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基于SYBR GreenⅡ的BVDV NS3基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
1
作者 李阳 张世勋 +4 位作者 赫鸣睿 刘珊珊 岳山 刘宇 朱战波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2025年第2期23-31,共9页
为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显... 为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显示,筛选出1对特异性好的引物,CFX96和猪警-2000 qRT-PCR的标准品最小检出值分别为1×10^(1)copies·μL^(-1)和1×10^(2) copies·μL^(-1),特异性和重复性均良好,且临床血清样本的检测结果准确、一致。研究为BVDV检测提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 NS3基因 实时荧光定量pcr SYBR GreenⅡ
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鸭瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用
2
作者 于江玮 程慧敏 +4 位作者 林健 杨宝琳 黄程 杨志远 胡格 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期765-773,共9页
为建立一种鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法,基于DPV US 6基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒DPV-US6标准品,对方法敏感性、特异性和重复性进行评价,并应用于DPV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增... 为建立一种鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法,基于DPV US 6基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒DPV-US6标准品,对方法敏感性、特异性和重复性进行评价,并应用于DPV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖及人工感染鸭器官组织上分布规律研究。结果显示,成功建立了DPV TaqMan荧光定量PCR检测方法,该方法最低检测限可以达到10 copies·μL^(-1),与番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭坦布苏病毒、鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭甲型肝炎病毒(I型和III型)和鸭衣原体均无交叉反应,批间和批内变异系数均小于2.0%。DPV-AX株感染CEF细胞后,病毒核酸拷贝数检测结果表明,4~8 h病毒增殖缓慢,12~60 h迅速上升,60 h达到最高峰,72~144 h逐渐下降,与TCID 50法测定的病毒滴度相比,两种检测方法具有良好相关性,可实现拷贝数替代TCID 50。DPV人工感染鸭组织脏器的病毒载量分布检测表明,肝脏中的病毒载量最高。本试验建立的检测方法为研究DPV-AX株在CEF上的增殖规律提供工具。 展开更多
关键词 鸭瘟病毒 US 6基因 taqman探针 荧光定量pcr 增殖规律 人工感染
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唇形后口虫SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用
3
作者 郝文悦 王锦锦 +9 位作者 葛建龙 李彬 王印庚 廖梅杰 荣小军 赵宏晶 江敏棋 赵文广 牛立成 潘娇 《渔业科学进展》 北大核心 2025年第3期183-193,共11页
后口虫病是近年来影响刺参(Apostichopus japonicus)养殖效益的重要病害种类之一。唇形后口虫(Boveria labialis)是刺参后口虫病的病原。由于缺乏针对该物种的快速、准确的检测方法,研究人员难以系统解析该病原体的传播途径。本研究以... 后口虫病是近年来影响刺参(Apostichopus japonicus)养殖效益的重要病害种类之一。唇形后口虫(Boveria labialis)是刺参后口虫病的病原。由于缺乏针对该物种的快速、准确的检测方法,研究人员难以系统解析该病原体的传播途径。本研究以测序获得的唇形后口虫部分线粒体基因组序列为基础,根据nad10基因序列设计唇形后口虫引物,建立其SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并对刺参不同养殖区和不同养殖模式下养殖系统中唇形后口虫载量进行检测分析。结果显示,设计的唇形后口虫引物在质粒标准品4.05×10^(1)~4.05×10^(9) copies/μL范围内建立的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数R^(2)=0.997,熔解曲线呈现单一峰,无引物二聚体或非特异性扩增;灵敏度实验最低检测限为40.5 copies/μL;所设计的引物仅对唇形后口虫出现特异性扩增,对海洋尾丝虫(Uronema marinum)、贪食纤口虫(Chaenea vorax)、僧帽肾形虫(Colpoda cucullus)和多小核草履虫(Paramecium multi-micronuleatum)无交叉反应;重复性实验中各浓度的批内和批间Ct值均一性较高,批内实验变异系数(CV)值为0.32%~0.82%,批间实验CV值为0.40%~0.88%,稳定性较好。利用本方法对4种刺参养殖模式不同养殖区的环境样品和饲料进行检测,结合镜检结果对比分析发现,海水中唇形后口虫DNA载量与刺参体内唇形后口虫量呈中度正相关(R=0.563),底泥、附着物样品中的唇形后口虫DNA载量与刺参体内唇形后口虫量呈高度正相关(R=0.931)。推测,鲜海泥是唇形后口虫传播的重要载体之一。本研究结果可为唇形后口虫的快速检测、传播途径解析和防控提供参考。 展开更多
