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FHV-1和FCV双重TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立和应用 被引量：1
1
作者 静争 金红岩 +4 位作者 王春艳 王文杰 沈佳宇 范志坚 侯绍华 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第5期58-64,共7页
为了快速、便捷、准确诊断猫疱疹病毒1型(FHV-1)和猫杯状病毒(FCV),本试验选取FHV-1的糖蛋白C(GC)基因(Gen Bank登录号:OR504662)和FCV的衣壳蛋白1(VP1)基因(Gen Bank登录号:OP904215)以及一段猫外源性内标序列设计并合成引物和探针,构... 为了快速、便捷、准确诊断猫疱疹病毒1型(FHV-1)和猫杯状病毒(FCV),本试验选取FHV-1的糖蛋白C(GC)基因(Gen Bank登录号:OR504662)和FCV的衣壳蛋白1(VP1)基因(Gen Bank登录号:OP904215)以及一段猫外源性内标序列设计并合成引物和探针,构建重组阳性质粒标准品p MD19-T-G、p MD19-T-P和p MD19-T-C,建立了双重Taq Man实时荧光定量PCR方法。以重组阳性质粒标准品绘制标准曲线,验证该方法的特异性、灵敏性和重复性,利用建立的方法检测33份临床样本评估该方法的可行性,并对泰州市292份流浪猫眼口鼻分泌物样本进行检测。结果显示,本试验建立的双重Taq Man实时荧光定量PCR方法具有良好的线性关系,对其他病原无交叉反应,对FHV-1和FCV的最低检测限均为1×10^(1)copies/μL,组内和组间的变异系数均小于2%;对33份临床样本的检测结果显示,FHV-1和FCV的阳性符合率为100%,FHV-1总符合率为93.9%,FCV总符合率为90.9%;292份流浪猫眼口鼻分泌物样本中,FHV-1阳性率为20.9%,FCV阳性率为46.2%,FHV-1和FCV混合阳性率为12.0%。结果表明,本试验建立的双重Taq Man实时荧光定量PCR,特异性强、灵敏度高、重复性好,为临床猫呼吸系统疾病病原鉴别诊断和宠物健康监测提供了技术支持。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒1型(FHV-1) 猫杯状病毒(FCV) 实时荧光定量pcr
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猪细小病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立
2
作者 仇德洋 郑佳 +8 位作者 曹志 李铭凯 巩立媛 姚方方 杜建才 李国超 赵欣如 李占坤 吕延飞 《中国动物检疫》 2025年第10期109-114,共6页
为创建一种快速准确的猪细小病毒(PPV)检测方法,根据PPV NS1基因保守序列设计引物与探针,建立了特异、敏感且可绝对定量的TaqMan实时荧光定量PCR方法。该方法的检测Ct值与标准质粒浓度(1.08×10^(7)~1.08×10^(1)copies/μL)具... 为创建一种快速准确的猪细小病毒(PPV)检测方法,根据PPV NS1基因保守序列设计引物与探针,建立了特异、敏感且可绝对定量的TaqMan实时荧光定量PCR方法。该方法的检测Ct值与标准质粒浓度(1.08×10^(7)~1.08×10^(1)copies/μL)具有良好的线性关系,Y=-3.4475x+35.057,相关系数R^(2)=0.9975;灵敏度高,对PPV质粒最低检测限为1.08×10~1 copies/μL;重复性好,对1.08×10^(7)、1.08×10^(4)、1.08×10^(2)copies/μL标准质粒批内与批间重复性试验变异系数均低于1%;特异性强,不与猪瘟病毒(CFSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)发生交叉反应;与巢式PCR方法同步检测临床样品的总符合率为99%。结果表明,本试验建立的方法特异性强、敏感性高,为PPV感染的实验室诊断及流行病学调查提供了重要的技术支持。 展开更多
关键词 猪细小病毒 NS1蛋白 taqman实时定量荧光pcr
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B型禽偏肺病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量：1
3
作者 沈海强 车艳杰 +3 位作者 宋新宇 高冉 付旭彬 金天明 《中国家禽》 北大核心 2024年第9期121-127,共7页
