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猪细小病毒VP2重组蛋白的诱导表达及表达产物的纯化
1
作者 孙超 高莹 +3 位作者 丁晨 佟洋 范慧 张宏玲 《今日畜牧兽医》 2018年第10期10-11,共2页
将构建好的重组质粒转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了VP2蛋白主要抗原域的高效表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定其表达形式;经滤膜、饱和硫酸铵、Ni-NTA树脂层析进行纯化。结果表明:重组质粒得到高效诱导表达,并且重组蛋白... 将构建好的重组质粒转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了VP2蛋白主要抗原域的高效表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定其表达形式;经滤膜、饱和硫酸铵、Ni-NTA树脂层析进行纯化。结果表明:重组质粒得到高效诱导表达,并且重组蛋白以包涵体的形式存在;获得高纯度的重组蛋白。 展开更多
关键词 猪细小病毒 vp2重组蛋白的诱导表达 纯化
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家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin2的诱导表达条件优化及原核重组蛋白纯化
2
作者 王玮 王丽 +3 位作者 国果 修江帆 尚小丽 张昌容 《贵州农业科学》 2025年第4期66-72,共7页
【目的】通过诱导表达获取大量纯化的家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin2重组蛋白,为后续深入分析模式昆虫家蝇的Serpin体内外免疫调节功能奠定基础。【方法】使用pET-28a(+)作为表达载体构建家蝇Serpin2的原核表达系统并导入到大肠杆菌(BL... 【目的】通过诱导表达获取大量纯化的家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin2重组蛋白,为后续深入分析模式昆虫家蝇的Serpin体内外免疫调节功能奠定基础。【方法】使用pET-28a(+)作为表达载体构建家蝇Serpin2的原核表达系统并导入到大肠杆菌(BL21)中,设置不同IPTG浓度、不同诱导温度和不同诱导时间以探索最佳诱导条件,在此条件下进行Serpin2原核重组蛋白大量诱导表达和纯化,并通过SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白质谱对纯化的Serpin2重组蛋白进行鉴定。【结果】成功构建了pET28a(+)-Serpin2的重组质粒并转化至感受态细胞中,明确在30℃条件下以终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导表达15 h,可使家蝇Serpin2重组蛋白在大肠杆菌BL21中获得较优表达,且在上清和包涵体内均有表达,经鉴定纯化后的蛋白即为家蝇Serpin2重组蛋白。【结论】最佳诱导条件(30℃、0.2mmol/LIPTG、15h)下可获得大量纯化的家蝇Serpin2重组蛋白。 展开更多
关键词 家蝇 丝氨酸蛋白酶抑制剂2 原核表达优化 蛋白纯化 重组质粒 重组蛋白
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基于真核表达塞内卡病毒A VP2蛋白的间接ELISA检测方法
3
作者 裴宗飞 于凯蓝 +2 位作者 安欣娜 陈俊雯 张永宁 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2025年第1期65-74,共10页
为建立检测塞内卡病毒A(SVA)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),本试验利用昆虫杆状病毒表达系统表达SVA的主要结构蛋白和保护性抗原VP2,通过间接免疫荧光试验(IFA)验证VP2的免疫反应性,并使用氨基三乙酸镍(NiNTA)树脂亲和纯化重组VP2... 为建立检测塞内卡病毒A(SVA)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),本试验利用昆虫杆状病毒表达系统表达SVA的主要结构蛋白和保护性抗原VP2,通过间接免疫荧光试验(IFA)验证VP2的免疫反应性,并使用氨基三乙酸镍(NiNTA)树脂亲和纯化重组VP2蛋白。以纯化的VP2蛋白为包被抗原,利用棋盘滴定法确定最优的抗原包被浓度和待检血清稀释度,通过优化反应条件和确定临界值,建立了检测SVA抗体的间接ELISA检测方法,并评估了其特异性、敏感性、重复性及与IFA的检测符合率。结果显示,重组VP2蛋白在杆状病毒感染的Sf9细胞内呈现可溶性表达,能够被SVA VP2特异性单克隆抗体2F5识别;经Ni-NTA纯化后,获得了分子量约31 kDa的重组VP2蛋白;间接ELISA的最佳抗原包被浓度为2μg/mL,最佳血清稀释度为1∶100,最佳酶标二抗稀释度为1∶10000;阴阳性临界值为0.287;与口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型抗血清无交叉反应;批内与批间变异系数均低于10%。利用建立的间接ELISA检测了实验室保存的52份猪血清样本,与IFA的检测符合率为96.15%(50/52)。综上,本试验间接ELISA的成功建立为SVA抗体检测和流行病学调查提供了有力工具。 展开更多
关键词 塞内卡病毒A(SVA) vp2蛋白 昆虫杆状病毒表达系统 间接ELISA 抗体
