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鹅星状病毒通用型TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
1
作者 陈立功 穆英丽 +5 位作者 张诚 潘保革 范乐乐 魏忠华 王学静 刘聚祥 《中国家禽》 北大核心 2025年第2期53-59,共7页
为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量RT-PCR方法,试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针,采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度,在优化退火温度的基础... 为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量RT-PCR方法,试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针,采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度,在优化退火温度的基础上,分别建立扩增GAstV 1和GAstV 2的标准曲线,进一步验证该方法的特异性、敏感性和重复性,建立的方法用于临床样品的检测,并与文献报道的常规RT-PCR方法进行比较。结果显示:优化后的反应体系中最优上、下游引物浓度均为0.40(或0.50)μmol/L,探针浓度均为0.50μmol/L,扩增线性范围分别为3.26×10^(3)~3.26×10^(8)拷贝/μL和7.09×10^(3)~7.09×10^(8)拷贝/μL,相关系数均为0.998;该方法可特异性检出两种GAstV,但对新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鹅细小病毒和血清4型禽腺病毒6种鹅病相关病毒的核酸均无扩增信号;其检测限分别为3.26×10^(2)拷贝/μL和7.09×10^(1)拷贝/μL;组内变异系数和组间变异系数均低于3%。建立的实时荧光定量RT-PCR方法对临床样品的检测结果显示,GAstV阳性率为90.57%(96/106);而文献报道的常规RT-PCR方法对GAstV 1和GAstV 2的混合阳性率为62.26%。研究表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法为同时检测GAstV 1和GAstV 2提供了快速、敏感、特异且能满足临床样本需求的检测方法。 展开更多
关键词 鹅星状病毒 荧光定量RT-pcr taqman探针
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兔出血症病毒RHDV1和RHDV2一步法双重TaqMan探针荧光定量RT-PCR体系的建立和应用
2
作者 陈萌萌 王冠萱 +8 位作者 仇汝龙 范志宇 胡波 宋艳华 魏后军 徐为中 葛雷 李一鸣 王芳 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第5期937-942,共6页
兔出血症病毒(RHDV)引起的兔出血症是一种急性、高度致死性传染病,对养兔业造成严重危害。本研究基于RHDV衣壳蛋白(VP60)基因序列设计引物和TaqMan探针,建立可同时检测RHDV1和RHDV2两种毒株的双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测体系。反应体... 兔出血症病毒(RHDV)引起的兔出血症是一种急性、高度致死性传染病,对养兔业造成严重危害。本研究基于RHDV衣壳蛋白(VP60)基因序列设计引物和TaqMan探针,建立可同时检测RHDV1和RHDV2两种毒株的双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测体系。反应体系:2×One Step RT-PCR BufferⅢ10.0μL,上下游引物(10μmol/L)各0.6μL,ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4μL,两种荧光探针(10μmol/L)各0.8μL,待测样本2.0μL,ddH_(2)O 4.8μL。反应程序:42℃5 min,95℃10 s,95℃5 s,60℃30 s,40个循环。试验结果表明,该体系特异性强,与轮状病毒、兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌、绿脓杆菌、沙门氏菌无交叉反应;灵敏度高,最低检测限为1μL 100拷贝。通过组内重复和组间重复进行重复性分析,Ct值变异系数为0.2%~2.9%,表明该体系稳定性较好。使用该体系对112份临床样本(60份肝脏组织、52份鼻肛拭子)进行检测,RHDV总检出率为69%,而常规RT-PCR体系的检出率仅为51%。本研究建立的双重荧光定量RT-PCR方法具有高灵敏度、强特异性和良好的重复性,可为RHDV的临床快速诊断及定量分析提供可靠技术支持。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 荧光定量RT-pcr taqman探针
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鸭瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
