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化脓隐秘杆菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：3
1
作者 刘二龙 卢丽 +3 位作者 唐婕 吕英姿 郑高彬 蒋湘 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第5期1093-1097,共5页
本试验旨在建立检测化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes,A.pyogenes)特异、灵敏的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank公布的化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)基因高保守序列,设计特异性引物和探针建立检测体系,用于化脓... 本试验旨在建立检测化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes,A.pyogenes)特异、灵敏的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank公布的化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)基因高保守序列,设计特异性引物和探针建立检测体系,用于化脓隐秘杆菌的快速检测,并对该方法的特异性和灵敏度进行检测。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法仅对化脓隐秘杆菌的检测结果为阳性;该方法最低检测DNA浓度为77.6fg,最低检测细菌浓度为63CFU/mL。采用本研究建立的方法检测23份林麝临床病例样品,共鉴定出16株化脓隐秘杆菌,与API Coryne生化鉴定方法的结果相同。本研究为化脓隐秘杆菌的检测提供了一种灵敏、特异、快速的检测方法,其可用于化脓隐秘杆菌的诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 化脓隐秘杆菌 taqman实时荧光定量pcr溶血素(PLO)
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鸡传染性贫血病病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：3
2
作者 郭翠丽 张春红 +3 位作者 郭鹏举 张建峰 沈海燕 潘家强 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第12期45-49,共5页
根据鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus,CAV)基因组保守区域设计1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种快速检测CAV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,同时验证其特异性、灵敏性和重复性。本试验建立的TaqMan... 根据鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus,CAV)基因组保守区域设计1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种快速检测CAV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,同时验证其特异性、灵敏性和重复性。本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度可达1.8×101拷贝/μL,远高于常规PCR方法;并与禽类其他病毒性疾病无交叉反应,具有高特异性。用分离的病毒人工感染1日龄SPF雏鸡,14日龄剖检,对感染鸡体内各器官的病毒分布及载量进行检测,结果表明,在脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊和血清中均可检测到病毒,肝脏、胸腺病毒载量明显高于其他组织。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可同时检测大量临床样品,适用于CAV的诊断与流行病学分析。 展开更多
关键词 鸡传染性贫血病病毒(CAV) taqman实时荧光定量pcr 探针
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TaqMan实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数 被引量：6
3
作者 李凯 高宏雷 +4 位作者 高立 祁小乐 高玉龙 徐延伟 王笑梅 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期742-746,共5页
以3-磷酸甘油醛脱氢酶为内参基因,建立一种快速检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的TaqMan荧光定量PCR方法。通过对反应参数进行优化,建立针对目的基因和内参基因的双标准曲线,并对重组酵母基因组中外源基因和内参基因的拷贝数进行同... 以3-磷酸甘油醛脱氢酶为内参基因,建立一种快速检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的TaqMan荧光定量PCR方法。通过对反应参数进行优化,建立针对目的基因和内参基因的双标准曲线,并对重组酵母基因组中外源基因和内参基因的拷贝数进行同时定量检测,外源基因与内参基因起始模板拷贝数的比值即为外源基因在重组酵母菌株基因组中的拷贝数。结果表明,2条标准曲线在101～108拷贝.μL-1具有良好的线性关系,以及良好的敏感性和重复性。利用该方法对60株重组酵母菌株进行荧光定量PCR检测,结果筛选到38株单拷贝插入菌株和22株多拷贝插入菌株。本研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR方法方便、高效,可用于重组毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的检测。 展开更多
