微孢子虫孢壁蛋白的研究

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作者 陈洁 胡婉莹 +4 位作者 龙梦娴 李田 李春峰 潘国庆 周泽扬 《蚕学通讯》 2025年第2期13-21,共9页

微孢子虫(microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核微生物,可危害动物及人类健康。微孢子虫以孢子形式存在于环境中,其孢壁主要由富含蛋白质的孢外壁、富含几丁质的孢内壁以及孢原质膜组成。本文综述了国内外微孢子虫孢壁蛋白... 微孢子虫(microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核微生物,可危害动物及人类健康。微孢子虫以孢子形式存在于环境中,其孢壁主要由富含蛋白质的孢外壁、富含几丁质的孢内壁以及孢原质膜组成。本文综述了国内外微孢子虫孢壁蛋白研究的最新进展。研究表明,孢壁蛋白在结构和功能上均表现出显著的物种特异性。孢壁蛋白在微孢子虫的生理活动中发挥关键作用,参与孢子形成、增殖、发芽、黏附和侵染等多个生物学过程。本文系统地分析了孢壁蛋白的种类、结构特征及其生物学功能,重点阐述孢壁蛋白在宿主细胞黏附、侵染和增殖过程中的关键作用,并探讨其在揭示寄生虫生物学特性中的重要意义。通过总结现有的研究成果,为未来相关领域的研究及抗微孢子虫感染新策略的开发提供参考。 展开更多

关键词 微孢子虫 孢壁结构 孢壁蛋白 功能分类

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家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP14的鉴定

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作者 马成 杨东林 +3 位作者 陈洁 潘国庆 李田 周泽扬 《蚕学通讯》 2025年第2期46-52,共7页

微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,在环境中以孢子形式存在。其成熟孢子的孢壁主要由蛋白质和几丁质组成,在维持孢子抗性、粘附宿主及促进发芽侵染等方面具有重要作用。基于前期孢壁蛋白质组质谱数据,本研究鉴定出一个新... 微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,在环境中以孢子形式存在。其成熟孢子的孢壁主要由蛋白质和几丁质组成,在维持孢子抗性、粘附宿主及促进发芽侵染等方面具有重要作用。基于前期孢壁蛋白质组质谱数据,本研究鉴定出一个新的孢壁蛋白NbSWP14。该蛋白的开放阅读框长度为1269 bp,编码423个氨基酸,理论分子量为50 kDa,等电点为9.10,含有信号肽序列,生物信息学分析显示其具有较高的热稳定性。RT-PCR分析结果表明,NbSWP 14基因在家蚕微孢子虫感染家蚕后2~10天均持续转录。通过构建大肠埃希菌(Escherichia coli)E.coli Rosetta[pColdⅠ-NbSWP 14]重组菌,经原核表达和Ni柱亲和层析纯化获得重组蛋白,并成功制备了NbSWP14的多克隆抗体。免疫印迹分析证实家蚕微孢子虫孢子总蛋白中存在NbSWP14蛋白。间接免疫荧光实验结果显示,该蛋白定位于家蚕微孢子虫成熟孢子的孢壁上。本研究扩充了微孢子虫孢壁蛋白的组成信息,为后续开展NbSWP14蛋白的功能研究提供了重要基础。 展开更多

关键词 家蚕微孢子虫 孢壁蛋白 序列特征 免疫荧光定位

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家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白提取方法的优化研究 被引量：9

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作者 吴正理 谭小辉 +2 位作者 潘国庆 李艳红 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期62-66,共5页

分别用SDS法、煮沸法、碱溶法和Brosson法，提取家蚕微孢子虫孢壁蛋白，并对孢壁蛋白及处理后的孢子形态进行比较研究。结果表明，不同方法处理后的孢子形态均保持完整，SDS处理后孢子为短杆状且明显变得粗壮．煮沸处理后孢子变小呈梭... 分别用SDS法、煮沸法、碱溶法和Brosson法，提取家蚕微孢子虫孢壁蛋白，并对孢壁蛋白及处理后的孢子形态进行比较研究。结果表明，不同方法处理后的孢子形态均保持完整，SDS处理后孢子为短杆状且明显变得粗壮．煮沸处理后孢子变小呈梭形，其他方法处理的孢子均有膨胀现象。SDS—PAGE检测显示，SDS法提取的孢壁蛋白出现3条明显的主带，煮沸法提取的孢壁蛋白出现5条明显的主带，0．1mol／L KOH提取的孢壁蛋白出现2条主带；而Brosson法提取的孢壁蛋白呈现出20～30条带，体现了家蚕微孢子虫孢壁蛋白组成的复杂性，并适合于孢壁蛋白质组学的研究。 展开更多