3
作者 于江玮 程慧敏 +4 位作者 林健 杨宝琳 黄程 杨志远 胡格 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期765-773,共9页
为建立一种鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法,基于DPV US 6基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒DPV-US6标准品,对方法敏感性、特异性和重复性进行评价,并应用于DPV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增... 为建立一种鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法,基于DPV US 6基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒DPV-US6标准品,对方法敏感性、特异性和重复性进行评价,并应用于DPV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖及人工感染鸭器官组织上分布规律研究。结果显示,成功建立了DPV TaqMan荧光定量PCR检测方法,该方法最低检测限可以达到10 copies·μL^(-1),与番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭坦布苏病毒、鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭甲型肝炎病毒(I型和III型)和鸭衣原体均无交叉反应,批间和批内变异系数均小于2.0%。DPV-AX株感染CEF细胞后,病毒核酸拷贝数检测结果表明,4~8 h病毒增殖缓慢,12~60 h迅速上升,60 h达到最高峰,72~144 h逐渐下降,与TCID 50法测定的病毒滴度相比,两种检测方法具有良好相关性,可实现拷贝数替代TCID 50。DPV人工感染鸭组织脏器的病毒载量分布检测表明,肝脏中的病毒载量最高。本试验建立的检测方法为研究DPV-AX株在CEF上的增殖规律提供工具。 展开更多
关键词 鸭瘟病毒 US 6基因 taqman探针 荧光定量pcr 增殖规律 人工感染
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鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及遗传进化分析 被引量：1
4
作者 安乐乐 刘倩芸 +2 位作者 蓝秋菊 罗迅 赵永清 《江西农业大学学报》 北大核心 2025年第1期167-177,共11页
【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病... 【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病学调查提供技术平台。【方法】依据GenBank公布鸽腺病毒Ⅰ型Hexon基因保守区设计引物探针并构建重组质粒pCE2-TA-PiAdV-Ⅰ;优化反应体系和程序,绘制标准曲线、特异性、敏感性和重复性评价,建立鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法;扩增测序阳性临床样品的Hexon基因,使用MEGA5.0进行进化树构建及同源性分析。【结果】该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法标准曲线y=-3.1081x+37.374,线性相关系数R2为0.9977,线性关系良好;与鸽疱疹病毒、鸽圆环病毒等鸽子其他常见病毒无交叉反应,具有良好的特异性;最低检测拷贝数为14.6 copies/μL,敏感性是常规PCR方法的10倍,具有高敏感性;组内和组间变异系数均低于1.1%,重复性好。通过检测112份鸽子病料样品,该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法检测阳性率为69.64%(78/112),并且高于常规PCR方法阳性检出率65.18%(73/112)。此外,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法与常规PCR方法的阳性符合率为100%,总体符合率为95.54%。3条测序毒株与Ⅰ型鸽腺病毒参考毒株同源性为99.47%~99.71%,遗传关系高度接近,表明可能由同一个原始毒株进化而来。【结论】研究建立的鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法线性关系良好、特异性强、敏感性高及重复性好,可快速高效检测出临床样品中的PiAdV-Ⅰ。此外,所扩增序列能够用于分析临床毒株遗传进化特征,有助于快速准确诊断鸽腺病毒感染及疫苗研发提供参考依据。 展开更多
关键词 鸽腺病毒Ⅰ型 Hexon基因 taqman探针实时荧光定量pcr 遗传进化分析 临床检测 流行病学调查
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猪腺病毒3型TaqMan探针荧光定量PCR检测方法建立
5
作者 解佳 刘静宜 +4 位作者 孙彤 郭伟强 俞赵荣 陈鸿军 陈立功 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期106-111,共6页