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A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体制备与竞争ELISA方法的建立
4
作者 何启杰 农作荣 +7 位作者 王豪 牛晨霞 莫勇芳 欧阳康 陈樱 黄伟坚 黄稳妃 韦祖樟 《动物医学进展》 北大核心 2025年第2期23-29,共7页
依据A型塞内卡病毒(SVA)结构蛋白VP2基因序列构建原核表达质粒pET-30a-VP2,经转化和诱导,表达出VP2重组蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,采集血清获得VP2的多克隆抗体。用间接ELISA方法测定血清中VP2抗体效价,并用Western blot与IFA验证其... 依据A型塞内卡病毒(SVA)结构蛋白VP2基因序列构建原核表达质粒pET-30a-VP2,经转化和诱导,表达出VP2重组蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,采集血清获得VP2的多克隆抗体。用间接ELISA方法测定血清中VP2抗体效价,并用Western blot与IFA验证其特异性。随后建立竞争ELISA方法,并对实验室收集的2016-2019年广西11个地区64个规模猪场592份猪血清进行SVA抗体检测。结果显示,诱导表达出的重组VP2蛋白主要以可溶性形式表达,血清中VP2抗体效价大于1∶64000,且制备的VP2抗体能特异结合SVA感染细胞中的VP2蛋白。竞争ELISA检测结果显示广西地区猪场SVA血清阳性率高达76.6%,血清样品阳性率高达55.9%,研究结果为SVA的检测和研究奠定了基础。 展开更多
关键词 A型塞内卡 vp2蛋白 原核表达 多克隆抗体 竞争ELISA
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乳糖诱导对虾白斑病毒囊膜蛋白VP28基因在重组大肠杆菌中的表达
5
作者 郭瑞 潘荣昌 +1 位作者 周宇兵 胡文锋 《南方水产》 CAS 2008年第5期16-22,共7页
以含对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)囊膜蛋白VP28编码基因质粒的重组大肠杆菌Escherichia coliBL21作为研究对象,研究了乳糖或乳清粉代替IPTG作为诱导剂诱导重组囊膜蛋白VP28的表达。结果表明,乳糖不仅能够作为诱... 以含对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)囊膜蛋白VP28编码基因质粒的重组大肠杆菌Escherichia coliBL21作为研究对象,研究了乳糖或乳清粉代替IPTG作为诱导剂诱导重组囊膜蛋白VP28的表达。结果表明,乳糖不仅能够作为诱导剂诱导重组大肠杆菌进行外源蛋白的表达,而且能作为碳源促进菌体的生长。通过对诱导条件的优化,乳糖在发酵培养基的添加量为8g.L-1,发酵时间为12h时可以获得最高的目的蛋白表达量,为97.36mg.L-1。试验亦使用乳清粉作为发酵培养基的碳源和诱导工程菌表达的诱导剂。结果表明,在发酵培养基中添加乳清粉作为碳源和诱导剂,使其乳糖终浓度为10g.L-1,发酵时间为13h时可以获得最高的目的蛋白表达量,为86.24mg.L-1。 展开更多
关键词 白斑综合症病毒 囊膜蛋白vp28 重组大肠杆菌 诱导表达
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表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建 被引量：1
6
作者 徐贞琦 蒋蕙如 +8 位作者 郭艺文 谢泉 殷楠 李拓凡 万志敏 邵红霞 秦爱建 张俊 叶建强 《中国家禽》 北大核心 2024年第4期47-53,共7页
为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光... 为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。 展开更多
关键词 鸡传染性贫血病毒 vp1蛋白 CRISPR-Cas9 重组血清4型禽腺病毒 表达
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表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其表达的优化 被引量：8
7
作者 张旺 刘琳琳 +9 位作者 祁小乐 高玉龙 王永强 高宏雷 李凯 高立 刘长军 张艳萍 王笑梅 崔红玉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期825-828,共4页
鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2蛋白是该病毒的主要抗原蛋白,为制备乳酸菌黏膜免疫口服疫苗,本研究采用乳酸乳球菌(L.lactis)及其Nisin诱导的表达系统,对VP2基因进行密码子优化,构建了表达IBDVVP2蛋白的重组乳酸乳球菌L.lactis/p NZ-VP... 鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2蛋白是该病毒的主要抗原蛋白,为制备乳酸菌黏膜免疫口服疫苗,本研究采用乳酸乳球菌(L.lactis)及其Nisin诱导的表达系统,对VP2基因进行密码子优化,构建了表达IBDVVP2蛋白的重组乳酸乳球菌L.lactis/p NZ-VP2。经正交试验对诱导条件进行优化,重组VP2蛋白(r VP2)表达量比优化前明显提高,最终得到最佳诱导条件为:OD600nm=0.5开始诱导,Nisin终浓度为2 ng/m L,诱导时间为5 h,r VP2表达量达到最大值38μg/m L。经western blot检测,r VP2能够持续性表达并具有良好的抗原性。该重组乳酸菌的构建为进一步体内免疫实验奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡传染性法氏囊病毒 重组乳酸菌 vp2蛋白