关键词 刺参 寄生性疾病 唇形后口虫 实时荧光定量pcr检测 传播途径
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实时荧光定量PCR法检测左旋多巴中大肠埃希菌宿主细胞DNA残留量
4
作者 许冰瑜 刘妍 +2 位作者 郭心瑶 严方 孙桂斌 《中国药科大学学报》 北大核心 2025年第2期176-182,共7页
采用实时荧光定量PCR技术,建立特异性强、灵敏度高的左旋多巴中大肠埃希菌(Escherichiacoli)宿主细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证和初步应用。以大肠埃希菌中的相对保守的E.coli MB6菌株16S核糖体RNA基因序列作为目的基因设计多对引... 采用实时荧光定量PCR技术,建立特异性强、灵敏度高的左旋多巴中大肠埃希菌(Escherichiacoli)宿主细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证和初步应用。以大肠埃希菌中的相对保守的E.coli MB6菌株16S核糖体RNA基因序列作为目的基因设计多对引物,通过PCR进行特异性扩增获得目的片段。将目的片段重组至pLENTI-BSD-CON载体构建重组质粒命名为pLENTI-BSD-CON-E.coli-16S,以其为标准品,结合磁珠法提取纯化DNA,建立定量PCR检测方法(SYBR-Green法)。对建立的方法进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限及耐用性的方法学验证,应用于左旋多巴原料药的检测,并与试剂盒检测方法(Taqman探针法)进行比较。建立的定量PCR检测方法(SYBR-Green法)正向引物序列:5'-TTCGATGCAACGCGAAGAAC-3';反向引物序列:5'-GTGTAGCCCTGGTCGTAAGG-3'。以重组质粒作为标准品,DNA质量浓度在10fg/μL~3 ng/μL范围内线性关系良好(R^(2)≥0.98),定量限为10 fg/μL,加标溶液回收率在59.7%~80.7%范围内,RSD均小于30%。应用该法对3批左旋多巴原料药进行检测,DNA残留量均在限度以下。结果表明,建立的检测方法可用于定量检测左旋多巴等由大肠埃希菌作为宿主细胞生产的生物制品的DNA残留量,并且其灵敏度优于试剂盒检测方法。 展开更多
关键词 大肠埃希菌 左旋多巴 构建质粒 实时荧光定量pcr 外源性DNA残留 帕金森病
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生食动物性水产品中单增李斯特氏菌TaqMan实时荧光PCR检测法和国标法的比较研究
5
作者 刘爱芳 郑尔美 +2 位作者 王涵铮 毛展华 朱伟志 《食品安全导刊》 2025年第14期75-83,共9页
目的:针对生食动物性水产品中单增李斯特氏菌的检测需求,系统比较TaqMan实时荧光PCR与国家标准检测法的技术特性,以优化检测流程并提升食源性致病菌监控效率。方法:通过特异性实验筛选TaqMan检测体系的最佳引物探针组合,验证其灵敏度与... 目的:针对生食动物性水产品中单增李斯特氏菌的检测需求,系统比较TaqMan实时荧光PCR与国家标准检测法的技术特性,以优化检测流程并提升食源性致病菌监控效率。方法:通过特异性实验筛选TaqMan检测体系的最佳引物探针组合,验证其灵敏度与检测稳定性;对5类市售生食水产品(泥螺、即食海蜇丝、呛蟹、北极虾、三文鱼)进行检测,评估两种方法的检测效能差异。结果:筛选获得LIS2最优引物探针组合,其检测灵敏度达6×10^(2) CFU·mL^(-1);20 d稳定性实验显示6×10^(3) CFU·mL^(-1)菌悬液的Ct值变异系数为1.89%,稳定性良好。在对20份市售样品的检测中,两种方法阳性检出率完全一致。TaqMan法单样检测耗时较国标法缩短至50 h,但需依赖核酸扩增设备。结论:TaqMan实时荧光PCR适用于大批量样本初筛,建议与噬菌体裂解技术联用实现活菌检测;国标法作为确认方法对阳性样本进行复核评估,可以确保检测合规。研究证实建立“分子初筛-培养确认”的联合检测体系可提升检测效率,为食品微生物快检技术标准化及生食水产品安全监管提供数据支撑。 展开更多
关键词 单增李斯特氏菌 taqman实时荧光pcr 生食动物性水产品 国标法
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调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌叠氮溴化丙锭-实时荧光定量PCR检测方法的建立
6
作者 宋帆 《现代食品》 2025年第7期209-214,共6页
