【目的】目前国内外西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的核酸检测中缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,对检测结果的精确度和可信度造成一定的影响。本研究旨在研制一种安全稳定的WNV核酸检测质控品,为西尼罗热监测提供技术支持。【方法】...【目的】目前国内外西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的核酸检测中缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,对检测结果的精确度和可信度造成一定的影响。本研究旨在研制一种安全稳定的WNV核酸检测质控品,为西尼罗热监测提供技术支持。【方法】将WNV核酸检测靶基因、MS2噬菌体外壳蛋白CP及成熟酶蛋白A基因序列插入到表达载体得到重组质粒pET-CPA-WN,经转化、表达、纯化后,制备WNV装甲RNA质控品,并对其进行实时荧光定量PCR和数字PCR定量、均匀性及稳定性分析,评估其作为标准物质的可能性。【结果】PCR检测、双酶切和基因测序结果均显示已成功构建重组质粒pET-CPA-WN,表达纯化后得到了大小均一、直径为23~28 nm的病毒样颗粒。核酸酶消化后实时荧光定量PCR检测结果显示,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的装甲RNA;其定植结果为8.80×10~9拷贝/mL。稳定性试验结果表明,该装甲RNA可在37℃稳定保持20 d,随机抽取10个样本进行均匀性检验证明其均匀性良好。【结论】本研究基于MS2噬菌体制备的装甲RNA拷贝数高,均匀性和稳定性良好,可为WNV分子检测提供安全、稳定的参考样品。展开更多
目的建立西尼罗河病毒(West Nile Virus,WNV)抗体检测方法。方法人工合成了WNV NY99株E蛋白结构域Ⅲ(DⅢ)基因序列,构建了重组表达载体PET-28a-DⅢ。结果重组质粒转化BL21宿主菌后诱导表达,SDS-PAGE分析表明,表达产物相对分子量17kD,以...目的建立西尼罗河病毒(West Nile Virus,WNV)抗体检测方法。方法人工合成了WNV NY99株E蛋白结构域Ⅲ(DⅢ)基因序列,构建了重组表达载体PET-28a-DⅢ。结果重组质粒转化BL21宿主菌后诱导表达,SDS-PAGE分析表明,表达产物相对分子量17kD,以包涵体形式存在。对表达产物作变性和复性及纯化处理,Western-blot鉴定结果表明,纯化产物可被WNV血清识别。将纯化重组蛋白包被酶标板,优化间接ELISA反应条件,抗原最佳包被浓度为3.75μg/mL、血清最佳稀释度为1∶1 600、酶标二抗最佳稀释度1∶6 000、阴阳血清临界值为0.148。特异性、敏感性及重复性试验结果表明,本方法特异性强、敏感性高、重复性良好。结论本研究为WNV感染的血清学诊断提供了技术储备。展开更多
文摘【目的】目前国内外西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的核酸检测中缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,对检测结果的精确度和可信度造成一定的影响。本研究旨在研制一种安全稳定的WNV核酸检测质控品,为西尼罗热监测提供技术支持。【方法】将WNV核酸检测靶基因、MS2噬菌体外壳蛋白CP及成熟酶蛋白A基因序列插入到表达载体得到重组质粒pET-CPA-WN,经转化、表达、纯化后,制备WNV装甲RNA质控品,并对其进行实时荧光定量PCR和数字PCR定量、均匀性及稳定性分析,评估其作为标准物质的可能性。【结果】PCR检测、双酶切和基因测序结果均显示已成功构建重组质粒pET-CPA-WN,表达纯化后得到了大小均一、直径为23~28 nm的病毒样颗粒。核酸酶消化后实时荧光定量PCR检测结果显示,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的装甲RNA;其定植结果为8.80×10~9拷贝/mL。稳定性试验结果表明,该装甲RNA可在37℃稳定保持20 d,随机抽取10个样本进行均匀性检验证明其均匀性良好。【结论】本研究基于MS2噬菌体制备的装甲RNA拷贝数高,均匀性和稳定性良好,可为WNV分子检测提供安全、稳定的参考样品。
