溶蛋白的 8 98%和培养液上清总蛋白的 3 6 1%。将表达 96h的培养液上清浓缩液进行N 糖基化分析 ,结果显示重组 pGH无N 糖基化加工修饰。 展开更多

关键词 猪 生长激素基因 昆虫细胞 杆状病毒表达载体系统 基因表达 N-糖基化分析

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表达鸡传染性支气管炎病毒SD/97/01株S1蛋白的重组杆状病毒的构建 被引量：4

6

作者 戴亚斌 陈德胜 +6 位作者 丁铲 潘杰彦 刘兴友 芦银华 刘梅 陈溥言 蔡宝祥 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期487-492,共6页

采用BAC TO BAC 杆状病毒表达载体系统构建了表达鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)呼吸型毒株SD/ 97/ 0 1S1蛋白的重组杆状病毒 .含SD/ 97/ 0 1株S1基因的重组质粒pMDSD970 1S1用BamHI和SalI双酶切后 ,回收目的片段并克隆到杆状病毒转座载体p... 采用BAC TO BAC 杆状病毒表达载体系统构建了表达鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)呼吸型毒株SD/ 97/ 0 1S1蛋白的重组杆状病毒 .含SD/ 97/ 0 1株S1基因的重组质粒pMDSD970 1S1用BamHI和SalI双酶切后 ,回收目的片段并克隆到杆状病毒转座载体pFASTBAC HTa中多角体基因启动子的下游 ,筛选出重组转座质粒pFASTSD970 1S1并转化大肠杆菌DH10 BAC 后 ,获得重组穿梭质粒rBacmidSD970 1S1.用重组穿梭质粒DNA转染昆虫Sf9细胞 ,获得了含SD/ 97/ 0 1S1基因的重组杆状病毒rAcSD970 1S1.重组病毒感染Sf9细胞后 ,用SDS PAGE、Westernblot和IFA对细胞表达产物进行检测和分析 .结果表明 :构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达SD/ 97/ 0 1的S1蛋白 ,该蛋白具有天然蛋白的抗原性 . 展开更多

关键词 鸡 传染性支气管炎病毒 SD/97/01 S1基因 S1蛋白 杆状病毒表达载体 基因表达 基因重组

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新城疫病毒F、NP、M和HN基因在昆虫细胞内的共表达 被引量：5

7

作者 闻晓波 闫丽辉 +2 位作者 曹殿军 刘培欣 刘春国 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期257-262,共6页

为构建杆状病毒转移载体,通过PCR的方法将F48E9株新城疫病毒F基因上的Stu I位点和NP基因上的Xba I位点进行突变,扩增出全长的F、NP以及F48E9株新城疫病毒M和HN基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,再将F、NP、M和HN基因依次亚克隆到杆状病... 为构建杆状病毒转移载体,通过PCR的方法将F48E9株新城疫病毒F基因上的Stu I位点和NP基因上的Xba I位点进行突变,扩增出全长的F、NP以及F48E9株新城疫病毒M和HN基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,再将F、NP、M和HN基因依次亚克隆到杆状病毒转移载体pAcAB_4上,F基因和M基因均在p10启动子的操控之下,NP基因和HN基因构建到两个polyhedrin启动子下游,构建重组杆状病毒转移载体pAcAB4_4-F-NP-M-HN。pAcAB_4-F-NP-M-HN与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-F-NP-M-HN。重组杆状病毒感染Sf9细胞,72h后收集细胞和培养上清。Western blot分析显示:M、NP、F和HN蛋白在培养上清中得到了共表达,大小与预期结果一致;感染细胞内只检测到了HN蛋白的表达。这表明M、NP、F和HN蛋白在昆虫细胞内共表达可以自我装配成病毒样颗粒,并且以出芽的方式释放到培养基中。该重组杆状病毒的获得为研究新城疫病毒各结构蛋白之间的相互作用和确定病毒粒子出芽的驱动力等方面奠定了基础。 展开更多

关键词 新城疫病毒 杆状病毒 转移载体 表达

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宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达 被引量：4

8

作者 易咏竹 陈寅 +2 位作者 张志芳 何家禄 秦俭 《蚕业科学》 CAS CSCD 2002年第4期304-307,共4页

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体... 通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。 展开更多