试验旨在开发一种特异性检测B亚型禽偏肺病毒(aMPV-B)的方法。研究参照GenBank中的aMPV-G基因序列设计一对特异性引物,建立aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法,优化该方法的反应条件,建立标准曲线,进行特异性、重复性和敏感性试验,并将该方... 试验旨在开发一种特异性检测B亚型禽偏肺病毒(aMPV-B)的方法。研究参照GenBank中的aMPV-G基因序列设计一对特异性引物,建立aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法,优化该方法的反应条件,建立标准曲线,进行特异性、重复性和敏感性试验,并将该方法用于临床样品的检测。结果显示:建立的TaqMan荧光定量PCR方法只能检测出B亚型aMPV,其敏感性能达到1.34×10^(1) copies/µL,斜率为-3.346,截距为40.01,相关系数(R2)为1.00,循环阈值(Ct)与模板拷贝数之间呈现良好的相关性;临床样品检测结果显示,该方法检测出18份样品阳性,而普通PCR仅检测出10份阳性。综上所述,建立的aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法在样品检测中表现出良好的特异性和较高的敏感性,适用于临床样品的aMPV-B检测。 展开更多
关键词 B型禽偏肺病毒 G基因 实时荧光定量pcr TapMan荧光探针
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鸭瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立 被引量：6
4
作者 万春和 刘荣昌 +6 位作者 陈翠腾 程龙飞 施少华 傅光华 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2018年第6期722-728,共7页
根据鸭瘟病毒(DEV) gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10~1～1.0×10~6拷贝·μL^(-1)时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线... 根据鸭瘟病毒(DEV) gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10~1～1.0×10~6拷贝·μL^(-1)时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线性扩增,其标准曲线方程为:y=-3.480x+37.955,扩增相关系数为0.999;敏感性强,最低检测限为10拷贝·μL^(-1);特异性好,仅对DEV强毒株和弱毒活疫苗株检测到阳性扩增信号,对鸭源其他传染病病原(番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.62%～1.14%和0.69%～2.40%.对临床送检疑似DEV感染的14份样品进行检测,并与常规PCR方法、病毒分离鉴定进行比较,阳性率分别为85.71%(12/14)、71.43%(10/14)和57.14%(8/14);且与常规PCR方法、病毒分离鉴定的阳性符合率均为100%.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法,可用于开发DEV快速诊断试剂盒,用于开展DEV流行病学调查. 展开更多
关键词 鸭瘟病毒 GE基因 taqman探针 实时荧光定量pcr方法
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鸭甲肝病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立 被引量：1
5
作者 万春和 陈翠腾 +6 位作者 施少华 程龙飞 傅光华 刘荣昌 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《中国家禽》 北大核心 2019年第15期23-27,共5页
研究利用全基因合成技术合成DHAV-2全基因组序列,并以此为标准品建立检测DHAV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:建立的方法敏感性高,最低检测限仅为33.7拷贝/μL;特异性强,对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、禽... 研究利用全基因合成技术合成DHAV-2全基因组序列,并以此为标准品建立检测DHAV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:建立的方法敏感性高,最低检测限仅为33.7拷贝/μL;特异性强,对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,N-DRV)、鸭源禽Ⅰ型副黏病毒(Duck-origin avian paramyxovirus type 1,APMV-1)和禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)均无交叉扩增;重复性佳,组内和组间变异系数最高分别为1.68%和2.19%。对2018年福建地区临床收集的128份鸭源病料进行检测,结果未检测DHAV-2感染阳性。研究结果为DHAV-2的快速检测试剂盒研究及储备DHAV-2检测技术奠定了基础。 展开更多
关键词 鸭甲肝病毒2型 taqman 实时荧光定量pcr
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鸡滑液囊支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量：4
6
作者 李梅 王柏林 +6 位作者 岳筠 杨美 宋春 朱二鹏 单春兰 文明 程振涛 《动物医学进展》 北大核心 2023年第3期15-20,共6页