关键词 taqman荧光定量pcr 毕赤酵母 基因拷贝数 GAP基因
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羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：6
4
作者 姚俊 李富祥 +3 位作者 彭海生 鲁富有 张乔明 李华春 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第11期31-36,共6页
根据GenBank中的羊口疮病毒基因组(AY386264)ORFVgORF121及ORFVgORF122基因的DNA序列,应用Beacon Designer 7.7软件设计一对引物和一条TaqMan探针,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PC... 根据GenBank中的羊口疮病毒基因组(AY386264)ORFVgORF121及ORFVgORF122基因的DNA序列,应用Beacon Designer 7.7软件设计一对引物和一条TaqMan探针,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。该方法组内及组间重复试验变异系数均低于2%,上机检测时间不超过40min,检测灵敏度达1×101copies/μL,山羊痘及禽痘病毒特异性检测均为阴性,标准曲线的相关系数(R2)为0.998 088,线性关系良好。应用该方法对云南保山和普洱送检的羊口疮临床组织病料进行绝对定量检测,送检样品抽提DNA中病毒拷贝数分别为1.35×108copies/μL和9.62×107copies/μL。结果表明,研究建立的羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、稳定、快速和安全的特点,适于羊口疮临床组织样品的早期检测及常规病原监测。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 taqman 实时荧光定量pcr 建立 应用
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鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：2
5
作者 万春和 刘荣昌 +5 位作者 程龙飞 施少华 傅光华 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第5期1341-1348,共8页
试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,... 试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。 展开更多
关键词 鸭腺病毒A型 Hexon基因 taqman探针 实时荧光定量pcr方法
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山羊痘病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：5
6
作者 姚俊 段国军 +4 位作者 陈官国 彭海生 鲁富有 杨永军 李华春 《山地农业生物学报》 2012年第5期412-419,共8页
根据GenBank中山羊痘病毒(AY077835)gp063基因DNA序列,应用Beacon Designer 7.0软件,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,同时制备含有靶DNA序列的pEASY-T1重组质粒标准品。通过引物、探针浓度的筛选及反应条件的优化,建立了山羊痘病毒Taq... 根据GenBank中山羊痘病毒(AY077835)gp063基因DNA序列,应用Beacon Designer 7.0软件,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,同时制备含有靶DNA序列的pEASY-T1重组质粒标准品。通过引物、探针浓度的筛选及反应条件的优化,建立了山羊痘病毒TaqMan法实时荧光定量PCR。该方法组内和组间重复试验变异系数均低于2%,最低浓度检测极限值为1×100copies/μL,上机检测时间少于40 min。运用该方法对不同时期流行于云南局部的山羊痘临床组织病料进行定量检测,生成的标准曲线斜率(Slope)为-3.36,截距(Intercept)为41.08,相关系数(R2)为0.999 989,阳性对照及送检样品抽提DNA中病毒含量依次为:P(TK)2.70×105copies/μL,华坪(HP)毒株1.45×106copies/μL,景谷(JG)毒株5.12×105copies/μL,保山(BS)毒株2.96×105copies/μL,宣威(XW)毒株1.86×105copies/μL,永胜(YS)毒株1.36×103copies/μL。结果表明:所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适合于山羊痘的早期检测。 展开更多
关键词 山羊痘病毒 taqman 实时荧光定量pcr
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猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：6
7
作者 曾思遥 张淑琼 +3 位作者 余绍华 唐志玲 陈瑞爱 罗满林 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第6期41-46,共6页