关键词 孢壁蛋白 家蚕微孢子虫 形态检测

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柞蚕微孢子虫3种孢壁蛋白的提取与鉴定 被引量：6

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作者 王伯阳 姜义仁 +3 位作者 杨瑞生 李艳卓 王勇 秦利 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期330-336,共7页

在微孢子虫侵染宿主的过程中,孢壁蛋白扮演着重要的角色。分别采用沸水浴法、SDS法从柞蚕微孢子虫(Nosema per-nyi,Np)孢子中提取孢壁蛋白以及利用发芽后的孢子壳提取孢壁蛋白,对提取的孢壁蛋白进行SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果显示,... 在微孢子虫侵染宿主的过程中,孢壁蛋白扮演着重要的角色。分别采用沸水浴法、SDS法从柞蚕微孢子虫(Nosema per-nyi,Np)孢子中提取孢壁蛋白以及利用发芽后的孢子壳提取孢壁蛋白,对提取的孢壁蛋白进行SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果显示,将发芽后的孢子壳以沸水浴法提取孢壁蛋白最为有效,但操作复杂,部分孢壁蛋白损失严重。初步鉴定从发芽后的孢子壳中提取的编号为P35、P32和P29的3种蛋白属于柞蚕微孢子虫孢壁蛋白,蛋白分子质量分别为35、32、29 kD,其中孢壁蛋白P32的含量最丰富,P35和P29的含量相对较低。根据相应肽指纹图谱预测孢壁蛋白P32的一级结构类似核孔蛋白,可能与孢壁的选择透过性有关,而P35与VASA2n蛋白的一级结构类似,因此有可能与柞蚕微孢子虫的繁殖有关。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 孢壁蛋白 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

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家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25、SWP30、SWP32的表达谱分析 被引量：4

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作者 潘国庆 谭小辉 +3 位作者 党晓群 李田 郭广清 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期328-332,共5页

研究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的孢壁蛋白对于揭示家蚕微孢子虫感染宿主的分子机制具有重要意义。对已完成精细定位的家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25、SWP30、SWP32在家蚕中肠组织中的表达谱进行了分析。RT-PCR结果表明,SWP32在感染... 研究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的孢壁蛋白对于揭示家蚕微孢子虫感染宿主的分子机制具有重要意义。对已完成精细定位的家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25、SWP30、SWP32在家蚕中肠组织中的表达谱进行了分析。RT-PCR结果表明,SWP32在感染后24 h就可以检测到其转录本,SWP25、SWP30的转录本在感染后36 h可检测到,提示SWP32可能在孢子裂殖体阶段就需要发挥作用;3种孢壁蛋白在感染3 d后其转录本均达到较高水平,并在感染过程中持续保持,在感染后第10天仍能明显检出。3种孢壁蛋白在感染3 d后转录本量明显增加的现象与家蚕微孢子虫的生活史相符合,即:孢子母细胞在此阶段迅速增加并向成熟孢子转化,成熟孢子的孢壁在这一时期形成。3种孢壁蛋白的表达能在感染早期阶段的家蚕中肠组织中被检出,为进一步探讨3种蛋白的功能提供了线索,也为开发基于这3种蛋白的分子生物学及免疫学特异性的家蚕微粒子病早期诊断技术提供了理论依据。 展开更多

关键词 家蚕微孢子虫 孢壁蛋白 感染 中肠组织 表达谱

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家蚕微孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：3

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作者 李艳红 刘含登 +4 位作者 吴正理 潘国庆 谢俪 吴胜昔 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期138-141,共4页

用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)总蛋白为抗原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,第1次融合率为13.3%,第2次融合率为55.4%。建立间接酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immun... 用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)总蛋白为抗原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,第1次融合率为13.3%,第2次融合率为55.4%。建立间接酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体。初检阳性率分别为4.68%和5.26%。经3次亚克隆筛选获得了2株能稳定分泌抗家蚕微孢子虫的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G10和2B10。间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence test,IFAT)和Western-bloting分析证实所获得的单克隆抗体是特异针对家蚕微孢子虫蛋白的,将在孢子孢壁蛋白的研究中发挥重要作用。 展开更多