为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R^(2)=1.000,斜... 为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R^(2)=1.000,斜率S=-3.452,截距I=43.950,表明标准质粒浓度与Ct值的线性关系良好;该方法除MS外,其他参考菌(毒)株均无目的基因扩增,其最小检测浓度为1×10^(1)copies/μL,组内重复及组间重复的变异系数均低于0.1;运用所建立方法与普通PCR方法对4份疑似MS临床样本进行检测,检测结果完全相符合;应用该方法对贵州省7个地区107份疑似MS样本进行检测,发现总体阳性率为26.17%。说明建立的方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床检测。 展开更多
关键词 鸡滑液囊支原体 vlhA基因 taqman探针 实时荧光定量pcr
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鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及遗传进化分析 被引量：1
7
作者 安乐乐 刘倩芸 +2 位作者 蓝秋菊 罗迅 赵永清 《江西农业大学学报》 北大核心 2025年第1期167-177,共11页
【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病... 【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病学调查提供技术平台。【方法】依据GenBank公布鸽腺病毒Ⅰ型Hexon基因保守区设计引物探针并构建重组质粒pCE2-TA-PiAdV-Ⅰ;优化反应体系和程序,绘制标准曲线、特异性、敏感性和重复性评价,建立鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法;扩增测序阳性临床样品的Hexon基因,使用MEGA5.0进行进化树构建及同源性分析。【结果】该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法标准曲线y=-3.1081x+37.374,线性相关系数R2为0.9977,线性关系良好;与鸽疱疹病毒、鸽圆环病毒等鸽子其他常见病毒无交叉反应,具有良好的特异性;最低检测拷贝数为14.6 copies/μL,敏感性是常规PCR方法的10倍,具有高敏感性;组内和组间变异系数均低于1.1%,重复性好。通过检测112份鸽子病料样品,该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法检测阳性率为69.64%(78/112),并且高于常规PCR方法阳性检出率65.18%(73/112)。此外,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法与常规PCR方法的阳性符合率为100%,总体符合率为95.54%。3条测序毒株与Ⅰ型鸽腺病毒参考毒株同源性为99.47%~99.71%,遗传关系高度接近,表明可能由同一个原始毒株进化而来。【结论】研究建立的鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法线性关系良好、特异性强、敏感性高及重复性好,可快速高效检测出临床样品中的PiAdV-Ⅰ。此外,所扩增序列能够用于分析临床毒株遗传进化特征,有助于快速准确诊断鸽腺病毒感染及疫苗研发提供参考依据。 展开更多
关键词 鸽腺病毒Ⅰ型 Hexon基因 taqman探针实时荧光定量pcr 遗传进化分析 临床检测 流行病学调查
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盖塔病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
8
作者 顾志刚 郭洁真 +4 位作者 王子涵 孙彤 陈鸿军 孙竹筠 陈丹清 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期112-118,共7页
盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒,可通过蚊虫传播感染人畜,导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状,可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列,设计3组引... 盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒,可通过蚊虫传播感染人畜,导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状,可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列,设计3组引物探针,筛选出最佳的引物探针,建立一种灵敏度高、特异性强的针对盖塔病毒的TaqMan探针实时荧光定量RTPCR检测方法。对该方法进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品检测。标准曲线Ct值与相应质粒标准品浓度存在良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9989;对含GETV基因的重组质粒pCDNA3.1-nsP1体外转录RNA进行敏感性试验,最低检出限达10 copies,是普通RT-PCR方法的1000倍,敏感性高;与PRRSV、CSFV与PEDV的核酸不发生交叉反应,特异性好;变异系数小于2%,重复性好。本研究建立了一种敏感、特异的GETV检测方法,对GETV的快速诊断具有重要意义。 展开更多