本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方... 本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 荧光定量pcr taqman探针 标准曲线
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鸭甲型肝炎病毒1型与3型双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：4
8
作者 林梦舟 吴双 +4 位作者 徐建生 谢军 吴植 姜勇 朱善元 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期3149-3156,共8页
旨在建立一种针对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)的高效快速、高灵敏度和高特异性的双重TaqMan实时荧光定量PCR(q-PCR)检测方法并应用于临床疑似样品检测。根据DHAV-1和DHAV-3的VP1基因保守区域,分别设计合成了2对特异... 旨在建立一种针对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)的高效快速、高灵敏度和高特异性的双重TaqMan实时荧光定量PCR(q-PCR)检测方法并应用于临床疑似样品检测。根据DHAV-1和DHAV-3的VP1基因保守区域,分别设计合成了2对特异性引物和探针,在此基础上建立并优化了双重TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示:优化后标准曲线的相关系数(R2)均在0.999以上,扩增效率(E)在105%~110%,其组内变异系数(i-CV)与组间变异系数(c-CV)均在0.77%以下。运用双重q-PCR方法对不同稀释度的混合质粒与病毒核酸进行检测,结果表明,建立的双重TaqMan q-PCR特异性高;同时检测DHAV-1和DHAV-3的灵敏度均可达10个拷贝,分别是常规PCR方法的1000倍和100倍。对40份来自苏中、苏北地区的疑似鸭肝炎病毒感染的鸭组织病料进行检测,结果表明,q-PCR方法检出36份阳性病料,阳性率为90%;而常规PCR方法未能检出高Ct值的样品,阳性率为72.5%(29份阳性病料)。建立的双重TaqManq-PCR检测方法为DHAV-1与DHAV-3的临床样品检测提供了高效、灵敏、特异的工具,推动了临床分子流行病学调查及病毒定量分析等研究。 展开更多
关键词 1型鸭肝炎病毒 3型鸭肝炎病毒 鸭病毒性肝炎 实时荧光定量pcr
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鸡滑液囊支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量：4
9
作者 李梅 王柏林 +6 位作者 岳筠 杨美 宋春 朱二鹏 单春兰 文明 程振涛 《动物医学进展》 北大核心 2023年第3期15-20,共6页
为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R^(2)=1.000,斜... 为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R^(2)=1.000,斜率S=-3.452,截距I=43.950,表明标准质粒浓度与Ct值的线性关系良好;该方法除MS外,其他参考菌(毒)株均无目的基因扩增,其最小检测浓度为1×10^(1)copies/μL,组内重复及组间重复的变异系数均低于0.1;运用所建立方法与普通PCR方法对4份疑似MS临床样本进行检测,检测结果完全相符合;应用该方法对贵州省7个地区107份疑似MS样本进行检测,发现总体阳性率为26.17%。说明建立的方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床检测。 展开更多
关键词 鸡滑液囊支原体 vlhA基因 taqman探针 实时荧光定量pcr
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流产衣原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：2
10
作者 温渊 刘东慧 +4 位作者 李兆才 谭书敏 梁林 黄勇 周继章 《中国兽药杂志》 2021年第11期8-15,共8页
流产衣原体是导致绵羊地方性流产的主要病原体,对全球畜牧业经济发展构成了巨大威胁。为建立一种灵敏、特异且快速检测流产衣原体的实时荧光定量PCR方法,依据衣原体蛋白酶样活性因子基因组序列设计了针对检测流产衣原体的引物和TaqMan探... 流产衣原体是导致绵羊地方性流产的主要病原体,对全球畜牧业经济发展构成了巨大威胁。为建立一种灵敏、特异且快速检测流产衣原体的实时荧光定量PCR方法,依据衣原体蛋白酶样活性因子基因组序列设计了针对检测流产衣原体的引物和TaqMan探针,对反应体系和反应条件进行了优化,对方法的灵敏度、特异性及重复性进行了评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,该方法的最低检测限为26 copies/μL,灵敏度是普通PCR的10倍;与其他可以引起类似症状的病原体无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%;对156份流产羊拭子的基因组进行检测,流产衣原体的检出率为78.21%。研究表明,该方法可以很好地应用于流产衣原体的大规模临床样本检测,为流产衣原体病的高通量检测和流行病学调查提供技术手段。 展开更多
关键词 流产衣原体 蛋白酶样活性因子 taqman探针 实时荧光定量pcr
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鸭瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用
11