关键词 表达载体 宿主域 外源基因表达 家蚕 昆虫杆状病毒表达系统 HyBacPAK6

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小反刍兽疫病毒N基因在昆虫细胞中的表达 被引量：6

9

作者 龙云凤 祝贺 +6 位作者 杨建明 陈朝银 徐维佳 周晓黎 董俊 叶玲玲 艾军 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第12期1-5,共5页

为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ... 为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ和KpnⅠ特异性酶切位点,将N基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,阳性重组质粒命名为pFastBacHTA-PPRV-N,测序结果显示N基因片段长度为1 578bp。将该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-PPRV-N,将该重组穿梭质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blot分析表明该蛋白得到表达产物,具有与抗体反应的活性,大小约为61.3ku。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 N基因 杆状病毒表达载体 昆虫细胞 表达

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J亚群禽白血病Hrb-1分离株env基因克隆及gp85杆状病毒表达载体的构建 被引量：4

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作者 付朝阳 宋素泉 +6 位作者 高宏雷 王笑梅 郭艳 王英 张厚双 尹训南 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期81-85,共5页

自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT＿PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS＿103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18＿T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取... 自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT＿PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS＿103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18＿T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取质粒分别用HindIII,BamHI进行单酶切和双酶切鉴定,得到了阳性重组质粒pMD18＿T＿Hrb＿1/env,对其进行PstI酶切,回收包含J亚群禽白血病病毒株Hrb＿1gp85基因的997bp片段,应用BactoBac杆状病毒表达系统,将外源片段与线性化的杆状病毒载体pFastBacHTA进行连接,获得重组载体pFASTBacHTA/gp85,将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得了杆状病毒重组载体Bacmid/gp85,为表达gp85并建立适于国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础。 展开更多

关键词 J亚群禽白血病病毒gp85基因 克隆 载体构建 杆状病毒表达系统

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猪瘟病毒E_2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达 被引量：3

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作者 季新成 陈杰 +5 位作者 张彦明 吴发兴 黄宝续 李晓成 张燕霞 许信刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期256-258,共3页

将除去 3’端跨膜区的猪瘟病毒E2 基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb ,获得重组质粒pFBHT_E2 ,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac ,发生转座作用 ,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2 基因的重组载体质粒rBacmid_E2 ,以脂质体... 将除去 3’端跨膜区的猪瘟病毒E2 基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb ,获得重组质粒pFBHT_E2 ,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac ,发生转座作用 ,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2 基因的重组载体质粒rBacmid_E2 ,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞 ,获得重组病毒 ,命名为rvBac_E2 。经SDS_PAGE和Western_blot及ELISA等方法检测 ,结果表明 ,此E2 基因在昆虫细胞中正确表达 ,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 E2基因 杆状病毒表达载体 表达

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鸭圆环病毒Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定 被引量：4

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作者 张兴晓 邹金峰 +4 位作者 相琪旺 王鑫 陈琳 谢之景 姜世金 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期7-11,共5页

通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表... 通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。 展开更多

关键词 鸭圆环病毒 Cap基因 昆虫细胞-杆状病毒表达系统 IFA

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弓形虫p30基因在真核系统中的表达 被引量：3

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作者 曾方银 刘国章 +2 位作者 陈晓光 李文盛 王珣章 《第一军医大学学报》 CSCD 1998年第2期91-95,共5页

采用聚乙二醇（PEG）沉淀法纯化克隆刚地弓形虫（Toxplasmagondii）p30基因的转移载体质粒pSXIVVI+X3－p30DNA；将pSXIVVI＋X3－p30DNA与粉纹夜蛾核型多角体缺陷型病毒TnNPV－SVI－GDNA共转染草地夜蛾（Sfg）细胞，构建出既能形成多角... 采用聚乙二醇（PEG）沉淀法纯化克隆刚地弓形虫（Toxplasmagondii）p30基因的转移载体质粒pSXIVVI+X3－p30DNA；将pSXIVVI＋X3－p30DNA与粉纹夜蛾核型多角体缺陷型病毒TnNPV－SVI－GDNA共转染草地夜蛾（Sfg）细胞，构建出既能形成多角体又能表达外源基因的重组病毒TnNPV－p30。经空斑纯化挑选出6株单克隆重组病毒，感染细胞裂解液在相对分子质量约为34000～35000位置出现一条表达带；其含量占细胞总蛋白的5.13％～5．62％，株间差异不明显；用抗弓形虫多克隆抗血清进行Western－Blot呈一特异反应条带。感染后72h蛋白表达量最高，可达7．18％；96小时次之，为5．91％。 展开更多