猪腺病毒3型(PAdV-3)导致猪肠道性疾病。为能够快速特异检测该病毒,本研究根据PAdV-3 hexon基因序列保守区设计特异性引物和探针,成功建立了一种针对PAdV-3的TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。结果显示:该方法特异性好,可鉴别P... 猪腺病毒3型(PAdV-3)导致猪肠道性疾病。为能够快速特异检测该病毒,本研究根据PAdV-3 hexon基因序列保守区设计特异性引物和探针,成功建立了一种针对PAdV-3的TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。结果显示:该方法特异性好,可鉴别PAdV-3与其他猪病病毒,最低检测限为10 copies/μL,敏感性高于常规PCR 100倍。该检测方法的建立为PAdV-3的快速诊断提供了重要的分子诊断工具。 展开更多
关键词 猪腺病毒3型 hexon基因 taqman探针 实时荧光定量pcr
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禽腺病毒I群和禽腺病毒4型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用
6
作者 薛晓岩 张振兴 +4 位作者 杨钦鸿 王位 张伟 李素华 宋建领 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期152-158,184,共8页
为建立能快速检测禽腺病毒I群(FAd V-I)和禽腺病毒4型(FAd V-4)的双重Taq Man探针荧光定量PCR(qPCR)方法,本研究根据禽腺病毒(FAd V)的Hexon基因,设计针对FAd V-I和FAd V-4的通用型与特异型引物与探针。采用上述引物经PCR扩增靶基因并... 为建立能快速检测禽腺病毒I群(FAd V-I)和禽腺病毒4型(FAd V-4)的双重Taq Man探针荧光定量PCR(qPCR)方法,本研究根据禽腺病毒(FAd V)的Hexon基因,设计针对FAd V-I和FAd V-4的通用型与特异型引物与探针。采用上述引物经PCR扩增靶基因并克隆至p MD19-T载体中,构建重组质粒标准品p MD19-T-FAd V-I和p MD19-T-FAd V-4,并均经PCR和测序鉴定。将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释后等体积混合作为模板,采用棋盘法对反应体系和反应条件进行优化,建立了能检测上述病原的双重Taq Man探针q PCR方法,同时对该方法的特异性、敏感性、重复性及对临床样品的适用性进行评价。结果显示,两种重组质粒标准品标准曲线的相关系数(R2)均大于0.996,表明两种质粒标准品混合物的拷贝数与其Ct值具有良好的线性关系;该方法能够特异性检测和区分FAd V-I和FAd V-4,与其他禽类传染病病原核酸不发生交叉反应,具有较强的特异性;该方法对FAd V-I和FAd V-4重组质粒标准品的检测限分别为4.6×10~2拷贝/μL和2.01×10~2拷贝/μL,比常规PCR方法敏感性高10倍,具有较高的敏感性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于1.0%,具有较好的重复性和稳定性。采用该方法和常规PCR法对32份疑似感染FAd V-I的家禽组织样品、8份疑似感染FAd V-4的家禽粪便样品进行检测,结果显示二者检测结果的符合率均为100%。结果表明,本研究建立的FAd V-I/FAd V-4双重Taq Man探针q PCR检测方法特异性强、敏感性高、准确性好,为快速诊断FAd V-I的同时鉴别FAd V-4提供了技术支持。 展开更多
关键词 禽腺病毒I群 禽腺病毒4型 HEXON taqman探针 荧光定量pcr
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基于TaqMan探针的Real-timePCR定量检测空肠弯曲杆菌 被引量：16
7
作者 阳成波 蒋原 +1 位作者 黄克和 祝长青 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期183-187,共5页
空肠弯曲杆菌 (Campylobacterjejuni ,C .jijuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态 (Viablebutnonculturable ,VNC) ,所以传统的生化鉴定结果并不一定可靠 ,并且是一... 空肠弯曲杆菌 (Campylobacterjejuni ,C .jijuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态 (Viablebutnonculturable ,VNC) ,所以传统的生化鉴定结果并不一定可靠 ,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。在本文基于LightCycler为平台 ,建立一种基于TaqMan探针的Real_timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时 ,发现所有空肠弯曲杆菌 (11株 )都呈阳性 ,所有其它弯曲菌 (3株 )和其它菌株 (5株 )都是阴性。整个检测过程 6 0min内可以完成 ,检测限度为5CFU ,标准曲线的相关系数为 0 .988。结果表明荧光定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法 ,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。 展开更多