为缩短检测周期,排除死菌DNA的干扰,采用实时荧光定量PCR对调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测。方法:采用叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide,PMA)鉴别死活菌,检测目标菌中的特异性基因片段,构建利用PMA预处理结合实时荧光定量... 为缩短检测周期,排除死菌DNA的干扰,采用实时荧光定量PCR对调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测。方法:采用叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide,PMA)鉴别死活菌,检测目标菌中的特异性基因片段,构建利用PMA预处理结合实时荧光定量PCR的特异性检测方案。结果:在PMA工作浓度为40μg·mL^(-1)、暗孵育时间为10 min、曝光时间为20 min的最佳方案下处理,可在不影响目标活菌正常扩增的同时抑制死菌的干扰。本方法快速准确,检验周期可缩短到48 h,在1.2×10^(3) CFU·mL^(-1)菌量下仍能有效检出目标菌。结论:本方法特异性强、灵敏度高,适用于突发事件中检测调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌。 展开更多
关键词 调理肉制品 小肠结肠炎耶尔森氏菌 叠氮溴化丙锭-实时荧光定量pcr
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牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
7
作者 蒲鹏 李晨露 +2 位作者 张琪 吴发兴 许信刚 《动物医学进展》 北大核心 2024年第2期7-10,共4页
为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan... 为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 taqman荧光定量pcr 检测方法
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鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
8
作者 张玉霞 董雯雯 +2 位作者 袁小远 孟凯 徐怀英 《山东农业科学》 北大核心 2024年第6期128-132,共5页
鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基... 鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。 展开更多
关键词 鸡喉气管炎病毒 TK基因 实时荧光定量pcr 特异性 敏感性 重复性
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基于荧光定量PCR法的蜂蜜鉴别研究
9
作者 王笑语 吴攀 +1 位作者 王承丽 岳万福 《浙江农业科学》 2025年第3期730-736,共7页
本研究探讨实时荧光定量PCR法在鉴别蜂蜜的适用性。采用CTAB法提取蜂蜜样本中的花粉DNA与蜜蜂DNA,利用5种植物与蜜蜂DNA引物探针,采用实时荧光定量PCR法对蜂蜜中的DNA进行检测,以判断不同蜂蜜样品的花粉构成、生产时间、生产地点,对蜂... 本研究探讨实时荧光定量PCR法在鉴别蜂蜜的适用性。采用CTAB法提取蜂蜜样本中的花粉DNA与蜜蜂DNA,利用5种植物与蜜蜂DNA引物探针,采用实时荧光定量PCR法对蜂蜜中的DNA进行检测,以判断不同蜂蜜样品的花粉构成、生产时间、生产地点,对蜂蜜进行谱系分类。采用17种未知来源的蜂蜜进行方法的可行性验证,结果表明该方法可行。本研究对利用分子遗传进行蜂蜜鉴别起到推动及指导作用。 展开更多
关键词 蜂蜜 蜂蜜鉴别 花粉DNA 实时荧光定量pcr 蜜蜂
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实时荧光定量PCR快速检测药品中大肠埃希菌
10
作者 李杰 张华 +3 位作者 林鹏 王家芳 肖艳霞 钱云开 《食品与药品》 2025年第2期126-131,共6页
目的 建立一种药品中大肠埃希菌的实时荧光定量PCR快速检测方法。方法 根据大肠埃希菌malB基因序列,设计通用引物和探针,优化扩增反应体系,进行实时荧光定量PCR扩增,当出现C_t值时,说明供试品中检出大肠埃希菌。结果 大肠埃希菌基因组DN... 目的 建立一种药品中大肠埃希菌的实时荧光定量PCR快速检测方法。方法 根据大肠埃希菌malB基因序列,设计通用引物和探针,优化扩增反应体系,进行实时荧光定量PCR扩增,当出现C_t值时,说明供试品中检出大肠埃希菌。结果 大肠埃希菌基因组DNA检测限可达10^(-3 )ng,药品中大肠埃希菌检测限达3 cfu/g(ml),仅需24 h即可完成检测,采用该方法检测20批药品,结果与药典方法一致。结论 方法检测特异性强、所需时间短、灵敏度高,可作为《中国药典》大肠埃希菌检查法的补充方法。 展开更多
关键词 中国药典 药品 大肠埃希菌 实时荧光定量pcr 检测
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姜荷花苞片实时荧光定量PCR内参基因筛选
11
作者 谭健俊 黄李珊 +2 位作者 周熠玮 徐晔春 叶远俊 《广东农业科学》 2025年第2期108-116,共9页