关键词 盖塔病毒 nsP1 taqman探针 实时荧光定量RT-pcr
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基于SYBR GreenⅡ的BVDV NS3基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：2
9
作者 李阳 张世勋 +4 位作者 赫鸣睿 刘珊珊 岳山 刘宇 朱战波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2025年第2期23-31,共9页
为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显... 为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显示,筛选出1对特异性好的引物,CFX96和猪警-2000 qRT-PCR的标准品最小检出值分别为1×10^(1)copies·μL^(-1)和1×10^(2) copies·μL^(-1),特异性和重复性均良好,且临床血清样本的检测结果准确、一致。研究为BVDV检测提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 NS3基因 实时荧光定量pcr SYBR GreenⅡ
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睡眠嗜组织菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用
10
作者 李富祥 高华峰 +1 位作者 赵文华 宋建领 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第7期706-712,共7页
睡眠嗜组织菌(H.somni)是牛、绵羊和山羊的重要致病菌。目前,国内尚无H.somni荧光定量PCR(qPCR)检测方法,为建立H.somni TaqMan qPCR检测方法,本研究根据H.somni 16S rRNA基因序列设计1对引物和1条TaqMan探针,通过反应体系和反应条件的... 睡眠嗜组织菌(H.somni)是牛、绵羊和山羊的重要致病菌。目前,国内尚无H.somni荧光定量PCR(qPCR)检测方法,为建立H.somni TaqMan qPCR检测方法,本研究根据H.somni 16S rRNA基因序列设计1对引物和1条TaqMan探针,通过反应体系和反应条件的优化,初步建立了H.somni TaqMan qPCR方法。利用建立的方法检测39种牛、绵羊和山羊源的不同细菌,结果显示该方法仅能检测到H.somni,而与溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和海藻百伯史坦菌等38种细菌均无交叉反应,特异性较强。利用建立的方法检测6.3×10^(5)拷贝/μL~6.3×10^(-1)拷贝/μL的重组质粒标准品pMD-16S,结果显示该方法对其的检测限为6.3拷贝/μL,敏感性较高。以6.3×10^(5)拷贝/μL~6.3×10^(3)拷贝/μL的重组质粒标准品pMD-16S为模板,利用建立的方法进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%,重复性较好。利用建立的TaqMan qPCR和文献报道的普通PCR方法同时检测124份患呼吸道疾病牛、山羊和绵羊的肺脏样品和鼻拭子样品,结果显示二者对H.somni的检出率分别为11.29%(14/124)和10.48%(13/124),TaqMan qPCR方法与普通PCR方法的总符合率、阳性符合率和阴性符合率分别为99.19%(123/124)、100%(13/13)和99.10%(110/111),表明该TaqMan qPCR方法的准确性较高。本研究首次在国内建立检测H.somni的qPCR方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性好,为牛、绵羊和山羊H.somni高通量的快速检测提供新的技术支撑。 展开更多
关键词 睡眠嗜组织菌 taqman荧光定量pcr 牛 绵羊 山羊
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鸭瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
11
作者 于江玮 程慧敏 +4 位作者 林健 杨宝琳 黄程 杨志远 胡格 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期765-773,共9页