关键词 real-timepcr LIGHTCYCLER taqman探针 定量检测 空肠弯曲杆菌
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鸡传染性喉气管炎病毒TaqMan real-time PCR检测方法的建立 被引量：4
8
作者 赵妍 孔聪聪 +10 位作者 张晓敏 崔红玉 石星明 赵晓岩 薛美 胡顺磊 闫帅 牛秀杰 李巧玲 王玫 王云峰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期642-646,共5页
为建立鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)TaqMan Real-time PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的ILTV gB基因序列设计了2对引物与一条特异性TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件的优化,特异性、敏感性以及重复性试验,证明该方法在核酸含量... 为建立鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)TaqMan Real-time PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的ILTV gB基因序列设计了2对引物与一条特异性TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件的优化,特异性、敏感性以及重复性试验,证明该方法在核酸含量108拷贝/μL～101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;能够检测初始模板中10-3EID50的病毒核酸及16拷贝的标准品;与其它相关的鸡源病毒均无交叉反应,并且批内、批间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。该检测方法的建立为ILTV的临床检测和定量分析提供了一种快速、准确的技术手段。 展开更多
关键词 鸡传染性喉气管炎病毒 GB基因 taqman real-time pcr
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盖塔病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
9
作者 顾志刚 郭洁真 +4 位作者 王子涵 孙彤 陈鸿军 孙竹筠 陈丹清 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期112-118,共7页
盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒,可通过蚊虫传播感染人畜,导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状,可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列,设计3组引... 盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒,可通过蚊虫传播感染人畜,导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状,可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列,设计3组引物探针,筛选出最佳的引物探针,建立一种灵敏度高、特异性强的针对盖塔病毒的TaqMan探针实时荧光定量RTPCR检测方法。对该方法进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品检测。标准曲线Ct值与相应质粒标准品浓度存在良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9989;对含GETV基因的重组质粒pCDNA3.1-nsP1体外转录RNA进行敏感性试验,最低检出限达10 copies,是普通RT-PCR方法的1000倍,敏感性高;与PRRSV、CSFV与PEDV的核酸不发生交叉反应,特异性好;变异系数小于2%,重复性好。本研究建立了一种敏感、特异的GETV检测方法,对GETV的快速诊断具有重要意义。 展开更多
关键词 盖塔病毒 nsP1 taqman探针 实时荧光定量RT-pcr
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猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法
10
作者 张岳 孙彤 +5 位作者 郭洁真 魏晓锋 熊炜 刘静宜 陈鸿军 陈丹清 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期119-124,共6页