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乳酸菌融合表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白与大肠杆菌LTB及其诱导免疫应答的研究 被引量：1
8
作者 唐丽杰 张怡婷 +4 位作者 乔薪媛 葛俊伟 姜艳萍 崔文 李一经 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期576-580,共5页
为研究传染性法氏囊病毒(IBDV)保护性抗原VP2与E.coli不耐热肠毒素B亚单位(LTB)在戊糖乳杆菌(L.pentosus)中的共表达及其免疫原性,本研究以乳酸杆菌表面表达型和分泌表达型质粒pPG-1和pPG-2为载体,以VP2为目的基因,构建VP2基因单独表达... 为研究传染性法氏囊病毒(IBDV)保护性抗原VP2与E.coli不耐热肠毒素B亚单位(LTB)在戊糖乳杆菌(L.pentosus)中的共表达及其免疫原性,本研究以乳酸杆菌表面表达型和分泌表达型质粒pPG-1和pPG-2为载体,以VP2为目的基因,构建VP2基因单独表达及与LTB基因融合表达的4种重组L.pentosus,分别命名为pPG-1-VP2/L.pentosus、pPG-1-VP2-LTB/L.pentosus、pPG-2-VP2/L.pentosus及pPG-2-VP2-LTB/L.pentosus。表达的重组蛋白分子量大小分别约为47 ku、55 ku、45 ku及53ku。将构建的重组L.pentosus分别口服免疫SPF雏鸡,以IDEXX试剂盒测定体液免疫应答水平,结果显示,不同表达方式的重组L.pentosus均可以刺激机体产生特异性循环抗体和分泌抗体(sIgA),其中pPG-2-VP2-LTB/L.pentosus诱导产生的抗体滴度高于其它组。MTT法检测不同表达方式的重组乳酸菌免疫雏鸡外周血淋巴细胞增殖反应,结果显示特异性抗原对免疫雏鸡淋巴细胞的增殖指数显著高于未免疫组,表明重组菌能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答。这些结果表明4种重组菌均能够刺激机体产生局部黏膜免疫和全身系统免疫应答;并且带有黏膜免疫佐剂LTB融合表达试验组高于VP2蛋白单独表达组。 展开更多
关键词 IBDV vp2蛋白 LTB 戊糖乳杆菌 共表达 免疫应答
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人类微小病毒B19结构蛋白VP2的重组表达及单克隆抗体的制备 被引量：2
9
作者 黄庆生 薛小平 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期609-610,612,共3页
目的:制备特异性的抗人类微小病毒B19单克隆抗体(mAb)杂交瘤。方法:采用PCR从B19病毒感染患者的血清标本中扩增编码VP2蛋白的基因,经克隆、测序确认后,再分别亚克隆至原核表达载体和真核表达载体。以从SDS-PAGE凝胶中回收的原核表达产... 目的:制备特异性的抗人类微小病毒B19单克隆抗体(mAb)杂交瘤。方法:采用PCR从B19病毒感染患者的血清标本中扩增编码VP2蛋白的基因,经克隆、测序确认后,再分别亚克隆至原核表达载体和真核表达载体。以从SDS-PAGE凝胶中回收的原核表达产物免疫BALB/c小鼠,制备可分泌特异性B19mAb的杂交瘤细胞。以真核表达载体转染CHO细胞后,筛选单细胞表达克隆,将真核表达产物与用原核表达产物为免疫原制备的mAb反应。结果:从患者血清标本中扩增出了1665bp长的DNA,测序结果证实为vp2基因。将该基因克隆至原核表达载体中后,在大肠杆菌中获得了表达。表达产物经SDS-PAGE后,在Mr约为6000处可见1条明显的表达带。Westernblot的结果表明,该电泳带与B19患者的血清呈特异性免疫反应。以从SDS-PAGE凝胶中回收的表达产物为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、克隆化,获得2株分泌特异性的抗VP2mAb的杂交瘤细胞。以这2株杂交瘤细胞制备的腹水可与SDS-PAGE凝胶Mr6000的蛋白条带也出现很强的免疫反应。用ELISA证明以Vp2基因真核表达载体转染的CHO培养上清,也与筛选到的mAb呈阳性反应。结论:成功地制备抗VP2的mAb,为进一步研制可用于B19病毒感染早期免疫诊断试剂盒奠定了基础。 展开更多
关键词 人类微小病毒B19 vp2结构蛋白 重组表达 单克隆抗体
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重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析 被引量：1
10
作者 千爱君 萧耿苗 +4 位作者 李壮 梁志成 穆云萍 赵子建 李芳红 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期390-396,共7页
目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,... 目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。 展开更多
关键词 重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白 真核表达 悬浮CHO-S细胞 cAMP活性 基因工程 脂代谢
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表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5的构建及鉴定