关键词 家蚕微孢子虫 孢壁蛋白 单克隆抗体 间接免疫荧光试验

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微孢子虫蛋白质及其与宿主互作的研究进展 被引量：4

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作者 吴正理 李艳红 宋元达 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期921-928,共8页

微孢子虫(protozoan:microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,可广泛寄生于几乎所有的动物。早期对微孢子虫的研究主要集中在对其种类的分离鉴定方面,随着大规模基因组测序的不断深入,极大地推动了微孢子虫的研究,尤其是... 微孢子虫(protozoan:microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,可广泛寄生于几乎所有的动物。早期对微孢子虫的研究主要集中在对其种类的分离鉴定方面,随着大规模基因组测序的不断深入,极大地推动了微孢子虫的研究,尤其是微孢子虫具有独特的进化地位以及基因组、细胞器和物质能量代谢途径等简化进化的特点,使其成为当前研究的热点。综述了该领域近10年来在微孢子虫总蛋白组成成分分析、极丝蛋白和孢壁蛋白的分离鉴定,以及孢壁蛋白与宿主的相互作用等方面的研究进展,并简要概述了该领域研究存在的问题及后续研究课题。 展开更多

关键词 微孢子虫 极丝蛋白 孢壁蛋白 宿主

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柞蚕微孢子虫孢壁蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 被引量：2

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作者 米锐 李亚洁 +4 位作者 孟楠 孙永欣 李学军 温志新 李树英 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期935-939,共5页

柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)孢壁蛋白在侵染宿主的过程中扮演重要角色,制备柞蚕微孢子虫孢壁蛋白多克隆抗体可为建立病害的快速诊断技术提供免疫试剂,并有利于研究孢壁蛋白的功能。采用沸水浴法提取柞蚕微孢子虫孢壁蛋白作为抗原免疫... 柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)孢壁蛋白在侵染宿主的过程中扮演重要角色,制备柞蚕微孢子虫孢壁蛋白多克隆抗体可为建立病害的快速诊断技术提供免疫试剂,并有利于研究孢壁蛋白的功能。采用沸水浴法提取柞蚕微孢子虫孢壁蛋白作为抗原免疫新西兰兔,收集纯化血清后得到柞蚕微孢子虫孢壁蛋白抗体。间接ELISA法检测制备的多克隆抗体效价达到1∶2.56×104。采用Western blotting方法在该多克隆抗体与柞蚕微孢子虫孢壁蛋白的免疫反应中检测到分子质量为32 kD的孢壁蛋白。该多克隆抗体对纯化后的柞蚕微孢子虫有较好的检测灵敏度,用于检测感染柞蚕微孢子虫的柞蚕蛹和蛾均呈现阳性结果。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 孢壁蛋白 多克隆抗体 酶联免疫吸附试验 免疫印迹分析

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柞蚕微孢子虫孢壁蛋白基因NpSWP1的克隆及序列分析与原核表达 被引量：1

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作者 文竹 姜义仁 +4 位作者 王斌赫 孙影 李喜升 王勇 秦利 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期688-693,共6页

微孢子虫孢壁蛋白在侵染宿主的过程中发挥着重要作用。从已构建的柞蚕微孢子虫cDNA文库中筛选出一条孢壁蛋白基因的EST序列,并结合柞蚕微孢子虫感染柞蚕中肠的转录组数据设计特异性引物进行RT-PCR和3'-RACE扩增,克隆得到了一个柞蚕... 微孢子虫孢壁蛋白在侵染宿主的过程中发挥着重要作用。从已构建的柞蚕微孢子虫cDNA文库中筛选出一条孢壁蛋白基因的EST序列,并结合柞蚕微孢子虫感染柞蚕中肠的转录组数据设计特异性引物进行RT-PCR和3'-RACE扩增,克隆得到了一个柞蚕微孢子虫孢壁蛋白基因。该基因ORF长837 bp,编码278个氨基酸,蛋白质分子质量32.02 kD,等电点(pI)7.02。通过Blast比对分析,该基因与家蚕微孢子虫孢子内壁蛋白基因NbSWP1(GenBank登录号:EOB12097.1)的序列相似度为85%,二者编码的氨基酸序列相似度达79%,将该基因命名为NpSWP1(GenBank登录号:KJ573111),初步推测NpSWP1是一种孢子内壁蛋白。将NpSWP1基因与原核表达载体pEASY-E1连接,构建原核表达重组质粒并转化Transetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导5 h后,SDS-PAGE和Western blot检测重组菌液能够产生与预期结果相近的大小约32 kD的目的融合蛋白。研究结果有利于进一步开展NpSWP1的细胞定位和功能研究。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 孢壁蛋白 基因克隆 原核表达 免疫印迹分析

