T7噬菌体展示人肺癌cDNA文库筛选丹参-人参组分复方靶点研究 被引量：3

1

作者 李变英 陈飞燕 +3 位作者 陈建平 毕蕾 高静 陈卫平 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期745-750,共6页

目的通过噬菌体展示技术筛选丹参-人参组分复方(丹参总酚酸、人参总皂苷、人参多糖)的作用靶点。方法经过T7噬菌体展示人肺癌c DNA文库的4轮淘选,获得阳性噬菌体克隆,随机挑选10个克隆进行DNA提取和测序。基因序列用Ex PASy网站的Transl... 目的通过噬菌体展示技术筛选丹参-人参组分复方(丹参总酚酸、人参总皂苷、人参多糖)的作用靶点。方法经过T7噬菌体展示人肺癌c DNA文库的4轮淘选,获得阳性噬菌体克隆,随机挑选10个克隆进行DNA提取和测序。基因序列用Ex PASy网站的Translate tool查找开放阅读框(ORF)。选取代表性多肽用生物膜干涉技术检测亲和力。结果 4轮淘选后阳性噬菌体克隆得到高度富集,10个样品中7个有相同的DNA序列,长度为471 bp(序列1),另外3个完全一致,长度为58 bp(序列2)。序列1得到4个ORFs,序列2未进行分析。丹参-人参组分复方和多肽His-MNTGRFGKTTSSPALTLGNFQKPL亲和力最高,K_D=4.57×10^(-8)mol/L,人参多糖、丹参总酚酸和多肽亲和力分别为K_D=7.23×10^(-8)mol/L、K_D=7.66×10^(-8)mol/L,人参总皂苷与多肽没有典型的结合和解离效应。结论本研究获得了与丹参-人参组分复方高亲和力多肽,为丹参-人参组分复方肺癌靶向治疗研究提供依据。 展开更多

关键词 t7噬菌体展示人肺癌cdna文库 丹参-人参组分复方 靶点 多肽 生物膜干涉技术 亲和力

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新孢子虫cDNAT7噬菌体展示文库的构建及筛选 被引量：3

2

作者 王铭 高洋 +3 位作者 程子英 郑君 贾洪林 宋铭忻 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期277-280,共4页

为筛选犬新孢子虫相关抗原,本研究利用T7噬菌体展示技术构建犬新孢子虫cDNA文库,并利用阳性血清筛选新型犬新孢子虫抗原蛋白。所构建的新孢子虫cDNA文库的原始文库重组克隆数为6×106pfu,扩增后文库滴度为3×1010pfu/mL。分别... 为筛选犬新孢子虫相关抗原,本研究利用T7噬菌体展示技术构建犬新孢子虫cDNA文库,并利用阳性血清筛选新型犬新孢子虫抗原蛋白。所构建的新孢子虫cDNA文库的原始文库重组克隆数为6×106pfu,扩增后文库滴度为3×1010pfu/mL。分别提取犬新孢子虫免疫小鼠血清和感染小鼠血清中的IgG,并利用纯化的IgG对构建的新孢子虫cDNA文库进行筛选。经过3轮筛选,共鉴定出14个不同的犬新孢子虫基因插入片段。经过分析,有7个基因编码的是功能未知蛋白,其它为蛋白质合成相关蛋白、核苷酸代谢相关蛋白、核糖体蛋白、微线体蛋白、棒状体蛋白和致密颗粒蛋白。对这些蛋白的进一步研究将有助于开发新孢子虫病的诊断试剂和疫苗。 展开更多

关键词 新孢子虫病 t7噬菌体展示文库 抗原候选基因

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家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库的构建和免疫相关基因的淘选 被引量：3

3

作者 胡翠美 王菲 +1 位作者 宋亮 夏庆友 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期642-649,共8页