11
作者 徐婷 熊挺 +5 位作者 李淋雨 刘郁夫 温良海 谢文婷 杨泽坤 陈瑞爱 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第12期1424-1434,共11页
【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源... 【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将VP2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-VP2;PmeⅠ酶线性化pAdTrack-VP2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞,利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-VP2;将pAd-VP2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞,包装表达VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5 (rAd5-VP2),将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞(Vero、CEF和DF1细胞)并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-VP2通过HEK293A细胞扩大培养,测得第10代病毒的滴度为7.9×10~9 IFU/mL;RT-PCR结果显示,VP2基因在重组腺病毒中能稳定翻译;Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到VP2蛋白的表达,蛋白分子质量为41 ku;将rAd5-VP2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到VP2蛋白的表达,表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5,该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病 vp2蛋白 重组复制缺陷型人5型腺病毒
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乳糖诱导pET载体表达重组蛋白的研究 被引量：63
12
作者 吴一凡 张双全 +1 位作者 高秀玉 刘晓宇 《南京师大学报（自然科学版）》 CAS CSCD 2002年第1期89-93,共5页
以重组人B淋巴细胞刺激因子 (hBLyS)蛋白表达宿主菌株BL2 1(DE3) (pET30 (a) /hBLyS)作为研究对象 ,借助SDS PAGE分析方法 ,对于用乳糖诱导由T7lac启动子控制的重组目的产物的表达规律进行了优化研究 .分析比较了诱导的起始阶段、所需... 以重组人B淋巴细胞刺激因子 (hBLyS)蛋白表达宿主菌株BL2 1(DE3) (pET30 (a) /hBLyS)作为研究对象 ,借助SDS PAGE分析方法 ,对于用乳糖诱导由T7lac启动子控制的重组目的产物的表达规律进行了优化研究 .分析比较了诱导的起始阶段、所需的乳糖浓度和诱导持续时间等参数对重组产物表达的影响 .实验结果表明 ,对于T7lac启动子控制的重组目的产物 ,乳糖可以作为诱导剂 ;在对诱导条件进行优化控制的前提下 ,乳糖诱导目的产物的绝对表达量虽然不及IPTG ,但相对成本却比IPTG低得多 ,且没有毒性 .研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组基因工程药物工业化生产提供了一定的参考 . 展开更多
关键词 pET载体 重组蛋白 乳糖 诱导条件 大肠杆菌 SDS-PAGE 基因表达 诱导剂 T7lac启动子控制
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A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立 被引量：3
13
作者 任建乐 林铱婷 +9 位作者 姬康 谭姗姗 陈新新 晋怡 王颖 牛胜 梁立滨 李俊平 赵宇军 田文霞 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期678-688,共11页
[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,... [目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。 展开更多
关键词 A型塞内卡病毒(SVA) vp2蛋白 原核表达 多克隆抗体 间接ELISA
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重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化 被引量：11
14
作者 杨杰 张筠 孟祥晨 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第19期170-175,共6页
目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫... 目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTA Purification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD6_（600nm）为0.6~0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。 展开更多