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凯氏定氮法测定灵芝破壁孢子粉中粗蛋白质含量的不确定度评定 被引量：3

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作者 王红梅 雷萍 +1 位作者 王少鸥 刘海燕 《食用菌学报》 北大核心 2012年第2期73-76,共4页

对采用凯氏定氮法测定灵芝(Ganoderma lucidum)破壁孢子粉中粗蛋白含量的不确定度进行评定,结果表明合成相对标准不确定度为0.02%,扩展不确定度为0.04%。在本次孢子粉粗蛋白质测定中,引入不确定度的主要因素有盐酸标准溶液的浓度及样品... 对采用凯氏定氮法测定灵芝(Ganoderma lucidum)破壁孢子粉中粗蛋白含量的不确定度进行评定,结果表明合成相对标准不确定度为0.02%,扩展不确定度为0.04%。在本次孢子粉粗蛋白质测定中,引入不确定度的主要因素有盐酸标准溶液的浓度及样品测定中实际消耗的标准溶液体积。 展开更多

关键词 凯氏定氮法 灵芝破壁孢子粉 粗蛋白质含量 不确定度评定

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微孢子虫侵染研究进展 被引量：4

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作者 刘强波 万永继 《蚕学通讯》 2005年第1期19-24,共6页

微孢子虫种类繁多,侵染寄主过程十分复杂,pH值、离子种类及浓度、温度、射线等都能激活孢子发芽侵入寄主。近年来微孢子虫侵染机理研究已从激活因子推进到孢子生理生化的研究。研究表明:微孢子虫孢内糖类物质浓度的变化与孢子内压升高,... 微孢子虫种类繁多,侵染寄主过程十分复杂,pH值、离子种类及浓度、温度、射线等都能激活孢子发芽侵入寄主。近年来微孢子虫侵染机理研究已从激活因子推进到孢子生理生化的研究。研究表明:微孢子虫孢内糖类物质浓度的变化与孢子内压升高,诱发极丝的弹出密切相关;同时,微孢子虫孢子的表面蛋白、极膜和极管蛋白(PTP) 展开更多

关键词 侵染 研究进展 微孢子虫孢子 离子种类 生理生化 激活因子 机理研究 物质浓度 表面蛋白 寄主 pH值

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5株家蚕微孢子虫单克隆抗体的抗原鉴定

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作者 马成 杨东林 +3 位作者 陈洁 潘国庆 李田 周泽扬 《蚕学通讯》 2024年第4期95-99,共5页

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是引起家蚕微粒子病的病原。通过检测筛查带病蚕蛾或蚕卵以减少家蚕微孢子虫垂直传播对蚕种生产和家蚕养殖造成的危害,是防控微粒子病的主要方法。孢壁蛋白是家蚕微孢子虫孢壁结构组成的重要成分,且具有... 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是引起家蚕微粒子病的病原。通过检测筛查带病蚕蛾或蚕卵以减少家蚕微孢子虫垂直传播对蚕种生产和家蚕养殖造成的危害,是防控微粒子病的主要方法。孢壁蛋白是家蚕微孢子虫孢壁结构组成的重要成分,且具有种属特异性,是病原检测的主要靶标。本研究选取家蚕微孢子虫孢子发芽液制备的5株单克隆抗体,采用孢子体外发芽、孢壁蛋白原核表达及免疫印迹分析等方法,明确了5株单抗的抗原蛋白均为高丰度的孢壁蛋白NbSWP1。研究结果为利用NbSWP1作为免疫学检测靶标进行快速检测试纸条的研制提供了数据基础。 展开更多

关键词 家蚕微孢子虫 孢壁蛋白1 单克隆抗体 抗原鉴定

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柞蚕微孢子虫部分孢壁蛋白的分离鉴定及孢壁蛋白8的序列分析 被引量：3

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作者 张玺 许金山 +1 位作者 张小燕 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期949-956,共8页