为建立一种鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法,基于DPV US 6基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒DPV-US6标准品,对方法敏感性、特异性和重复性进行评价,并应用于DPV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增... 为建立一种鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法,基于DPV US 6基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒DPV-US6标准品,对方法敏感性、特异性和重复性进行评价,并应用于DPV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖及人工感染鸭器官组织上分布规律研究。结果显示,成功建立了DPV TaqMan荧光定量PCR检测方法,该方法最低检测限可以达到10 copies·μL^(-1),与番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭坦布苏病毒、鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭甲型肝炎病毒(I型和III型)和鸭衣原体均无交叉反应,批间和批内变异系数均小于2.0%。DPV-AX株感染CEF细胞后,病毒核酸拷贝数检测结果表明,4~8 h病毒增殖缓慢,12~60 h迅速上升,60 h达到最高峰,72~144 h逐渐下降,与TCID 50法测定的病毒滴度相比,两种检测方法具有良好相关性,可实现拷贝数替代TCID 50。DPV人工感染鸭组织脏器的病毒载量分布检测表明,肝脏中的病毒载量最高。本试验建立的检测方法为研究DPV-AX株在CEF上的增殖规律提供工具。 展开更多
关键词 鸭瘟病毒 US 6基因 taqman探针 荧光定量pcr 增殖规律 人工感染
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兔轮状病毒TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用
12
作者 李嘉逸 伍孟婷 +10 位作者 陈萌萌 仇汝龙 魏后军 范志宇 胡波 葛雷 李一鸣 徐为中 董海龙 宋艳华 王芳 《江苏农业科学》 北大核心 2025年第13期210-215,共6页
为了能够快速、灵敏地检测出发病家兔临床样本中的兔轮状病毒(Lapine rotavirus,LaRV),根据GenBank已登录的LaRV非结构蛋白5(NSP5)基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了一种TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法并进行了初步应... 为了能够快速、灵敏地检测出发病家兔临床样本中的兔轮状病毒(Lapine rotavirus,LaRV),根据GenBank已登录的LaRV非结构蛋白5(NSP5)基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了一种TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法并进行了初步应用。结果表明,阳性质粒标准品所建立的标准曲线在使用稀释度为1×10^(7) copies/μL至1×10^(2) copies/μL之间具有良好的线性关系,r 2为0.999,扩增效率为98.781%;该方法对LaRV具有高度特异性,与兔出血症病毒1型、兔出血症病毒2型及兔多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌等其他病原间无交叉反应;该方法灵敏度高,最低检测值为1×10^(2) copies/μL,比普通PCR灵敏度提高了约100倍;该方法重复性良好,组内和组间变异系数在0.15%~1.41%之间,均小于2%。对45份临床样本采用构建的TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法和常规RT-PCR检测方法进行对比,符合率为100%。因此,本研究建立的TaqMan探针荧光定量RT-PCR具有特异性强、敏感性高、重复性好等优势。 展开更多
关键词 兔轮状病毒 taqman探针 荧光定量RT-pcr 检测方法
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斯里兰卡木薯花叶病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用
13
作者 黄境珊 王国芬 +6 位作者 时涛 李超萍 陈奕鹏 蔡吉苗 李博勋 刘先宝 黄贵修 《热带作物学报》 北大核心 2025年第9期2056-2062,共7页