关键词 重组蛋白 LUXS 诱导表达 纯化 自诱导物2
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人蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定 被引量：24
15
作者 陈小文 刘新光 +1 位作者 梁景耀 梁念慈 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期176-182,共7页
通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符... 通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符的重组质粒 (命名为pTCKA′) .将其转化BL2 1(DE3)菌 ,IPTG诱导后未见高效特异表达 .然后将人CK2α′cDNA亚克隆至GST融合蛋白表达载体 ,经同样转化和诱导步骤后可见一蛋白特异高效表达 .Western印迹结果证明 :该蛋白能与兔抗人CK2α′3 3 3 3 50 肽段抗血清发生特异性免疫反应 .采用GSH Sepharose 4B柱纯化 ,凝血酶酶切 ,最后从 4g细菌获 4 4mg纯化重组蛋白 .通过性质鉴定和酶动力学分析证明 :克隆、表达和纯化的重组蛋白是有生物学活性的人CK2α′亚基 . 展开更多
关键词 人蛋白激酶CK2α'亚基 大肠杆菌 克隆 表达 纯化 重组蛋白 鉴定
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猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达 被引量：26
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作者 刘长明 陆月华 +3 位作者 张超范 危艳武 刘焕章 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期479-482,共4页
猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap)。为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶... 猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap)。为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证。重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL。采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%。免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应。本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 重组衣壳蛋白 杆状病毒表达
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虹鳟IPNV分离株VP2蛋白的表达及免疫原性检测 被引量：8
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作者 赵景壮 贺文斌 +4 位作者 徐黎明 纪锋 曹永生 胡朝 卢彤岩 《大连海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期179-185,共7页
为充分了解中国鱼类传染性胰腺坏死病病毒的系统进化,对流行病学调查分离出的虹鳟Oncorhynchus mykiss传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)分离株进行了系统进化分析,利用软件综合分析了IPNV病毒表面蛋白VP2的跨膜区、亲水性、抗原性和表面可能... 为充分了解中国鱼类传染性胰腺坏死病病毒的系统进化,对流行病学调查分离出的虹鳟Oncorhynchus mykiss传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)分离株进行了系统进化分析,利用软件综合分析了IPNV病毒表面蛋白VP2的跨膜区、亲水性、抗原性和表面可能性,对其特定区段进行了原核表达,并利用表达蛋白制备鼠抗血清及免疫学鉴定。结果表明:本实验室得到的分离株与中国已报道的毒株具有不同的来源;SDS-PAGE分析显示,表达纯化的VP2蛋白为单一条带,相对分子质量约为45 000;ELISA分析显示,利用表达蛋白制备的鼠抗血清与IPNV分离株细胞培养物的效价为1∶20 000,与VP2蛋白的效价为1∶40 000;间接免疫荧光分析显示,细胞感染IPNV病毒24、48 h后,该鼠抗血清均能与IPNV毒株发生特异性反应,并呈现出特异性绿色荧光。研究表明,本研究中表达的VP2蛋白与IPNV病毒的VP2蛋白具有相近的免疫原性,这一结果为IPNV检测方法的建立及疫苗的构建提供了重要的试验依据。 展开更多
关键词 传染性胰腺坏死病病毒 蛋白表达 vp2蛋白 免疫原性
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家蚕表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的免疫原性初步研究(英文) 被引量：11
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作者 于涟 宋坤华 +2 位作者 张耀洲 黄耀伟 李建荣 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CSCD 北大核心 2000年第1期9-16,共8页