作者 于江玮 程慧敏 +4 位作者 林健 杨宝琳 黄程 杨志远 胡格 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期765-773,共9页
为建立一种鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法,基于DPV US 6基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒DPV-US6标准品,对方法敏感性、特异性和重复性进行评价,并应用于DPV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增... 为建立一种鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法,基于DPV US 6基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒DPV-US6标准品,对方法敏感性、特异性和重复性进行评价,并应用于DPV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖及人工感染鸭器官组织上分布规律研究。结果显示,成功建立了DPV TaqMan荧光定量PCR检测方法,该方法最低检测限可以达到10 copies·μL^(-1),与番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭坦布苏病毒、鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭甲型肝炎病毒(I型和III型)和鸭衣原体均无交叉反应,批间和批内变异系数均小于2.0%。DPV-AX株感染CEF细胞后,病毒核酸拷贝数检测结果表明,4~8 h病毒增殖缓慢,12~60 h迅速上升,60 h达到最高峰,72~144 h逐渐下降,与TCID 50法测定的病毒滴度相比,两种检测方法具有良好相关性,可实现拷贝数替代TCID 50。DPV人工感染鸭组织脏器的病毒载量分布检测表明,肝脏中的病毒载量最高。本试验建立的检测方法为研究DPV-AX株在CEF上的增殖规律提供工具。 展开更多
关键词 鸭瘟病毒 US 6基因 taqman探针 荧光定量pcr 增殖规律 人工感染
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实时荧光定量PCR法检测左旋多巴中大肠埃希菌宿主细胞DNA残留量
12
作者 许冰瑜 刘妍 +2 位作者 郭心瑶 严方 孙桂斌 《中国药科大学学报》 北大核心 2025年第2期176-182,共7页
采用实时荧光定量PCR技术,建立特异性强、灵敏度高的左旋多巴中大肠埃希菌(Escherichiacoli)宿主细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证和初步应用。以大肠埃希菌中的相对保守的E.coli MB6菌株16S核糖体RNA基因序列作为目的基因设计多对引... 采用实时荧光定量PCR技术,建立特异性强、灵敏度高的左旋多巴中大肠埃希菌(Escherichiacoli)宿主细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证和初步应用。以大肠埃希菌中的相对保守的E.coli MB6菌株16S核糖体RNA基因序列作为目的基因设计多对引物,通过PCR进行特异性扩增获得目的片段。将目的片段重组至pLENTI-BSD-CON载体构建重组质粒命名为pLENTI-BSD-CON-E.coli-16S,以其为标准品,结合磁珠法提取纯化DNA,建立定量PCR检测方法(SYBR-Green法)。对建立的方法进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限及耐用性的方法学验证,应用于左旋多巴原料药的检测,并与试剂盒检测方法(Taqman探针法)进行比较。建立的定量PCR检测方法(SYBR-Green法)正向引物序列:5'-TTCGATGCAACGCGAAGAAC-3';反向引物序列:5'-GTGTAGCCCTGGTCGTAAGG-3'。以重组质粒作为标准品,DNA质量浓度在10fg/μL~3 ng/μL范围内线性关系良好(R^(2)≥0.98),定量限为10 fg/μL,加标溶液回收率在59.7%~80.7%范围内,RSD均小于30%。应用该法对3批左旋多巴原料药进行检测,DNA残留量均在限度以下。结果表明,建立的检测方法可用于定量检测左旋多巴等由大肠埃希菌作为宿主细胞生产的生物制品的DNA残留量,并且其灵敏度优于试剂盒检测方法。 展开更多
关键词 大肠埃希菌 左旋多巴 构建质粒 实时荧光定量pcr 外源性DNA残留 帕金森病
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姜荷花苞片实时荧光定量PCR内参基因筛选
13
作者 谭健俊 黄李珊 +2 位作者 周熠玮 徐晔春 叶远俊 《广东农业科学》 2025年第2期108-116,共9页
[目的]筛选适用于姜荷花苞片组织qRT-PCR分析的内参基因,为苞片颜色相关基因功能研究奠定理论基础。[方法]以9个不同颜色的姜荷花品种为试材,根据姜荷花基因组数据选择常用的内参基因,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S... [目的]筛选适用于姜荷花苞片组织qRT-PCR分析的内参基因,为苞片颜色相关基因功能研究奠定理论基础。[方法]以9个不同颜色的姜荷花品种为试材,根据姜荷花基因组数据选择常用的内参基因,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)、泛素蛋白(UBQ)、苹果酸脱氢酶(MDH)、肌动蛋白(Actin)、微管蛋白(TUB)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)8个看家基因,使用ΔCt、geNorm、NormFinder和BestKeeper 4种分析方法评估基因表达的稳定性,通过RefFinder程序综合评价以筛选出姜荷花苞片组织的最佳内参基因。