猪巨细胞病毒(PCMV)感染可导致猪食欲废绝,母猪流产,产木乃伊胎,仔猪发育不良等临床症状,且分布广泛,对异种器官移植也存在潜在威胁。本研究针对PCMV保守基因DPOL设计引物探针,建立TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示:检测限可达10拷... 猪巨细胞病毒(PCMV)感染可导致猪食欲废绝,母猪流产,产木乃伊胎,仔猪发育不良等临床症状,且分布广泛,对异种器官移植也存在潜在威胁。本研究针对PCMV保守基因DPOL设计引物探针,建立TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示:检测限可达10拷贝,灵敏度高;变异系数<2%,标准曲线R2=0.998,重复性好,具有高特异性;对上海市及江苏省常州市170份血清样本进行检测,5份样品为可疑结果。本研究建立的方法可用于养殖场猪感染PCMV的筛查,对该病防控具有重要意义。 展开更多
关键词 猪巨细胞病毒 DPOL基因 taqman探针 实时荧光定量pcr
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蝗虫微孢子TaqMan探针Real-time PCR检测新方法
11
作者 扈鸿霞 郑秋英 +2 位作者 叶小芳 赵贝 季荣 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2017年第6期796-802,共7页
蝗虫微孢子已被广泛运用于蝗虫防治。本研究采用蝗虫微孢子保守性高的小核糖体亚单位RNA为目的基因,将其克隆到pMD18-T载体上构建重组质粒,制备质粒标准品。设计一对特异性引物和TaqMan探针,并对引物浓度、探针浓度分别进行了优化,建立... 蝗虫微孢子已被广泛运用于蝗虫防治。本研究采用蝗虫微孢子保守性高的小核糖体亚单位RNA为目的基因,将其克隆到pMD18-T载体上构建重组质粒,制备质粒标准品。设计一对特异性引物和TaqMan探针,并对引物浓度、探针浓度分别进行了优化,建立了蝗虫微孢子TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。该检测方法的灵敏度达1.29×105 copies/L,各浓度质粒标准品的组内和组间重复的变异系数均小于1%。这里建立的蝗虫微孢子TaqMan探针荧光定量PCR检测方法较快速、简便和准确,适用于生产中蝗虫微孢子的快速检测。 展开更多
关键词 蝗虫微孢子 real-time pcr taqman探针
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DNA实验室人源性DNA污染TaqMan qPCR检测方法的建立及应用
12
作者 沈高芳 周咏松 +4 位作者 张健球 嵇世有 吴应锋 尚昊 朱波峰 《法医学杂志》 北大核心 2025年第1期66-73,共8页
目的基于实时定量PCR(real time quantitative PCR,qPCR)技术,建立一种灵敏度高、特异性好的人源性DNA检测方法,以实现对DNA实验室中潜在DNA污染源的快速检测。方法以人18S rRNA基因的参考序列为模板,用Primer ExpressTM设计引物和探针... 目的基于实时定量PCR(real time quantitative PCR,qPCR)技术,建立一种灵敏度高、特异性好的人源性DNA检测方法,以实现对DNA实验室中潜在DNA污染源的快速检测。方法以人18S rRNA基因的参考序列为模板,用Primer ExpressTM设计引物和探针,用矩阵法筛选最优引物-探针组合。用人18S rRNA基因靶标序列的PCR扩增产物构建质粒,并用质粒标准品绘制qPCR体系的标准曲线。参照《实时定量PCR实验发表的最少信息要求指南》(the MIQE guidelines)要求,评估qPCR体系的特异性、灵敏度、重复性及应用效果。结果建立的qPCR体系的分析灵敏度为5.3×10^(-5) ng/μL,对人源性DNA样本具有较好的特异性。qPCR体系的相关系数为-0.999,扩增效率为100%,批次内和批次间变异系数均小于2%。结论建立的人源性DNA qPCR检测方法的特异性好、灵敏度高、稳定性好,可用于DNA实验室污染的快速检测和实验室环境中累积的人源性DNA的日常监控。 展开更多
关键词 法医遗传学 DNA污染 实验室 实时定量pcr(qpcr) taqman探针 法医DNA分析
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猪链球菌2型的Real-time PCR定量检测研究 被引量：6
13
作者 蒋鲁岩 蔡潭溪 陈国强 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期843-845,850,共4页
目的 建立了基于TaqMan探针的Real-time PCR方法，实时、定量检测猪链球菌2型。针对GenBank公布的猪链球菌2型的csp2J基因序列设计一对引物和TaqMan探针，建立了Real-time PCR检测方法，制作标准曲线，定量检测猪链球菌2型。通过对6种... 目的 建立了基于TaqMan探针的Real-time PCR方法，实时、定量检测猪链球菌2型。针对GenBank公布的猪链球菌2型的csp2J基因序列设计一对引物和TaqMan探针，建立了Real-time PCR检测方法，制作标准曲线，定量检测猪链球菌2型。通过对6种细菌（9株菌株）的DNA进行扩增。结果所有4株猪链球菌2型均可产生扩增曲线，其他5株非猪链球菌2型均不产生扩增曲线。细菌纯培养物的检测敏感度为6～8CFU／PCR反应体系，相关系数均为0．99（r^2=0．99），整个试验可在1．5h内完成。建立的方法可用于猪链球菌2型的快速、定量检测。 展开更多
关键词 taqman探针 real-time pcr 猪链球菌csp2J基因 定量检测