由斯里兰卡木薯花叶病毒(Sri Lankan cassava mosaic virus,SLCMV)侵染引起的斯里兰卡木薯花叶病是近年来我国木薯种植中新发的危险性病害。现有检测技术存在灵敏度低、效率不高等不足,限制了相关工作的开展。本研究根据病毒基因序列设... 由斯里兰卡木薯花叶病毒(Sri Lankan cassava mosaic virus,SLCMV)侵染引起的斯里兰卡木薯花叶病是近年来我国木薯种植中新发的危险性病害。现有检测技术存在灵敏度低、效率不高等不足,限制了相关工作的开展。本研究根据病毒基因序列设计引物和探针,制备阳性质粒标准品,建立SLCMV的TaqMan荧光定量检测技术,并对其应用效果等进行验证。结果发现,该方法仅对SLCMV DNA样品产生特异性荧光信号,对阳性质粒标准品的最低检出量为4.5×10^(1)copies/μL。标准曲线显示,Ct值与拷贝数的对数呈良好线性关系,曲线斜率为-3.1312,相关系数(R^(2))为0.9969,扩增效率(E)为97.9%,标准曲线方程为y=-3.1312x+34.599。利用该技术对广西和福建的2个木薯种植园供试样品进行检测,叶片阳性检出率分别达95.45%和78.57%,最低检测拷贝数为1.45×10^(5)copies/g,而田间烟粉虱携毒率为86%,最低带毒量为9.42×10^(4)copies/头。该技术具有良好的灵敏度、特异性和重复性,可为该病的田间鉴定、早期诊断、无毒种茎评价等监控工作提供有效的技术支持。 展开更多
关键词 木薯 斯里兰卡木薯花叶病毒 taqman荧光定量pcr
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猪腺病毒3型TaqMan探针荧光定量PCR检测方法建立
14
作者 解佳 刘静宜 +4 位作者 孙彤 郭伟强 俞赵荣 陈鸿军 陈立功 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期106-111,共6页
猪腺病毒3型(PAdV-3)导致猪肠道性疾病。为能够快速特异检测该病毒,本研究根据PAdV-3 hexon基因序列保守区设计特异性引物和探针,成功建立了一种针对PAdV-3的TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。结果显示:该方法特异性好,可鉴别P... 猪腺病毒3型(PAdV-3)导致猪肠道性疾病。为能够快速特异检测该病毒,本研究根据PAdV-3 hexon基因序列保守区设计特异性引物和探针,成功建立了一种针对PAdV-3的TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。结果显示:该方法特异性好,可鉴别PAdV-3与其他猪病病毒,最低检测限为10 copies/μL,敏感性高于常规PCR 100倍。该检测方法的建立为PAdV-3的快速诊断提供了重要的分子诊断工具。 展开更多
关键词 猪腺病毒3型 hexon基因 taqman探针 实时荧光定量pcr
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唇形后口虫SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用
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作者 郝文悦 王锦锦 +9 位作者 葛建龙 李彬 王印庚 廖梅杰 荣小军 赵宏晶 江敏棋 赵文广 牛立成 潘娇 《渔业科学进展》 北大核心 2025年第3期183-193,共11页
后口虫病是近年来影响刺参(Apostichopus japonicus)养殖效益的重要病害种类之一。唇形后口虫(Boveria labialis)是刺参后口虫病的病原。由于缺乏针对该物种的快速、准确的检测方法,研究人员难以系统解析该病原体的传播途径。本研究以... 后口虫病是近年来影响刺参(Apostichopus japonicus)养殖效益的重要病害种类之一。唇形后口虫(Boveria labialis)是刺参后口虫病的病原。由于缺乏针对该物种的快速、准确的检测方法,研究人员难以系统解析该病原体的传播途径。本研究以测序获得的唇形后口虫部分线粒体基因组序列为基础,根据nad10基因序列设计唇形后口虫引物,建立其SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并对刺参不同养殖区和不同养殖模式下养殖系统中唇形后口虫载量进行检测分析。结果显示,设计的唇形后口虫引物在质粒标准品4.05×10^(1)~4.05×10^(9) copies/μL范围内建立的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数R^(2)=0.997,熔解曲线呈现单一峰,无引物二聚体或非特异性扩增;灵敏度实验最低检测限为40.5 copies/μL;所设计的引物仅对唇形后口虫出现特异性扩增,对海洋尾丝虫(Uronema marinum)、贪食纤口虫(Chaenea vorax)、僧帽肾形虫(Colpoda cucullus)和多小核草履虫(Paramecium multi-micronuleatum)无交叉反应;重复性实验中各浓度的批内和批间Ct值均一性较高,批内实验变异系数(CV)值为0.32%~0.82%,批间实验CV值为0.40%~0.88%,稳定性较好。利用本方法对4种刺参养殖模式不同养殖区的环境样品和饲料进行检测,结合镜检结果对比分析发现,海水中唇形后口虫DNA载量与刺参体内唇形后口虫量呈中度正相关(R=0.563),底泥、附着物样品中的唇形后口虫DNA载量与刺参体内唇形后口虫量呈高度正相关(R=0.931)。推测,鲜海泥是唇形后口虫传播的重要载体之一。本研究结果可为唇形后口虫的快速检测、传播途径解析和防控提供参考。 展开更多