[目的]筛选适用于姜荷花苞片组织qRT-PCR分析的内参基因,为苞片颜色相关基因功能研究奠定理论基础。[方法]以9个不同颜色的姜荷花品种为试材,根据姜荷花基因组数据选择常用的内参基因,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S... [目的]筛选适用于姜荷花苞片组织qRT-PCR分析的内参基因,为苞片颜色相关基因功能研究奠定理论基础。[方法]以9个不同颜色的姜荷花品种为试材,根据姜荷花基因组数据选择常用的内参基因,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)、泛素蛋白(UBQ)、苹果酸脱氢酶(MDH)、肌动蛋白(Actin)、微管蛋白(TUB)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)8个看家基因,使用ΔCt、geNorm、NormFinder和BestKeeper 4种分析方法评估基因表达的稳定性,通过RefFinder程序综合评价以筛选出姜荷花苞片组织的最佳内参基因。[结果]8个内参基因均扩增出单一主峰,引物标准曲线相关系数R^(2)≥0.98,扩增效率为99.5%~125.0%,PCR产物经1%琼脂糖电泳检测显示条带清晰单一,表明引物设计特异性好。4种不同的算法分析获得的结果排名有差异,其中MDH在ΔCt、geNorm和NormFinder分析中为表达最稳定的内参基因,18S rRNA在BestKeeper分析中为表达最稳定的内参基因。利用RefFinder程序综合评价得出候选内参基因稳定性综合排名,排序依次为MDH>Actin>TUB>18S rRNA>PP2A>GAPDH>UBQ>PAL,表明不同品种姜荷花苞片最佳内参基因是MDH,其次为Actin和TUB,PAL稳定性最差、不适合作为姜荷花苞片组织的内参基因。[结论]MDH可作为不同品种姜荷花苞片组织的稳定内参基因,为后续深入开展姜荷花苞片颜色合成相关基因的表达模式分析提供参考。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 姜荷花 内参基因 苞片颜色 MDH 基因表达模式
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实时荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌的研究
12
作者 刘占生 张莉 王嫘 《中国食品工业》 2025年第5期97-99,共3页
目的:构建快速检测食品中沙门氏菌的实时荧光定量PCR法。方法:以沙门氏菌核酸DNA提取物为模板开展荧光检测实验,建立快速检测手段,用于阳性培养液及食品中沙门氏菌检测分析。结果:该方案能在30批食品样本中成功扩增出沙门氏菌特异性片段... 目的:构建快速检测食品中沙门氏菌的实时荧光定量PCR法。方法:以沙门氏菌核酸DNA提取物为模板开展荧光检测实验,建立快速检测手段,用于阳性培养液及食品中沙门氏菌检测分析。结果:该方案能在30批食品样本中成功扩增出沙门氏菌特异性片段,最低检出浓度15CFU/mL,检测时长<24h。结论:本研究提出的实时荧光定量PCR法具有高效、快速、灵敏、精准的特点,可广泛应用于食品中沙门氏菌的快速筛查与检测,为食品安全监控提供强有力的技术支持。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 沙门氏菌 快速检测
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猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用 被引量：4
13
作者 刘莹 李峰 +3 位作者 殷宗俊 王敬茹 李书光 郑先瑞 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期34-38,共5页
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方... 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 Taq Man探针 实时荧光定量pcr
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荧光定量PCR与传统分离鉴定法检测副溶血性弧菌的对比研究
14
作者 叶慧敏 《食品安全导刊》 2025年第14期93-95,99,共4页
目的:采用荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)与传统分离鉴定法检测副溶血性弧菌,并进行对比研究。方法:收集各类食品样本200份,分别采用荧光定量PCR法和传统分离鉴定法进行副溶血性弧菌检测,对比两种方法的检测阳... 目的:采用荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)与传统分离鉴定法检测副溶血性弧菌,并进行对比研究。方法:收集各类食品样本200份,分别采用荧光定量PCR法和传统分离鉴定法进行副溶血性弧菌检测,对比两种方法的检测阳性率、检测时间、灵敏度、特异性,并分析结果的一致性。结果:荧光定量PCR法检测阳性率为18.5%(37/200),传统分离鉴定法检测阳性率为15.0%(30/200),两种方法阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。荧光定量PCR法平均检测时间为(5.25±1.02)h,显著短于传统分离鉴定法的(4.50±0.51)d,差异有统计学意义(P<0.05)。荧光定量PCR法灵敏度为97.44%,特异性为98.77%;传统分离鉴定法灵敏度为89.74%,特异性为99.38%,两种方法检测结果一致性良好(Kappa=0.823)。结论:对于副溶血性弧菌的检测,荧光定量PCR法具有快速、灵敏的优势,传统分离鉴定法特异性较高且可进行菌株分型。 展开更多
关键词 荧光定量pcr 传统分离鉴定法 副溶血性弧菌 检测对比
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采用实时荧光定量PCR法检测大曲中的3种高温放线菌 被引量：1
15