研究柞蚕微孢子虫的孢壁蛋白组成和结构特点,有助于解明柞蚕微孢子虫在侵染过程中与蚕体细胞的互作机制。分别采用煮沸法和Laemmli法分离提取柞蚕微孢子虫总蛋白和孢壁蛋白,回收30kD左右的蛋白条带进行液质联用离子阱电喷雾质谱分析,获... 研究柞蚕微孢子虫的孢壁蛋白组成和结构特点,有助于解明柞蚕微孢子虫在侵染过程中与蚕体细胞的互作机制。分别采用煮沸法和Laemmli法分离提取柞蚕微孢子虫总蛋白和孢壁蛋白,回收30kD左右的蛋白条带进行液质联用离子阱电喷雾质谱分析,获得的短肽序列经Mascot在线检索工具进行蛋白同源序列比对,共鉴定出27种具有功能注释的蛋白,有3种注释为孢壁蛋白。其中获得了与家蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NbSWP8)高度同源的柞蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NaSWP8)的基因全长序列。序列分析表明NaSWP8与NbSWP8的氨基酸序列相似性达到90%,且均具有特征性的肝素结合基序,二者的编码基因核苷酸序列的非同义替换率和同义替换率比值(dN/dS)明显小于1,表明孢壁蛋白8基因在2种蚕类微孢子虫中受到纯化选择压力的作用,基因的功能相对稳定。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 孢壁蛋白 质谱鉴定 孢壁蛋白8 序列分析

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粉纹夜蛾培养细胞对家蚕微孢子虫的吞噬及与孢壁蛋白的关系 被引量：2

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作者 吴晓霞 冯真珍 +3 位作者 邱海洪 蔡顺风 李明乾 鲁兴萌 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期447-451,共5页

解明家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)入侵宿主细胞的相关因素,有助于深入研究Nb对家蚕的侵染机制。利用激光共聚焦显微镜观察Nb孢子接种粉纹夜蛾(Trichoplusiani,Tn)培养细胞48h后孢子的分布状态和培养细胞的生长情况,并对接种Nb孢子... 解明家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)入侵宿主细胞的相关因素,有助于深入研究Nb对家蚕的侵染机制。利用激光共聚焦显微镜观察Nb孢子接种粉纹夜蛾(Trichoplusiani,Tn)培养细胞48h后孢子的分布状态和培养细胞的生长情况,并对接种Nb孢子后的Tn培养细胞培养物总蛋白进行SDS-PAGE分析,证实经0.2mol/LKOH预处理的Nb孢子可以被Tn培养细胞所吞噬。对Nb孢子孢壁蛋白的SDS-PAGE分析显示,Nb孢子经KOH预处理后,大小为80kD和12kD的孢壁蛋白带缺失或明显减弱,30kD的孢壁蛋白带丰度降低。推测KOH预处理使Nb孢子部分孢壁蛋白被分解(部分或完全)或使蛋白结构发生变化,由此影响了Nb孢子与Tn培养细胞的相互作用关系,有利于Tn培养细胞对Nb孢子的吞噬。 展开更多

关键词 家蚕微孢子虫 粉纹夜蛾细胞系 吞噬 孢壁蛋白 激光共聚焦显微镜观察 SDS—PAGE电泳

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东方蜜蜂微孢子虫一新型孢壁蛋白的基因克隆、表达及亚细胞定位 被引量：2

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作者 熊亮 敖塘堰 +2 位作者 张真 马振刚 周泽扬 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期1070-1079,共10页

【目的】微孢子虫(Microsporidia)孢壁在孢子构成及孢子侵染宿主过程中扮演重要的角色。本研究旨在鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae新型孢壁蛋白,并进行基因克隆和原核表达,明确其亚细胞定位。【方法】通过在线软件对东方蜜... 【目的】微孢子虫(Microsporidia)孢壁在孢子构成及孢子侵染宿主过程中扮演重要的角色。本研究旨在鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae新型孢壁蛋白,并进行基因克隆和原核表达,明确其亚细胞定位。【方法】通过在线软件对东方蜜蜂微孢子虫新型孢壁蛋白AAJ76_1400036761序列进行生物信息学分析。利用PCR法获取目的片段并将其克隆至原核表达载体pCold II中,利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。以获得的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光技术和免疫胶体金定位技术对该蛋白进行亚细胞定位分析;利用蛋白质免疫印迹法检测该蛋白与东方蜜蜂微孢子虫几丁质壳的互作。【结果】在MicrosporidiaDB数据库中获得AAJ76_1400036761基因序列,基因全长681 bp,编码226个氨基酸;预测等电点为6.84,分子量为26.19 kD。SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明AAJ76_1400036761重组蛋白能够在大肠杆菌Eescherichia coli Rosetta中高量表达。Western blot结果表明,制备的多克隆抗体能够特异地识别东方蜜蜂微孢子虫总蛋白中的AAJ76_1400036761,说明其在成熟东方蜜蜂微孢子虫中有表达。亚细胞定位结果显示,AAJ76_1400036761定位于东方蜜蜂微孢子虫孢壁上。重组蛋白AAJ76_1400036761能够与蜜蜂微孢子虫的几丁质壳结合。【结论】AAJ76_1400036761蛋白在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中有表达;该蛋白定位于东方蜜蜂微孢子虫孢壁上,为东方蜜蜂微孢子虫新的孢壁蛋白。本研究为深入研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 东方蜜蜂微孢子虫 孢壁蛋白 原核表达 多克隆抗体 亚细胞定位