关键词 刺参 寄生性疾病 唇形后口虫 实时荧光定量pcr检测 传播途径
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转基因抗虫玉米浙大瑞丰8实时荧光定量PCR检测方法
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作者 田锦 句荣辉 +7 位作者 蒋红叶 陈子言 张华 李凌燕 孙宇 王颢潜 陈红 梁晋刚 《生物安全学报(中英文)》 北大核心 2025年第2期130-136,共7页
【目的】转基因抗虫玉米浙大瑞丰8是杭州瑞丰生物科技有限公司研发的新型抗虫玉米,于2021年获批农业转基因生物安全证书(生产应用)。本研究旨在为转基因抗虫玉米浙大瑞丰8设计特异性扩增引物和TaqMan探针,并对其转化体成分进行定量检测... 【目的】转基因抗虫玉米浙大瑞丰8是杭州瑞丰生物科技有限公司研发的新型抗虫玉米,于2021年获批农业转基因生物安全证书(生产应用)。本研究旨在为转基因抗虫玉米浙大瑞丰8设计特异性扩增引物和TaqMan探针,并对其转化体成分进行定量检测,为管理部门提供安全监管的依据。【方法】通过体系优化、正确度及精密度检测、稳健性测试等系列研究,设计特异性引物和探针,对浙大瑞丰8转化体成分进行定量检测。【结果】本研究研制的方法能够特异、定量检测出浙大瑞丰8转化体成分,对拷贝数比值在0.1%(20个拷贝数)以上的阳性样品可进行准确定量,对0.05%(10个拷贝数)的阳性样品可特异性检出。【结论】本研究结果为管理部门对浙大瑞丰8的安全监管提供了有效的支撑,说明研制的方法可用于浙大瑞丰8的定量检测和安全监管。 展开更多
关键词 转基因抗虫玉米浙大瑞丰8 实时荧光定量pcr 检测
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香蕉细菌性鞘腐病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 麦桂婉 肖文超 +2 位作者 李云锋 李华平 饶雪琴 《华中农业大学学报》 北大核心 2025年第5期308-313,共6页
为实现香蕉细菌性鞘腐病的早期准确检测,基于香蕉细菌性鞘腐病菌的管家基因fusA设计特异性引物,优化扩增条件,建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并与常规PCR进行比较。结果显示,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测质粒DNA的灵... 为实现香蕉细菌性鞘腐病的早期准确检测,基于香蕉细菌性鞘腐病菌的管家基因fusA设计特异性引物,优化扩增条件,建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并与常规PCR进行比较。结果显示,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测质粒DNA的灵敏度为3.3×10^(−5)ng/μL,是常规PCR的100倍。利用建立的方法对接种香蕉细菌性鞘腐病菌XJ5-1的香蕉叶鞘和土样进行检测,结果发现该方法能检测到香蕉叶鞘中拷贝数为4.31×10^(3)copies/μL和土样中拷贝数为1.07×10^(9)copies/μL的XJ5-1;能检测出接种浓度为1×10^(3)CFU/mL的温室土样中的XJ5-1,灵敏度是常规PCR的100倍。结果表明,建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法快速简便、灵敏度高,可实现香蕉细菌性鞘腐病的早期诊断。 展开更多
关键词 香蕉细菌性鞘腐病 Dickeya dadantii SYBR GreenⅠ实时荧光定量pcr
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禽腺病毒I群和禽腺病毒4型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用
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作者 薛晓岩 张振兴 +4 位作者 杨钦鸿 王位 张伟 李素华 宋建领 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期152-158,184,共8页
为建立能快速检测禽腺病毒I群(FAd V-I)和禽腺病毒4型(FAd V-4)的双重Taq Man探针荧光定量PCR(qPCR)方法,本研究根据禽腺病毒(FAd V)的Hexon基因,设计针对FAd V-I和FAd V-4的通用型与特异型引物与探针。采用上述引物经PCR扩增靶基因并... 为建立能快速检测禽腺病毒I群(FAd V-I)和禽腺病毒4型(FAd V-4)的双重Taq Man探针荧光定量PCR(qPCR)方法,本研究根据禽腺病毒(FAd V)的Hexon基因,设计针对FAd V-I和FAd V-4的通用型与特异型引物与探针。采用上述引物经PCR扩增靶基因并克隆至p MD19-T载体中,构建重组质粒标准品p MD19-T-FAd V-I和p MD19-T-FAd V-4,并均经PCR和测序鉴定。