中肠是昆虫重要的免疫防御器官之一。为探究家蚕中肠的分子免疫机制,尤其是针对不同病原体的模式识别分子或结合蛋白,以家蚕5龄第3天幼虫中肠为材料,构建家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库,并分别以几丁质和脂多糖为配体,通过不同方法进行... 中肠是昆虫重要的免疫防御器官之一。为探究家蚕中肠的分子免疫机制,尤其是针对不同病原体的模式识别分子或结合蛋白,以家蚕5龄第3天幼虫中肠为材料,构建家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库,并分别以几丁质和脂多糖为配体,通过不同方法进行文库的生物淘选。结果共获得10个基因片段,其中在以脂多糖为配体的淘选中获得了β-1,3葡聚糖识别蛋白4,该分子是已知的模式识别受体。另外还获得了多个免疫相关候选基因,如分别编码几丁质结合蛋白、翻译控制的肿瘤蛋白、氨肽酶N、脂肪酰辅酶A结合蛋白等的几个基因。研究结果为深入开展家蚕中肠免疫功能的研究提供了重要线索。 展开更多

关键词 家蚕 中肠 t7噬菌体展示文库 淘选 模式识别分子

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东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的构建 被引量：1

4

作者 贾人初 孙毅 +7 位作者 刘金明 傅志强 苑纯秀 石耀军 陆珂 孙焕 李浩 林矫矫 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期5-9,共5页

本项研究的目的是构建东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因奠定基础。用TRIzol试剂提取东方田鼠肝脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并用EcoRⅠ... 本项研究的目的是构建东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因奠定基础。用TRIzol试剂提取东方田鼠肝脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并用EcoRⅠ和HindⅢ酶切,使其两端分别带EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端。用Mini Column纯化、收集300bp以上的双链cDNA片段,再连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7Select10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。经测定,库容量为1.3×107PFU/mL,扩增后文库滴度为1.8×1011PFU/mL。对从原始文库中随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为91.7%,阳性克隆片段大小分布在200bp～1000bp,其中有95.5%的插入片段大于300bp。用日本血吸虫童虫可溶性抗原对文库进行了初筛,得到了21个ESTs,将这些阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养,其中大部分克隆诱导的童虫死亡率比阴性噬菌体对照高出2%～13%。 展开更多

关键词 东方田鼠 肝脏 t7噬菌体展示 cdna文库

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PK15细胞cDNA T7噬菌体展示文库的构建及鉴定 被引量：1

5

作者 王国栋 邓小芸 刘书梅 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1372-1376,共5页

【目的】构建PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库，为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础。【方法】分离纯化PK15细胞mRNA，先后合成第一链和第二链cDNA，经平末端修饰后，定向导入EcoR Ⅰ和HindⅢ接头，再由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消... 【目的】构建PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库，为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础。【方法】分离纯化PK15细胞mRNA，先后合成第一链和第二链cDNA，经平末端修饰后，定向导入EcoR Ⅰ和HindⅢ接头，再由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化，与噬菌体载体臂相连，然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装，形成初级cDNAT7噬菌体展示文库，并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量。【结果】经噬斑试验鉴定，初级文库滴度为2．0×10^5PFU／mL，扩增后滴度达6．0×10^10PFU／mL。PCR鉴定结果显示，文库的重组率为95．83％，且插入片段主要分布于500-2000bp，其中500～750bp的占21．73％，750～100bp的占21．73％，1000-2000bp的占39．13％。随机挑选20个克隆进行测序，发现均为猪源序列。【结论】构建的PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率，质量良好，符合后续文库筛选的要求，可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用。 展开更多

关键词 PK15细胞 cdna t7噬菌体展示文库 构建 鉴定

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微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库的构建 被引量：6

6

作者 姚龙泉 尹继刚 +1 位作者 张西臣 李建华 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期26-28,42,共4页

目的为筛选微小隐孢子虫保护性抗原基因,构建了微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库。方法用Trizol试剂提取微小隐孢子虫总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,用EcoRⅠ和HindⅢ消化接头,使形... 目的为筛选微小隐孢子虫保护性抗原基因,构建了微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库。方法用Trizol试剂提取微小隐孢子虫总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,用EcoRⅠ和HindⅢ消化接头,使形成两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。经Mini Column纯化,收集400bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示文库。结果经测定,库容量为1.2×107pfu/mL,重组率为96.7%,扩增后文库滴度为2.4×1010pfu/mL。对随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,92%的插入片段大于400bp。结论成功构建了微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库。 展开更多