在家蚕培养细胞及幼蚕中表达传染性法氏囊病病毒 ( IBDV)主要宿主保护性抗原 VP2蛋白的基础上 ,初步研究了该表达产物的免疫原性 .Western免疫印迹和 ELISA均检测到春蚕和秋蚕中的 VP2蛋白活性 .含 VP2的春蚕蚕血制成的注射疫苗皮下注射... 在家蚕培养细胞及幼蚕中表达传染性法氏囊病病毒 ( IBDV)主要宿主保护性抗原 VP2蛋白的基础上 ,初步研究了该表达产物的免疫原性 .Western免疫印迹和 ELISA均检测到春蚕和秋蚕中的 VP2蛋白活性 .含 VP2的春蚕蚕血制成的注射疫苗皮下注射 18日龄非免疫鸡 ,两周后二免 ;含 VP2的秋蚕蚕血冻干制成口服疫苗 ,隔天喂服 18日龄非免疫鸡 .于首免后第 10 ,13,2 1,2 8,37日分别采血 ,第 37日攻毒 .病毒血清中和试验显示注射组及口服组的中和抗体滴度最高可达 1∶ 42 11.3和 1∶ 3118.9,攻毒结果显示它们对 IBDV中国标准强毒株 BC6/85的攻击保护率为 10 0 %和 80 %.以上研究表明家蚕表达的 VP2蛋白具有良好的免疫原性 ,从而为开发实用化低成本的疫苗打下了扎实基础 . 展开更多
关键词 家蚕 IBDV vp2基因 重组疫苗 免疫原性 表达系统
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共表达鹅细小病毒VP3-gIL2重组乳酸杆菌的构建及其口服免疫评价 被引量：7
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作者 丁轲 余祖华 +8 位作者 李旺 闫文朝 王臣 赵战勤 程相朝 张春杰 王天奇 程安春 汪铭书 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期262-269,共8页
笔者拟构建共表达鹅细小病毒(GPV)VP3和鹅白细胞介素-2(IL-2)的分泌性重组乳酸杆菌,评价口服表达融合蛋白GPV VP3-gIL2的重组乳酸杆菌的免疫效果。通过酶切将VP3基因和IL-2基因连接,并在其5′端连入乳酸杆菌的信号肽基因SP,亚克隆到乳... 笔者拟构建共表达鹅细小病毒(GPV)VP3和鹅白细胞介素-2(IL-2)的分泌性重组乳酸杆菌,评价口服表达融合蛋白GPV VP3-gIL2的重组乳酸杆菌的免疫效果。通过酶切将VP3基因和IL-2基因连接,并在其5′端连入乳酸杆菌的信号肽基因SP,亚克隆到乳酸杆菌整合表达载体pMJ67,电转化入干酪乳杆菌L.CECT5276,SDS-PAGE和Western blot法鉴定重组菌GPVVP3-gIL2融合蛋白的表达活性。将重组乳酸杆菌口服免疫雏鹅后检测血清GPV抗体、小肠黏液sIgA和脾淋巴细胞增殖情况,评价其免疫效果。结果表明,酶切和测序结果表明成功构建重组表达载体pMJ-SP-GPVVP3-gIL2,PCR证实质粒pMJ-SP-GPVVP3-gIL2成功整合到乳酸杆菌基因组;Western blot表明重组乳酸杆菌分泌表达的融合蛋白GPVVP3-gIL2能与GPV阳性血清特异性结合;淋巴细胞增殖试验表明口服重组菌后能特异地刺激脾淋巴细胞增殖,且在第4、5、6周明显高于GPV VP3组和gIL2组;重组乳酸杆菌口服免疫雏鹅可以产生抗VP3蛋白抗体,且具有中和活性的抗体显著高于GPV VP3组;小肠黏液sIgA细胞生成的数量自第2周较GPV VP3组和疫苗组显著上升。动物攻毒试验结果显示GPV VP3-gIL2融合蛋白免疫组能够获得85%的保护率,表明所构建的重组乳酸杆菌口服后对GPV的攻击具有较好的免疫保护作用。本试验成功构建能稳定表达GPV VP3-IL2融合蛋白的口服乳酸杆菌工程菌,为研究其作为口服疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 鹅细小病毒(GPV) vp3 鹅白细胞介素-2(IL-2) 乳酸杆菌 共表达 口服免疫 融合蛋白
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IPTG诱导浓度、时间对AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响 被引量：4
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作者 魏婕 易忠 +4 位作者 魏玉荣 王海烽 胡尔玛西 符子华 冉多良 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第5期63-66,共4页
将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21。用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋白,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件。结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度... 将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21。用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋白,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件。结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大。最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 AsiaⅠ型 vp1蛋白 表达 IPTG 诱导浓度 诱导时间
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