关键词 P30基因 弓形体 真核系统 基因表达

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Bac-to-Bac系统的研究进展及在家蚕中的应用 被引量：3

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作者 吴小锋 岳万福 +2 位作者 刘剑梅 李广立 缪云根 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期146-150,共5页

Bac-to-Bac策略是目前昆虫杆状病毒表达系统获取重组杆状病毒最为方便、快捷的途径之一。以Bac-to-Bac系统面向的苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(AcMNPV)表达系统、家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统、棉铃虫杆状病毒(HaNPV)表达系统等3个主要子系统... Bac-to-Bac策略是目前昆虫杆状病毒表达系统获取重组杆状病毒最为方便、快捷的途径之一。以Bac-to-Bac系统面向的苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(AcMNPV)表达系统、家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统、棉铃虫杆状病毒(HaNPV)表达系统等3个主要子系统为对象,从宿主域逐渐扩大、蛋白的表达水平不断提高、筛选和纯化更为简便高效以及在家蚕中应用的状况等角度,对Bac-to-Bac系统的发展及功能、特点等进行了阐述。 展开更多

关键词 Bac—to-Bac系统 杆状病毒表达载体系统 家蚕

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猴B病毒gB基因在昆虫细胞中的表达 被引量：2

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作者 段博芳 王琼 +7 位作者 段纲 毛永杨 叶玲玲 杨建明 徐维加 董俊 周晓黎 艾军 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期674-678,共5页

目的研发猴B病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原。方法根据已报道的猴B病毒E2490株gB蛋白基因序列(GenBank登录号:AF533768)人工合成gB基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将gB基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶... 目的研发猴B病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原。方法根据已报道的猴B病毒E2490株gB蛋白基因序列(GenBank登录号:AF533768)人工合成gB基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将gB基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带gB基因的重组质粒pFastBac-HTa-gB。结果该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒bacmid-gB。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,细胞变大变圆细胞核扩大,收获重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot分析及间接免疫荧光检测,结果表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为98kDa。实验结果表明已成功构建了携带目的基因的重组质粒pFastBac-HTa-gB和转座的杆粒bacmid-gB,转染后在sf9昆虫细胞上得到表达。结论研究结果为下一步以表达的gB蛋白为诊断抗原,替代现阶段以病毒作为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 猴B病毒 GB基因 杆状病毒表达载体 昆虫细胞

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HSV-2糖蛋白D在昆虫-杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析 被引量：2

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作者 刘微 罗晓华 +7 位作者 陈文婧 董媛 朱洁 郭健 姜勇 张磊 孟桂先 王会岩 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期720-724,共5页

目的:在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)胞外区基因,检测其免疫原性。方法:以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4... 目的:在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)胞外区基因,检测其免疫原性。方法:以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒(P4),通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠(gD2组),以PBS作为阴性对照(PBS组),ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度。结果:PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×109 pfu·mL-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37 000处出现目标条带,纯度达90%以上。第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选。 展开更多

关键词 生殖器疱疹 疱疹病毒2型 人 糖蛋白D 昆虫-杆状病毒表达系统

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含有IBVS1基因的昆虫杆状病毒表达载体的构建 被引量：4

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作者 宋延华 刘福安 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第4期1-4,共4页

以含有鸡传染性支气管炎病毒Ｈｏｌｔｅ株Ｓ１基因的重组质粒ｐＵＣ１８Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ和ｐＵＣ１８Ｓ′１．Ｈｏｌｔｅ为材料，分别构建了可表达ＩＢＶＳ１基因的昆虫杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３Ｓ１．Ｈｏｌｔ... 以含有鸡传染性支气管炎病毒Ｈｏｌｔｅ株Ｓ１基因的重组质粒ｐＵＣ１８Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ和ｐＵＣ１８Ｓ′１．Ｈｏｌｔｅ为材料，分别构建了可表达ＩＢＶＳ１基因的昆虫杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（含ＩＢＶ先导序列）、ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３／４Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（ＩＢＶ先导序列作为融合短肽）、ｐＡｃＧＨＬＣＳ１． 展开更多