[结果]8个内参基因均扩增出单一主峰,引物标准曲线相关系数R^(2)≥0.98,扩增效率为99.5%~125.0%,PCR产物经1%琼脂糖电泳检测显示条带清晰单一,表明引物设计特异性好。4种不同的算法分析获得的结果排名有差异,其中MDH在ΔCt、geNorm和NormFinder分析中为表达最稳定的内参基因,18S rRNA在BestKeeper分析中为表达最稳定的内参基因。利用RefFinder程序综合评价得出候选内参基因稳定性综合排名,排序依次为MDH>Actin>TUB>18S rRNA>PP2A>GAPDH>UBQ>PAL,表明不同品种姜荷花苞片最佳内参基因是MDH,其次为Actin和TUB,PAL稳定性最差、不适合作为姜荷花苞片组织的内参基因。[结论]MDH可作为不同品种姜荷花苞片组织的稳定内参基因,为后续深入开展姜荷花苞片颜色合成相关基因的表达模式分析提供参考。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 姜荷花 内参基因 苞片颜色 MDH 基因表达模式
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实时荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌的研究
14
作者 刘占生 张莉 王嫘 《中国食品工业》 2025年第5期97-99,共3页
目的:构建快速检测食品中沙门氏菌的实时荧光定量PCR法。方法:以沙门氏菌核酸DNA提取物为模板开展荧光检测实验,建立快速检测手段,用于阳性培养液及食品中沙门氏菌检测分析。结果:该方案能在30批食品样本中成功扩增出沙门氏菌特异性片段... 目的:构建快速检测食品中沙门氏菌的实时荧光定量PCR法。方法:以沙门氏菌核酸DNA提取物为模板开展荧光检测实验,建立快速检测手段,用于阳性培养液及食品中沙门氏菌检测分析。结果:该方案能在30批食品样本中成功扩增出沙门氏菌特异性片段,最低检出浓度15CFU/mL,检测时长<24h。结论:本研究提出的实时荧光定量PCR法具有高效、快速、灵敏、精准的特点,可广泛应用于食品中沙门氏菌的快速筛查与检测,为食品安全监控提供强有力的技术支持。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 沙门氏菌 快速检测
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牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
15
作者 蒲鹏 李晨露 +2 位作者 张琪 吴发兴 许信刚 《动物医学进展》 北大核心 2024年第2期7-10,共4页
为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan... 为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 taqman荧光定量pcr 检测方法
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马铃薯病毒病实时荧光定量PCR检测技术
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作者 杨茹薇 刘易 +2 位作者 古丽米拉·热合木土拉 孙慧 江应红 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期2484-2490,共7页
【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原,为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据Gen-Bank数据库注册序列设计马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV... 【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原,为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据Gen-Bank数据库注册序列设计马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)的检测引物,完成引物浓度及系统优化。【结果】建立3种马铃薯病毒病的实时荧光定量PCR检测技术体系(real-time fluorescent quantitative RT-PCR,RT-qPCR),其标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为99.42%以上,扩增效率均为84.48%以上,可快速、准确检测出3种马铃薯病毒。【结论】实时荧光定量PCR检测技术是一种高灵敏度、特异性强的检测方法,可实时监测马铃薯生产中病毒病的感染情况。 展开更多
关键词 马铃薯 病毒病 实时荧光定量pcr
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辣椒种子炭疽菌和疫霉菌实时荧光定量检测技术建立及应用
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作者 兰嘉仪 谢芳玲 +7 位作者 李诗 杨廷 张正 袁思怡 吴婷 朱宏建 刘峰 戴雄泽 《中国蔬菜》 北大核心 2025年第3期55-65,共11页