作者 陈政 柴丽娟 +7 位作者 张晓娟 许泓瑜 史劲松 王松涛 张宿义 沈才洪 许正宏 陆震鸣 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第18期300-308,共9页
建立实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)方法对大曲中3种高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris、T.intermedius和T.daqus)进行特异性定量检测。根据T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus全基因组中特... 建立实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)方法对大曲中3种高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris、T.intermedius和T.daqus)进行特异性定量检测。根据T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus全基因组中特异性单拷贝核心基因recA、mdH、gyrA为参考序列分别设计了一对可扩增278、233、291 bp片段的引物;经特异性、有效性、准确性实验显示,在常见的13种白酒酿造微生物中,引物TV、TI、TD分别可特异性检测T.vulgaris、T.intermedius、T.daqus,检测范围为2.82~8.82 lg copies/μL,加标回收率95%~105%。进一步对大曲发酵过程样品检测,结果显示,T.vulgaris含量在呈现波动趋势,在第5天达到最高,为(6.06±0.02)lg copies/g;T.intermedius含量呈现先上升后下降的趋势,在第7天达到最高,为(6.33±0.13)lg copies/g;T.daqus含量在0~12 d呈现波动趋势,在12~14 d下降,随后一直上升,发酵结束时含量最高,为(7.62±0.02)lg copies/g。该研究建立的RT-qPCR方法可对大曲发酵过程中3种高温放线菌进行特异性鉴定和快速定量,为进一步监测高温放线菌在白酒酿造过程中的功能提供了方法。 展开更多
关键词 大曲 高温放线菌 特异性引物 实时荧光定量pcr
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PRRSV、CSFV、PRV和PCV2四重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：2
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作者 李欣 杨莉 +4 位作者 刘光亮 王文秀 刘海隆 曹宗喜 张艳 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期7-14,共8页
为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Ma... 为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Man探针,并进行反应体系优化,敏感性、特异性验证,建立了同时检测上述4种病原的四重实时荧光定量PCR。结果显示,所建立的四重荧光PCR扩增效率(E)、相关系数(R^(2))及曲线斜率均在正常范围内,检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2 E值、R^(2)、斜率分别为92.9%、0.998、-3.504,90.7%、0.998、-3.566,94.3%、0.996、-3.466,94.2%、0.997及-3.470。PRRSV、CSFV、PRV、PCV2重组质粒最低检出限分别达到10^(2)、10^(2)、10^(2)、10^(3) copies/μL;四重qPCR反应体系中的多条引物间不发生交叉反应,经评价该方法特异性良好;批内和批间重复性试验结果显示,变异系数(CV)均在1%以下,具有良好的重复性。分别使用该方法和相应的国标荧光定量检测法对采集的298份临床样品进行检测对比,两种方法检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2阳性符合率分别为96.08%、96.38%、100%、94.95%,均在94%以上。结果表明,建立的检测方法方便、灵敏、高效、特异性强,适用于猪呼吸道疾病病原学、流行病学研究以及临床病例的诊断,并为猪呼吸道疾病的预防和控制提供技术支撑。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪瘟病毒 猪伪狂犬病病毒 猪圆环病毒2型 四重实时荧光定量pcr
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猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用
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作者 杨奕 吴发兴 +4 位作者 康京丽 孙洪涛 王志亮 许信刚 张琪 《动物医学进展》 北大核心 2024年第2期75-79,共5页
旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的P... 旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2 taqman探针 荧光定量pcr