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东方蜜蜂微孢子虫一新孢壁蛋白NcER_100148的鉴定与生物学功能研究 被引量：1

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作者 敖塘堰 王静琳 +1 位作者 马振刚 周泽扬 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期747-758,共12页

【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae作为蜜蜂微孢子虫病的主要病原体,对其侵染机制的相关研究鲜有报道。本研究旨在对团队前期通过质谱鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148进行原核表达,明确其亚细胞定位,并初步探... 【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae作为蜜蜂微孢子虫病的主要病原体,对其侵染机制的相关研究鲜有报道。本研究旨在对团队前期通过质谱鉴定获得的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148进行原核表达,明确其亚细胞定位,并初步探索其生物学功能。【方法】通过在线软件对前期鉴定的东方蜜蜂微孢子虫候选孢壁蛋白NcER_100148序列进行生物信息学分析;利用RT-PCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染后西方蜜蜂Apis mellifera成蜂中肠中NcER_100148的表达量;将NcER_100148基因片段克隆至原核表达载体pET30a中,IPTG诱导表达重组蛋白并用于制备多克隆抗体;利用Western blot检测NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的表达量;通过间接免疫荧光和免疫电镜技术分析NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫成熟孢子中的亚细胞定位;利用Western blot和免疫共沉淀法分别分析重组蛋白NcER_100148与东方蜜蜂微孢子虫几丁质孢子壳(chitin spore coats,CSCs)和极管蛋白NcPTP2和NcPTP3的相互作用关系。【结果】序列分析结果表明,东方蜜蜂微孢子虫NcER_100148预测分子量为12.169 kD,含1个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和1个糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定位点;RT-PCR检测结果表明,NcER_100148在东方蜜蜂微孢子虫感染后4 d时的西方蜜蜂成蜂中肠中开始表达;Western blot结果表明,NcER_100148蛋白能在成熟孢子表面表达,并且能够与东方蜜蜂微孢子虫的CSCs互作;亚细胞定位结果显示NcER_100148定位于东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上;Western blot和免疫共沉淀结果显示重组蛋白NcER_100148能够与极管蛋白NcPTP2和NcPTP3相互作用。【结论】NcER_100148是定位在东方蜜蜂微孢子虫的成熟孢子孢壁上的一个新型孢壁蛋白,且其可能在孢子内壁的构建、极管的盘绕与固定和参与对宿主的侵染等过程中扮演重要的角色。 展开更多

关键词 东方蜜蜂微孢子虫 孢壁蛋白 亚细胞定位 几丁质孢子壳 极管蛋白 互作

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家蚕微孢子虫SWP25基因BmN细胞表达质粒的构建及表达

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作者 肖圣燕 李镇刚 +3 位作者 冉瑞法 黄平 朱峰 沈中元 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第5期1023-1028,共6页

本研究旨在构建含家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25的家蚕卵巢细胞(BmN)表达质粒,检测该基因在宿主细胞中的表达,为在细胞水平筛选与家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25相互作用的宿主蛋白奠定基础。利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统,将... 本研究旨在构建含家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25的家蚕卵巢细胞(BmN)表达质粒,检测该基因在宿主细胞中的表达,为在细胞水平筛选与家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25相互作用的宿主蛋白奠定基础。利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统,将家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25和报告基因EGFP克隆到杆状病毒转移载体pFast Bac1中,转化BmDH10Bac感受态细胞并筛选阳性重组质粒用于转染BmN细胞。经PCR技术鉴定,成功获得重组杆状病毒质粒v BmEGFP-SWP25。在转染成功的细胞中可观测到绿色荧光信号。使用Western blot方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞中检测到大小约55 000的重组蛋白条带,与理论值一致,表明家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25在BmN中成功表达。 展开更多