将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释后等体积混合作为模板,采用棋盘法对反应体系和反应条件进行优化,建立了能检测上述病原的双重Taq Man探针q PCR方法,同时对该方法的特异性、敏感性、重复性及对临床样品的适用性进行评价。结果显示,两种重组质粒标准品标准曲线的相关系数(R2)均大于0.996,表明两种质粒标准品混合物的拷贝数与其Ct值具有良好的线性关系;该方法能够特异性检测和区分FAd V-I和FAd V-4,与其他禽类传染病病原核酸不发生交叉反应,具有较强的特异性;该方法对FAd V-I和FAd V-4重组质粒标准品的检测限分别为4.6×10~2拷贝/μL和2.01×10~2拷贝/μL,比常规PCR方法敏感性高10倍,具有较高的敏感性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于1.0%,具有较好的重复性和稳定性。采用该方法和常规PCR法对32份疑似感染FAd V-I的家禽组织样品、8份疑似感染FAd V-4的家禽粪便样品进行检测,结果显示二者检测结果的符合率均为100%。结果表明,本研究建立的FAd V-I/FAd V-4双重Taq Man探针q PCR检测方法特异性强、敏感性高、准确性好,为快速诊断FAd V-I的同时鉴别FAd V-4提供了技术支持。 展开更多
关键词 禽腺病毒I群 禽腺病毒4型 HEXON taqman探针 荧光定量pcr
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牛病毒性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 王亚新 陈萌萌 +4 位作者 王露 李欣 赵洪哲 温永俊 王凤雪 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第4期131-138,共8页
为建立一种针对牛病毒性腹泻病毒的检测方法,本研究针对牛病毒性腹泻病毒的5'UTR设计特异性引物及TaqMan探针,进行扩增,进而构建阳性重组质粒。经过条件优化建立了牛病毒性腹泻病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:建立的实... 为建立一种针对牛病毒性腹泻病毒的检测方法,本研究针对牛病毒性腹泻病毒的5'UTR设计特异性引物及TaqMan探针,进行扩增,进而构建阳性重组质粒。经过条件优化建立了牛病毒性腹泻病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在1×10^(4)~1×10^(8)拷贝/μL时,线性关系良好,线性相关系数R2=0.998;该方法最低检测限为10拷贝/μL;可以特异性检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV),与牛冠状病毒(BCV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3),以及牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应,病毒滴度与拷贝数线性关系良好,线性相关系数R2=0.997;与商品化检测试剂盒的符合率为97.5%。该方法为牛病毒性腹泻病毒的早期快速诊断提供了有力的技术支持。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 taqman荧光定量pcr 5'UTR
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猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法
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作者 张岳 孙彤 +5 位作者 郭洁真 魏晓锋 熊炜 刘静宜 陈鸿军 陈丹清 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期119-124,共6页
猪巨细胞病毒(PCMV)感染可导致猪食欲废绝,母猪流产,产木乃伊胎,仔猪发育不良等临床症状,且分布广泛,对异种器官移植也存在潜在威胁。本研究针对PCMV保守基因DPOL设计引物探针,建立TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示:检测限可达10拷... 猪巨细胞病毒(PCMV)感染可导致猪食欲废绝,母猪流产,产木乃伊胎,仔猪发育不良等临床症状,且分布广泛,对异种器官移植也存在潜在威胁。本研究针对PCMV保守基因DPOL设计引物探针,建立TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示:检测限可达10拷贝,灵敏度高;变异系数<2%,标准曲线R2=0.998,重复性好,具有高特异性;对上海市及江苏省常州市170份血清样本进行检测,5份样品为可疑结果。本研究建立的方法可用于养殖场猪感染PCMV的筛查,对该病防控具有重要意义。 展开更多
关键词 猪巨细胞病毒 DPOL基因 taqman探针 实时荧光定量pcr
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