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Real-time PCR和常规PCR方法快速鉴定肉骨粉中的牛源性成份 被引量：11
14
作者 李林 陈继明 王志亮 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期50-54,共5页
疯牛病是一种严重危害动物和人类健康的疾病 ,其病原朊病毒可以通过食物链进行传播 ,因此建立准确的检测牛源性成份的方法非常重要。我们采用常规PCR和Real_timePCR中的TaqMan技术建立了快速鉴定牛源性成份的方法 ,使用Chelex_10 0提取... 疯牛病是一种严重危害动物和人类健康的疾病 ,其病原朊病毒可以通过食物链进行传播 ,因此建立准确的检测牛源性成份的方法非常重要。我们采用常规PCR和Real_timePCR中的TaqMan技术建立了快速鉴定牛源性成份的方法 ,使用Chelex_10 0提取肉骨粉中的DNA ,过程简单可靠仅需要 2 0min左右。对不同含量的牛肉骨粉进行检测 ,常规PCR能够检测到的最低含量是 0 0 0 1% ,而Real_timePCR对相同的样品进行检测所得到的灵敏度更高 ,最高可达到 0 0 0 0 1% ,两种PCR方法的鉴定过程都非常简单快速 ,各需要 2h左右。 展开更多
关键词 牛海绵状脑病 肉骨粉 Real—tinm pcr taqman探针
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Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立 被引量：5
15
作者 陈晓 曾志磊 +3 位作者 朱丹 彭丹 余建萍 谢鹏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1107-1110,共4页
目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建... 目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。 展开更多
关键词 西尼罗病毒 real—time RT—pcr 一步法 taqman探针 快速检测
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类NADC34 PRRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：1
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作者 袁丽莉 朱振邦 +5 位作者 刘盼娆 陈南华 李燕华 范娟 陈昌海 李向东 《中国动物传染病学报》 北大核心 2024年第6期81-88,共8页
类NADC34 PRRSV自2018年在我国首次报道以来,流行范围不断扩大,在局部地区已演变为优势毒株。目前尚无针对类NADC34 PRRSV特异性的普通PCR或real-time PCR诊断方法,常规的PRRSV分型与鉴别诊断方法可能导致此类毒株被误诊为类NADC30 PRRS... 类NADC34 PRRSV自2018年在我国首次报道以来,流行范围不断扩大,在局部地区已演变为优势毒株。目前尚无针对类NADC34 PRRSV特异性的普通PCR或real-time PCR诊断方法,常规的PRRSV分型与鉴别诊断方法可能导致此类毒株被误诊为类NADC30 PRRSV。因此,本研究根据类NADC30 PRRSV与类NADC34 PRRSV在Nsp2基因的序列差异,设计特异性引物和探针,建立了类NADC34 PRRSV TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:本研究建立的方法特异性良好;不同稀释度的阳性标准质粒在2.8×10^(1)~2.8×10^(6)copies/μL具有良好的线性范围,标准曲线R^(2)值为0.997;本方法灵敏度高,检测下限为2.8×10^(1)copies/μL;重复性分析结果显示,批内和批间试验的变异系数CV值均小于2.5%,呈现出良好的重复性。综上,本研究成功建立了快速检测类NADC34 PRRSV的实时荧光定量PCR方法,为开展此类毒株在我国流行状况的调查提供了有力的检测工具。 展开更多
关键词 类NADC34 PRRSV taqman探针 实时荧光定量pcr
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Real-Time PCR检测棘阿米巴方法建立及应用 被引量：1
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作者 秦茜 谷禾 +2 位作者 梁韶晖 韩真真 郑善子 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期158-162,共5页