关键词 S1基因 杆状病毒 表达载体 构建 IBV 鸡

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家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究 被引量：2

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作者 卢觅佳 于涟 +1 位作者 谢荣辉 张朝政 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期545-552,共8页

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达... 将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDVVP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分. 展开更多

关键词 传染性法氏囊病病毒(IBDV) 多聚蛋白(VP2/4/3) 家蚕杆状病毒载体 家蚕表达 安全性 免疫原性

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诺如病毒病毒样颗粒的表达及其与HBGAs受体的结合研究 被引量：5

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作者 张绪富 戴迎春 +1 位作者 宋灿磊 周迎春 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期315-318,共4页

目的:以杆状病毒为载体,在昆虫细胞sf9中表达GⅡ-4型野生株诺如病毒(Noroviruses,NoV)GZ121的衣壳蛋白ORF2,并验证其与组织血型抗原(Histoblood group antigen,HBGAs)受体的结合活性。方法:双酶切质粒PMD18-T-GZ121 ORF2酶切,连接入线... 目的:以杆状病毒为载体,在昆虫细胞sf9中表达GⅡ-4型野生株诺如病毒(Noroviruses,NoV)GZ121的衣壳蛋白ORF2,并验证其与组织血型抗原(Histoblood group antigen,HBGAs)受体的结合活性。方法:双酶切质粒PMD18-T-GZ121 ORF2酶切,连接入线性化载体PFastBacTM1,获得重组转座载体pFastBac-GZ121 ORF2,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得重组杆状病毒,将其转染昆虫sf9细胞进行蛋白表达,用蔗糖超离方法纯化以及免疫印迹、透射电镜等方法鉴定表达产物,用EIA法检测NoV-VLP与HBGAs的结合特性。结果:成功表达了分子量约为58 kD的NoV衣壳蛋白,大小约30 nm与预期相符,NoV-VLP与A、B、O型均能结合,与非分泌型唾液不结合,结合方式与rVA387相一致。结论:我国优势流行株GⅡ4型NoV病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP)的表达成功及NoV-VLP和HBGAs受体结合模型的建立,为我国NoV疫苗的开发和防治药物的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 诺如病毒 杆状病毒表达系统 病毒样颗粒 HBGAs受体

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神经营养素-4(NT-4)在昆虫杆状病毒表达系统中的克隆与表达 被引量：4

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作者 马晓骊 黄秉仁 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期141-144,共4页

目的 通过昆虫杆状病毒表达系统的优势，表达出具有生物学活性的神经营养素-4（ hNT-4）蛋白。方法 通过 PCR方法获得 hNT-4成熟肽的基因，将其连接到昆虫表达载体 pAcGP67B上，在昆虫细胞 Sf9中进行表达。对表达产物进行免疫原性和生... 目的 通过昆虫杆状病毒表达系统的优势，表达出具有生物学活性的神经营养素-4（ hNT-4）蛋白。方法 通过 PCR方法获得 hNT-4成熟肽的基因，将其连接到昆虫表达载体 pAcGP67B上，在昆虫细胞 Sf9中进行表达。对表达产物进行免疫原性和生物学活性测定。结果 获得 hNT-4蛋白的表达产物， SDS-PAGE电泳显示表达产物相对分子质量为 15 000。 经 Western-blot验证，表达上清及细胞全蛋白均有一条能与抗人 NT-4抗体发生特异性免疫反应的条带。经 PC12细胞测定，表达上清中的 rNT-4蛋白具有明确的生物学活性。结论 hNT-4在昆虫杆状病毒表达系统中的表达为今后进一步深入研究 hNT-4的功能及其在临床中的应用提供了条件。 展开更多

关键词 神经营养素-4 载体PacGP67B Sf 细胞 昆虫杆状病毒 表达系统 克隆表达

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