关键词 微小隐孢子虫 t7噬菌体展示文库

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鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建和鉴定 被引量：3

7

作者 赵绪永 张改平 +1 位作者 朱礼倩 李清州 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2008年第7期100-103,共4页

构建鸡胚成纤维细胞(CEF)T7噬菌体表达型cDNA文库,为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定基础。提取纯化CEF的mRNA,反转录合成双链cDNA,补平末端,连接EcoRⅠ/HindⅢ接头,双酶切,凝胶过滤层析除去小于400bp的cDNA片段,合成双链cDNA定向与T7... 构建鸡胚成纤维细胞(CEF)T7噬菌体表达型cDNA文库,为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定基础。提取纯化CEF的mRNA,反转录合成双链cDNA,补平末端,连接EcoRⅠ/HindⅢ接头,双酶切,凝胶过滤层析除去小于400bp的cDNA片段,合成双链cDNA定向与T7噬菌体左右臂连接,体外包装后建成cDNA表达文库。测定文库大小、重组率,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果表明,构建的cDNA文库滴度为2.2×107pfu/mL、扩增后滴度为3.5×1010pfu/mL,重组效率达98%、插入片段多在0.4～3kb之间,平均插入片段长约1.3kb。表明所建文库具有很高的质量,从而为筛选目的cDNA克隆奠定了基础。 展开更多

关键词 鸡胚成纤维细胞(CEF) t7噬菌体 cdna表达文库

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结核分枝杆菌T7噬菌体展示基因组DNA文库的构建与鉴定 被引量：1

8

作者 曾焱华 王丽 +3 位作者 刘海灿 游晓拢 邓湘赢 万康林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1120-1123,共4页

目的利用T7噬菌体作为载体,构建结核分枝杆菌的基因组DNA文库。方法提取MTB的基因组DNA,用EcoR I和Hind III进行双酶切,以对基因组DNA进行片段化,并在其末端加上定向的EcoR I和Hind III黏性末端,用DNA片段纯化分离柱除去小于200bp的片... 目的利用T7噬菌体作为载体,构建结核分枝杆菌的基因组DNA文库。方法提取MTB的基因组DNA,用EcoR I和Hind III进行双酶切,以对基因组DNA进行片段化,并在其末端加上定向的EcoR I和Hind III黏性末端,用DNA片段纯化分离柱除去小于200bp的片段和多余接头。将DNA片段与T7 10-3b噬菌体连接,经包装蛋白进行包装后转入BLT5403宿主菌以构建T7噬菌体展示基因组DNA文库,并检测文库的滴度和随机性。结果成功提取到较高质量的MTB基因组DNA;构建的T7噬菌体展示基因组DNA文库的滴度约为6×106 pfu/cm3;用PCR检测结果表明,在随机挑取的16个噬菌斑中,其重组率为100%,且插入片段都介于250~2 000bp左右。结论成功构建了MTB T7噬菌体展示基因组DNA文库,为从基因组范围筛选MTB的优势抗原奠定了前期实验基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 基因组DNA t7噬菌体展示文库

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应用改进的多聚组氨酸标签T7表达载体构建肺癌cDNA文库 被引量：1

9

作者 董晓民 钟理 +1 位作者 樊江平 张旭朏 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期475-481,共7页

应用噬菌体C端展示系统构建的cDNA文库缺乏开放阅读框筛选机制,文库中多数噬菌体克隆展示框外非天然短肽,给后期蛋白质的筛选带来了不便.为实现噬菌体的ORF筛选功能,利用PCR技术对已有载体T7Select10-3b进行改造,在MCS处外源cDNA插入位... 应用噬菌体C端展示系统构建的cDNA文库缺乏开放阅读框筛选机制,文库中多数噬菌体克隆展示框外非天然短肽,给后期蛋白质的筛选带来了不便.为实现噬菌体的ORF筛选功能,利用PCR技术对已有载体T7Select10-3b进行改造,在MCS处外源cDNA插入位点的3'端引入6聚组氨酸筛选标签,经包装后挑取成功表达的单克隆构建肺癌cDNA文库.经镍柱亲和层析后,收集文库中表达组氨酸的克隆,利用化学发光免疫试验进行筛选效果鉴定.结果显示,改造的新型载体可成功表达组氨酸标签,以此构建的肺癌cDNA文库经筛选后,含ORF插入的克隆由筛前的6%提高至70%,本研究为提高cDNA文库的质量提供了一种简便可行的方法. 展开更多

