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兔出血症病毒VP60抗原优势区和Th细胞表位融合蛋白的原核表达及免疫效力测定 被引量：2
1
作者 孟春春 程英杰 +5 位作者 李传峰 王玢瑸 缪秋红 陈宗艳 吴润 刘光清 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期239-242,共4页
为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60两个抗原优势区串联通用Th细胞表位的融合蛋白AB-Th的免疫效力,本研究采用融合PCR的方法以pBL-RHDV为模板扩增AB-Th基因并亚克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,大量表达AB... 为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60两个抗原优势区串联通用Th细胞表位的融合蛋白AB-Th的免疫效力,本研究采用融合PCR的方法以pBL-RHDV为模板扩增AB-Th基因并亚克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,大量表达AB-Th融合蛋白。结果显示,融合蛋白以包涵体形式表达,并且具有良好的免疫原性。使用纯化后的融合蛋白免疫实验兔,并分别利用ELISA方法和MTS法检测兔免疫后的抗体水平和淋巴细胞增殖能力。结果表明该融合蛋白能够使兔产生针对RHDV VP60蛋白的特异性抗体和导致高水平的淋巴细胞增殖,并能够为实验兔提供100%的保护。 展开更多
关键词 VP60优势抗原区 th细胞表位 原核表达 免疫效力测定
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含有Th细胞表位的合成PCV2 ORF2 Cap多肽抗原的表达及免疫原性分析 被引量：3
2
作者 陈善真 赵焱 +4 位作者 李中圣 罗均 陈克宏 王贵平 李其昌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2273-2281,共9页
拟测定在PCV2ORF2Cap P1多肽抗原中添加从PCV2ORF1、ORF3中筛选的Th细胞表位多肽在促进其免疫原性中的作用,以及合成表达的PCV2ORF2Cap P1多肽抗原作为疫苗抗原的可行性。采用生物信息学及分子生物学方法,筛选获得1条泛宿主新型Th细胞... 拟测定在PCV2ORF2Cap P1多肽抗原中添加从PCV2ORF1、ORF3中筛选的Th细胞表位多肽在促进其免疫原性中的作用,以及合成表达的PCV2ORF2Cap P1多肽抗原作为疫苗抗原的可行性。采用生物信息学及分子生物学方法,筛选获得1条泛宿主新型Th细胞表位多肽和3条PCV2特异的含有Th细胞抗原表位的多肽序列,然后将这4条Th细胞多肽氨基酸序列与筛选自ORF2Cap1上的1条B细胞表位多肽序列进行串联组合,密码子优化,插入酶切位点、终止密码子,然后进行密码子适应指数和分布频率分析,预测可以实现高效表达后再进行化学合成。合成的P1多肽抗原连接到pET-30a表达载体,并转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,构建表达工程菌BL21(DE3)pLysS-pET-30a-P1。经IPTG诱导表达后P1可实现高效表达,SDS-PAGE鉴定表达量,Western Blot鉴定其生物活性,然后分别免疫小鼠和猪,测定小鼠免疫后的抗体水平以及猪免疫后P1合成多肽抗原对外周血淋巴细胞的刺激增殖情况。结果表明,设计合成表达的PCV2P1多肽抗原序列,密码子适应性指数为0.89,能够实现高水平表达,目的片段大小约为28.29ku,具有良好的免疫原性;MTT试验结果表明,P1多肽抗原免疫后机体内IFN-γ和IL-4的表达量明显增加,且与对照组差异显著(P<0.05)。这说明P1能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应,为其作为疫苗用抗原的进一步研究奠定了理论基础。 展开更多
关键词 PCV2 th细胞表位多肽 CAP蛋白
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日本血吸虫期别差异基因的Th细胞表位预测及串连多表位的原核表达
3
作者 陈进新 苑纯秀 冯新港 《中国兽医寄生虫病》 2007年第5期1-6,共6页
目的表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)转录本组中筛选获得的候选抗原基因Th细胞表位,以备免疫试验验证,为建立大规模、高通量、快速鉴定日本血吸虫Th细胞表位的方法奠定基础。方法应用数据挖掘技术,按照序列在不同期别转录本的数... 目的表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)转录本组中筛选获得的候选抗原基因Th细胞表位,以备免疫试验验证,为建立大规模、高通量、快速鉴定日本血吸虫Th细胞表位的方法奠定基础。方法应用数据挖掘技术,按照序列在不同期别转录本的数量,从Feng L iu等公布的转录本组EST序列中筛选出期别差异表达基因,选择具有完整可读框的序列作为抗原候选基因,其所编码蛋白按照有无信号肽和跨膜结构分为:信号肽跨膜结构组、非信号肽、跨膜结构组序列组。对编码蛋白应用表位预测服务器PRED-BALB/c、SYFPEIT、MHCPred、Rankpep分别对I-Ad、I-Ed、I-Ak、I-Ek型MHC分子进行表位预测。各期别各组筛选出5条最优混合预测表位。选择童虫期信号肽和跨膜结构组(m ep1)和非信号肽、跨膜结构组序列组(m ep2)的各5条最优15肽表位,分别设计并合成其编码核苷酸,克隆到原核表达载体pET-28 a(+)进行表达、纯化。结果筛选到不同期别差异表达基因166条。表位预测后,总共筛选出40条最优混合表位,各期别各组5条。将童虫期目的基因m ep1和m ep2成功合成和克隆到了表达载体pET-28 a(+),目的基因m ep1表达量很高,而m ep2未见表达,纯化得到m ep1表达蛋白。结论成功表达了串连抗原表位,为进一步分析其免疫原性、鉴定出有效表位做好了准备。 展开更多