目的采用TaqMan探针法建立检测棘阿米巴18srDNA的实时荧光定量PCR（Real—timePCR）方法，为早期诊断棘阿米巴病提供基因诊断标准方法。方法提取实验室培养的4株土壤中分离的和1株水中分离的不同基因型棘阿米巴DNA，测序后在物种保守区... 目的采用TaqMan探针法建立检测棘阿米巴18srDNA的实时荧光定量PCR（Real—timePCR）方法，为早期诊断棘阿米巴病提供基因诊断标准方法。方法提取实验室培养的4株土壤中分离的和1株水中分离的不同基因型棘阿米巴DNA，测序后在物种保守区域设计Real—time引物和TaqMan探针，用建立的方法检测动物模型兔眼分泌物、大肠杆菌、人巨细胞病毒、卡式肺孢子虫、疑似棘阿米巴角膜炎160例病人眼分泌物。结果与传统实验室培养病原相比，所建立的qPCR检测棘阿米巴角膜炎方法测定大肠杆菌、人巨细胞病毒和卡式肺孢子虫与该研究的实验室分离棘阿米巴物种没有交叉反应，检测结果均为阴性。而160例疑似病人，用培养法检测出感染棘阿米巴患者为5例，用qPCR方法检测出6例，其中5例为培养法测出患者，qPCR方法检测阳性率（3．75％）略高于普通培养法（3．13％），但无统计学意义（P〉O．05）。qPCR方法在95％置信区间中灵敏度100％（47．95％～100％）高于普通培养法83．33％（36．10％～97．24％）。结论所建立测定棘阿米巴18srDNA的Real-timePCR基因检测方法具有无创伤性、高效、特异、经济等特点，适用于疑似棘阿米巴角膜炎病人门诊筛选的有效方法。 展开更多
关键词 棘阿米巴 taqman探针 18s RDNA real-time pcr qpcr
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尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法建立 被引量：1
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作者 孙彤 孙竹筠 +3 位作者 刘静宜 王培培 苏苌 陈鸿军 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期122-128,共7页
尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV... 尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV与其他猪病病毒,扩增效率为102%,最低检测限14.8 copies/μL,敏感性高于常规PCR 10倍,该检测方法的建立可为NiV的快速检测提供技术手段,对促进猪类养殖业的健康发展具有重要意义。 展开更多
关键词 尼帕病毒 N基因 taqman探针 实时荧光定量pcr
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鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 陈平平 嵇辛勤 +5 位作者 阮涌 王晗晗 罗晓宇 安而立 龙丹丹 段志强 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第10期75-80,共6页
为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性... 为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒(DTMUV) taqman探针 实时荧光定量pcr(qpcr)
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塔城病毒Ⅰ型TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 徐昭艳 姜峰 +3 位作者 陈瑶 金鑫 陈泽良 韩小虎 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第5期83-92,共10页
建立快速特异的蜱传塔城病毒Ⅰ型(TcTV-Ⅰ)荧光定量PCR检测方法,用于TcTV-Ⅰ的初步筛查。选用TcTV-Ⅰ糖蛋白G基因设计特异性引物以及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,与TcTV-... 建立快速特异的蜱传塔城病毒Ⅰ型(TcTV-Ⅰ)荧光定量PCR检测方法,用于TcTV-Ⅰ的初步筛查。选用TcTV-Ⅰ糖蛋白G基因设计特异性引物以及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,与TcTV-Ⅱ、新布尼来病毒(Severe fever with thrombocytopenia virus,SFTSV)、森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)、大别山病毒(Dabieshan orthohanta virus,DBSV)、阿龙山病毒(Alongshan virus,ALSV)等常见蜱传病毒均无交叉反应;标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板拷贝数之间呈良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.9999;具有良好的敏感性,最低检测限为1.10×10^(1)copies/μL,灵敏度是常规PCR的10^(3)倍;具有较好的稳定性,组内和组间的变异系数均低于2%。采用本方法对辽宁、内蒙古及新疆地区的425份蜱样本就行检测,只有新疆地区的19份蜱样本呈阳性。结果表明本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性,可用于TcTV-Ⅰ的快速检测、流行病学调查和疫情监测等。 展开更多
关键词 蜱 实时荧光定量pcr 塔城病毒 taqman探针
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