关键词 组氨酸标签 t7噬菌体展示文库 开放阅读框

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犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库的构建

10

作者 韩岩岩 宋德光 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第5期49-52,共4页

试验旨在筛选水泡性口炎病毒的受体,构建犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。通过用Trizol试剂提取犊牛口腔黏膜上皮细胞总RNA,然后分离和纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,然后用EcoRⅠ和H... 试验旨在筛选水泡性口炎病毒的受体,构建犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。通过用Trizol试剂提取犊牛口腔黏膜上皮细胞总RNA,然后分离和纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,然后用EcoRⅠ和HindⅢ酶消化双链cDNA末端接头,使双链cDNA 2端含有EcoRⅠ和HindⅢ黏性末端。所有处理后的双链cDNA,经Mini Column纯化,收集400bp以上的双链cDNA片段,将其连接带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示文库。经测定未扩增文库的滴度为1.3×107PFU/mL,重组率为95.8%,扩增后文库滴度为2.6×1010 PFU/mL。随机挑取100个噬菌斑进行PCR鉴定,95%的插入片段大于400bp。结果表明成功构建了犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。 展开更多

关键词 口腔黏膜上皮细胞 t7噬菌体展示文库 水泡性口炎病毒

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T7噬菌体表达载体的组氨酸改造及应用

11

作者 樊江平 钟理 +2 位作者 董晓民 张旭朏 王志强 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期179-183,共5页

利用基因重组技术,对已有载体T7 Select10-3b进行改造,得到被组氨酸标签标记(His-Tag)的新型表达载体,并利用该载体构建cDNA文库,为后期开放阅读框的筛选提供更为简便有效的方法。以T7 Select10-3b载体为出发材料,将复性得到组氨酸标签... 利用基因重组技术,对已有载体T7 Select10-3b进行改造,得到被组氨酸标签标记(His-Tag)的新型表达载体,并利用该载体构建cDNA文库,为后期开放阅读框的筛选提供更为简便有效的方法。以T7 Select10-3b载体为出发材料,将复性得到组氨酸标签表达序列插入其多克隆位点处。再利用包装蛋白包装重组DNA,得到有侵染活性的重组T7噬菌体。用该载体构建乳腺癌cDNA文库,过镍柱,筛选开放阅读框(open reading frame,ORF),计算ORF重组率。测序结果显示该标签已经成功插入,化学发光免疫检测显示该标签在T7中表达。重组T7噬菌体文库的ORF筛选率由筛选前的5.6%提高到82%。T7噬菌体中插入的His标签对提高cDNA文库中ORF的重组率具有重要意义。 展开更多

关键词 His标签 t7噬菌体 cdna文库 ORF

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噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

12

作者 田栢会 易乐 +8 位作者 王习文 李颂 付世杰 王雨田 曲晗 李志萍 王丽萍 张淑华 夏志平 《吉林大学学报（理学版）》 CAS 北大核心 2019年第4期989-996,共8页

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库.首先,从GeneBank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因,将其截短、修饰、简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列.其次,将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、酶切,链接... 构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库.首先,从GeneBank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因,将其截短、修饰、简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列.其次,将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、酶切,链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上,构成重组噬菌体DNA.最后,重组噬菌体DNA经体外包装和扩增,得到T7噬菌体展示文库,并进行T7噬菌体展示文库滴度、重组率和免疫活性测定.实验结果表明,从Gene Bank中查找、筛选、剪切和修饰共获得96258条序列构建T7噬菌体展示文库,原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL,重组率大于90%.用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获,经聚合酶链式反应(PCR)鉴定,得到理想目的条带,证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性,可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选。 展开更多

关键词 t7噬菌体 噬菌体展示 禽流感病毒 抗原变异性基因 文库鉴定

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