关键词 日本血吸虫 转录本组 th细胞表位 预测 表达
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单纯疱疹病毒Ⅰ型的Th细胞和B细胞表位重组核酸疫苗的构建及真核表达 被引量：2
4
作者 刘贤洁 孙原 马小力 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期796-798,802,共4页
目的构建单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)糖蛋白B(g B)和糖蛋白D(g D)的Th细胞和B细胞表位重组串联核酸疫苗,并鉴定其真核表达。方法利用生物信息学分析软件预测HSV-1 g B和g D的Th细胞表位和B细胞表位,结合已发表文献,设计合成HSV-1的Th细胞和... 目的构建单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)糖蛋白B(g B)和糖蛋白D(g D)的Th细胞和B细胞表位重组串联核酸疫苗,并鉴定其真核表达。方法利用生物信息学分析软件预测HSV-1 g B和g D的Th细胞表位和B细胞表位,结合已发表文献,设计合成HSV-1的Th细胞和B细胞表位重组串联抗原基因(Th/B基因)。将Th/B基因定向克隆入真核表达载体p VAX1,构建真核表达质粒p VAX1-Th/B。用制备的质粒转染COS-7细胞,裂解细胞后经Western blot鉴定其蛋白表达。结果预测得到了HSV-1 g B和g D的Th细胞和B细胞表位,成功构建真核表达质粒p VAX1-Th/B,经测序确认序列正确。SDS-PAGE分离出相应大小的蛋白表达片段,经Western blot鉴定并证实该重组核酸疫苗能够在体外真核细胞中表达。结论成功构建HSV-1 Th细胞和B细胞表位重组串联核酸疫苗,并能够在体外真核细胞中表达,为HSV-1核酸疫苗的进一步研究打下基础。 展开更多
关键词 单纯疱疹病毒 th细胞和B细胞表位 核酸疫苗
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重组产气荚膜梭菌ε毒素三点突变体的融合表达及其免疫活性分析 被引量：8
5
作者 杜吉革 张秀坤 +8 位作者 朱真 薛麒 李启红 印春生 彭小兵 王磊 姚文生 康凯 陈小云 《中国兽药杂志》 2018年第7期28-34,共7页
为获得并评价重组产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)三点突变体蛋白的毒力及免疫活性,对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,同时引入包括第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,及第106位组氨酸突变为脯氨酸共3个氨基酸突变,并在该基因5'... 为获得并评价重组产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)三点突变体蛋白的毒力及免疫活性,对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,同时引入包括第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,及第106位组氨酸突变为脯氨酸共3个氨基酸突变,并在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNETXm3。随后,将该基因片段克隆至原核表达载体p ET30a-(+),转染BL21(DE3)菌诱导表达、纯化,从而获得重组蛋白,进而利用Western blot方法检测重组蛋白与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)及小鼠的毒力。最后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果显示,重组蛋白主要以包涵体的形式存在,且能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;100μg/m L的重组蛋白未显示细胞毒性;6.25 mg/kg剂量的重组蛋白对小鼠无致死性;每毫升的一免抗血清可中和80~120个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和750~1100个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。试验表明,产气荚膜梭菌ETX三点突变体的毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌ε毒素 突变体 th细胞表位 鞭毛蛋白 抗原性
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重组产气荚膜梭菌β毒素突变体的表达与免疫保护性分析 被引量：1
6
作者 杜吉革 朱真 +9 位作者 徐中清 李倩琳 姚文生 李启红 印春生 杨柳 付利芝 陈小云 刘莹 薛麒 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期2794-2801,共8页