疫病和炭疽病是辣椒生产上的主要病害,不仅降低产量,还会影响辣椒的外观品质,种子带菌是辣椒生产中病害发生的原因之一。从山西、海南、安徽辣椒杂交种子生产基地发生疫病和炭疽病的辣椒果实和植株上分离到菌株SX22、SX26、SX45,通过病... 疫病和炭疽病是辣椒生产上的主要病害,不仅降低产量,还会影响辣椒的外观品质,种子带菌是辣椒生产中病害发生的原因之一。从山西、海南、安徽辣椒杂交种子生产基地发生疫病和炭疽病的辣椒果实和植株上分离到菌株SX22、SX26、SX45,通过病原菌形态学鉴定和分子生物学鉴定,确定为疫霉菌(Phytophthora capsici)、平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)、斯高威尔炭疽菌(Colletotrichum scovillei)。针对疫霉菌、平头炭疽菌分别设计了特异性引物PC-F/PC-R和ITS1/CT-R,针对斯高威尔炭疽菌筛选了特异性引物CS-F/CS-R,建立了辣椒种子平头炭疽菌、斯高威尔炭疽菌和疫霉菌实时荧光定量PCR检测体系。2023年对山西、海南、安徽3个生产基地的辣椒杂交种子70份样品进行了检测,疫霉菌和斯高威尔炭疽菌种子带菌率分别为70.0%和72.9%。该体系为种子质检和辣椒病害的早期预防提供了重要技术支持。 展开更多
关键词 种子带菌 辣椒 实时荧光定量pcr 病原鉴定
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低温弱光胁迫下茄子幼苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价
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作者 林珲 裘波音 +1 位作者 朱海生 温庆放 《福建农业科技》 CAS 2024年第8期1-15,共15页
为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差... 为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差异情况,并运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种计算方法评价茄子20个候选内参基因在低温、弱光、低温弱光叶片样品中的表达稳定性。结果表明:茄子20个候选内参基因荧光定量引物扩增效率(E)数值在96.8%~117.6%,相关系数(R^(2))介于0.9688~0.9999,扩增效率良好,扩增反应具有高度的专一性,引物能特异性扩增,特异性好,均为单峰,样品间扩增曲线重复性强,可用于qRT-PCR扩增。茄子20个候选内参基因C_(T)值表达丰度分析,发现茄子20个候选内参基因平均CT值在19.76~31.20。3种计算方法的综合评价分析结果显示,TBP基因在所有样本中为最稳定的内参基因。研究可为茄子低温、弱光和低温弱光胁迫下基因特异性表达研究提供了合适的内参基因。 展开更多
关键词 茄子 内参基因 实时荧光定量pcr 标准化 基因表达
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基于荧光定量PCR法的蜂蜜鉴别研究
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作者 王笑语 吴攀 +1 位作者 王承丽 岳万福 《浙江农业科学》 2025年第3期730-736,共7页
本研究探讨实时荧光定量PCR法在鉴别蜂蜜的适用性。采用CTAB法提取蜂蜜样本中的花粉DNA与蜜蜂DNA,利用5种植物与蜜蜂DNA引物探针,采用实时荧光定量PCR法对蜂蜜中的DNA进行检测,以判断不同蜂蜜样品的花粉构成、生产时间、生产地点,对蜂... 本研究探讨实时荧光定量PCR法在鉴别蜂蜜的适用性。采用CTAB法提取蜂蜜样本中的花粉DNA与蜜蜂DNA,利用5种植物与蜜蜂DNA引物探针,采用实时荧光定量PCR法对蜂蜜中的DNA进行检测,以判断不同蜂蜜样品的花粉构成、生产时间、生产地点,对蜂蜜进行谱系分类。采用17种未知来源的蜂蜜进行方法的可行性验证,结果表明该方法可行。本研究对利用分子遗传进行蜂蜜鉴别起到推动及指导作用。 展开更多
关键词 蜂蜜 蜂蜜鉴别 花粉DNA 实时荧光定量pcr 蜜蜂
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BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：5
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作者 麻宝艺 盛陈艳 +6 位作者 刘宏莹 马青霞 汪婷婷 李健明 时坤 杜锐 冷雪 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2326-2335,共10页
【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件... 【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件,构建标准曲线,进行双重实时荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性检测,并利用建立的实时荧光定量PCR检测方法对采自吉林省的临床样品进行检测。【结果】建立的双重实时荧光定量PCR方法最适退火温度为57.0℃,最适引物浓度为0.5μmol/L,最适探针浓度为0.3μmol/L,BVDV1和BVDV2型的标准曲线分别为:Y=-3.54X+37.36(R^(2)=0.990)和Y=-3.18X+35.95(R^(2)=0.997)。对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)均无特异性扩增,批内和批间变异系数均<3%,检测下限为10拷贝/μL。临床样品检测结果显示,总体阳性率为23.1%(36/156),其中BVDV1阳性率为17.9%(28/156),BVDV2阳性率为5.1%(8/156)。【结论】本研究建立了可同时快速、准确鉴别BVDV1和BVDV2的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法,为BVDV的防控与净化提供技术支撑。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) taqman实时荧光定量pcr方法 探针
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