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奶牛乳房炎大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌及奇异变形杆菌三重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 朱安基 李世宏 +4 位作者 徐浩 杨亚军 白莉霞 李剑勇 许笑 《动物医学进展》 北大核心 2024年第12期19-25,共7页
为建立检测奶牛乳房炎主要革兰氏阴性致病菌的快速诊断方法,选择大肠埃希氏菌phoa基因,肺炎克雷伯菌rcsa基因以及奇异变形杆菌urer基因设计合成特异性引物与探针,建立了奶牛乳房炎大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌及奇异变形杆菌三重Taq Man... 为建立检测奶牛乳房炎主要革兰氏阴性致病菌的快速诊断方法,选择大肠埃希氏菌phoa基因,肺炎克雷伯菌rcsa基因以及奇异变形杆菌urer基因设计合成特异性引物与探针,建立了奶牛乳房炎大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌及奇异变形杆菌三重Taq Man荧光定量PCR检测方法。该方法可在120 min内通过一管反应体系特异性鉴定出3种常见的奶牛乳房炎革兰氏阴性致病菌,最低检测限可达1×10^(1)copies/μL且特异性和重复性良好,以此方法对80份奶牛乳房炎生乳样进行检测,大肠埃希氏菌检出率为35%(28/80),肺炎克雷伯菌检出率为21.2%(17/80),奇异变形杆菌检出率为11.2%(9/80)。结果表明,所建立的奶牛乳房炎大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌及奇异变形杆菌三重Taq Man荧光定量PCR检测方法具有操作简单、特异性强、灵敏度高的特点,适用于奶牛乳房炎的临床诊断,对革兰氏阴性致病菌的快速检测及合理用药具有指导意义。 展开更多
关键词 奶牛乳房炎 实时荧光定量pcr 大肠埃希氏菌 肺炎克雷伯菌 奇异变形杆菌
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猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：9
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作者 岳锋 朱艳平 +1 位作者 银梅 王选年 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第6期18-22,共5页
根据GenBank中猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人... 根据GenBank中猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人工感染CSFV后不同时期猪血浆中CSFV的载量。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,R2=0.999;敏感性高,最低检测限为1×101拷贝/μL;特异性强,与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%。人工感染CSFV后第7天猪血浆中CSFV载量达到峰值,之后逐渐降低。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、重复性好等优点,为CSFV的定量分析及临床诊断奠定基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 实时荧光定量pcr taqman探针
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枣疯病植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：9
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作者 韩剑 罗明 +2 位作者 徐金虹 王同仁 张祥林 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期111-116,共6页
根据枣疯病植原体16SrDNA基因保守区域设计、合成特异性引物和TaqMan探针,以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立并优化了对枣疯病植原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。对优化后的方法进行灵敏度、特异性及稳定性评价,制作了标准曲... 根据枣疯病植原体16SrDNA基因保守区域设计、合成特异性引物和TaqMan探针,以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立并优化了对枣疯病植原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。对优化后的方法进行灵敏度、特异性及稳定性评价,制作了标准曲线。结果显示,制作的标准曲线有极好的线性关系,相关系数(r2)达到0.998,建立的实时荧光定量PCR检测方法能够特异性地检测枣疯病植原体,能检测到60拷贝的质粒DNA。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异性、重复性好,不仅能够实现对枣疯病植原体的快速检测,而且为实现从病原定量水平上对枣疯病病情分级奠定了基础。 展开更多
关键词 枣疯病植原体 taqman探针 实时荧光定量pcr 检测
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