旨在获得产气荚膜梭菌β毒素(CPB)的重组突变体,并评价其毒力及免疫保护性。对已知的产气荚膜梭菌CPB编码基因进行优化设计,同时引入4个氨基酸突变位点,分别是第212位的精氨酸突变为谷氨酸,第268位的亮氨酸突变为甘氨酸,266位的酪氨酸和... 旨在获得产气荚膜梭菌β毒素(CPB)的重组突变体,并评价其毒力及免疫保护性。对已知的产气荚膜梭菌CPB编码基因进行优化设计,同时引入4个氨基酸突变位点,分别是第212位的精氨酸突变为谷氨酸,第268位的亮氨酸突变为甘氨酸,266位的酪氨酸和275位的色氨酸突变为丙氨酸。此外,在该基因5′端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端的编码序列,经人工合成获得重组基因片段(GTF_(N)CPB_(m4))。将GTF_(N)CPB_(m4)克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rTF_(N)CPB_(m4)。利用Western blot方法检测rTF_(N)CPB_(m4)与C型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性,并检测rTF_(N)CPB_(m4)对小鼠的毒力。随后,以rTF_(N)CPB_(m4)免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清对C型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。结果表明,rTF_(N)CPB_(m4)主要以包涵体的形式表达且能与C型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。小鼠安全性试验显示,50μg的rTF_(N)CPB_(m4)对小鼠仍无致死性;免疫rTF_(N)CPB_(m4)后,每毫升家兔二免抗血清可中和10~20个小鼠最小致死量(MLD)的C型产气荚膜梭菌毒素;1个家兔MLD的C型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rTF_(N)CPB_(m4)在丧失毒力的同时保留了良好的免疫原性,从而为C型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的数据。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌CPB 突变 th细胞表位 鞭毛蛋白 毒力 免疫保护性
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重组产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达与免疫保护力评价 被引量：2
7
作者 杜吉革 朱真 +8 位作者 薛麒 赵俊杰 彭小兵 张秀坤 李启红 印春生 姚文生 康凯 陈小云 《中国兽药杂志》 2018年第9期1-8,共8页
为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的重组突变体,并评价其毒力和免疫原性,对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56位和第130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天... 为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的重组突变体,并评价其毒力和免疫原性,对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56位和第130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变。此外,在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNCPAm4。将GTFNCPAm4克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rTF_NCPA_(m4)。利用Western blot方法检测rTF_NCPA_(m4)与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并检测该蛋白的卵磷脂酶和溶血活性以及对小鼠的毒力。随后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化,免疫家兔,检测兔血清的中和抗体效价。二免后21 d,对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rTF_NCPA_(m4)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rTF_NCPA_(m4)主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素产生血清反应;体外实验显示,rTF_NCPA_(m4)无卵磷脂酶和溶血活性;小鼠安全性实验显示,5.5 mg/kg剂量的rTF_NCPA_(m4)对小鼠无致死性;免疫重组蛋白后,每毫升的一免抗血清可中和10个MLD、二免抗血清可中和40个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上数据说明,表达的CPA重组突变体蛋白具有良好的安全性和免疫原性,为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的实验数据。 展开更多
关键词 A型产气荚膜梭菌CPA 突变 th细胞表位 鞭毛蛋白 重组表达 毒力 抗原性
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HBV新型免疫原的设计、合成及免疫原性研究 被引量：30
8
作者 吴玉章 刘茂昌 +1 位作者 贾正才 邹丽云 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第10期919-923,共5页
目的　探讨如何将表位构建成有效免疫原。方法　以Pre S( 2 ) 蛋白两优势性B细胞表位和HBcAg两Th细胞表位为基础 ,设计、合成了 2种MAP多肽 ,以此两MAP肽为免疫原免疫兔和小鼠 ,观察体液免疫反应。结果　此两种MAP多肽均比Pre S( 2 ) ... 目的　探讨如何将表位构建成有效免疫原。方法　以Pre S( 2 ) 蛋白两优势性B细胞表位和HBcAg两Th细胞表位为基础 ,设计、合成了 2种MAP多肽 ,以此两MAP肽为免疫原免疫兔和小鼠 ,观察体液免疫反应。结果　此两种MAP多肽均比Pre S( 2 ) 蛋白诱发更高抗体滴度 ;Th细胞表位引入可显著增强反应强度。结论　增加肽抗原结构复杂性可提高其免疫原性 ,其表位排列以B细胞表位在赖氨酸核心外侧为佳 。 展开更多
关键词 乙型肝炎 HBV MAP B细胞表位 th细胞表位
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