关键词 家蚕微孢子虫 孢壁蛋白SWP25基因 Bac-to-Bac表达系统 重组质粒 转染 融合蛋白表达

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虾肝肠胞虫4个孢壁蛋白基因的鉴定、序列特征及表达分析

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作者 李枝敏 王元 +2 位作者 房文红 周俊芳 李新苍 《海洋渔业》 CSCD 北大核心 2021年第1期81-92,共12页

对上海某养殖场凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)开展了虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)检测,发现部分对虾存在EHP感染。随后对EHP感染阳性对虾肝胰腺组织进行转录组测序和数据分析,从中筛选到4个孢壁蛋白基因,分别命名为... 对上海某养殖场凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)开展了虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)检测,发现部分对虾存在EHP感染。随后对EHP感染阳性对虾肝胰腺组织进行转录组测序和数据分析,从中筛选到4个孢壁蛋白基因,分别命名为EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26。获取并比较4个基因cDNA序列和基因组序列,发现这4个基因均不含内含子;进一步比较氨基酸序列,发现这4个基因编码的氨基酸序列相似性很低,但它们分别与泰国当地EHP相应的4个假设孢壁蛋白氨基酸序列一致,提示上海本地EHP与泰国当地EHP很可能属于同一个种。qRT-PCR实验结果显示,这4个孢壁蛋白基因均在肝胰腺中表达量最高,并且EhSWP12表达量显著高于其他3个基因(P<0.05)。研究结果表明,EHP主要感染肝胰腺,EhSWP12是EHP孢壁蛋白中的主要结构蛋白组分。鉴定了EHP的4个孢壁蛋白基因,并明确其序列特征及表达情况,研究结果可为EHP生物学特性和侵染机制研究提供基础数据。 展开更多

关键词 凡纳滨对虾 EHP 孢壁蛋白基因 序列特征 表达分析

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基于孢子壁蛋白基因靶点的虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR体系的构建及应用 被引量：5

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作者 汪浩 汪玮 +4 位作者 施慧 何杰 谢建军 王庚申 许文军 《浙江海洋大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2020年第6期477-483,共7页

基于GenBank中公布的虾肝肠胞虫(EHP)孢子壁蛋白(spore wall protein,SWP)基因序列设计一对特异性引物,构建并优化了基于EHP-SWP靶点的SYBR实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。试验结果显示,该引物在退火温度为60℃时具有最佳的扩增效果,... 基于GenBank中公布的虾肝肠胞虫(EHP)孢子壁蛋白(spore wall protein,SWP)基因序列设计一对特异性引物,构建并优化了基于EHP-SWP靶点的SYBR实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。试验结果显示,该引物在退火温度为60℃时具有最佳的扩增效果,扩增效率达98.8%,扩增产物的溶解曲线为1个单峰。本研究构建的qPCR体系对5.02×10^(1)~5.02×10^(8)copies·μL^(-1)的EHP-SWP DNA片段的检测响应有良好线性关系,扩增产物的阈值循环数(Ct)与模板起始拷贝数对数值[log(Copies)]的关系为:Ct=-0.2844 log(Copies)+10.45,(R^(2)=0.992),检测灵敏度达5.02×10^(1)copies·μL^(-1)。引物特异性检测结果显示,本研究设计的检测引物仅能特异的扩增EHP模板,而对其他多种虾病原如传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、虾虹彩病毒(SHIV)、副溶血弧菌、哈维氏弧菌的扩增结果均为阴性,表明引物无交叉反应,具有良好特异性。重复性实验表明,该方法检测结果变异系数小于2%,可重复性高。应用本研究构建的检测体系对浙江海洋大学西闪岛试验基地虾塘中出现生长缓慢症状的51尾虾的EHP携带量进行检测,结果显示,EHP的感染指数与体长呈现负相关,并且,随着体长的增大,负相关性逐渐减弱。本研究为EHP的定量检测提供了一种新的具有高特异性和灵敏度的方法。 展开更多

关键词 虾肝肠胞虫(EHP) 孢子壁蛋白(SWP) 实时荧光定量PCR

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虾肝肠胞虫孢壁蛋白SWP7的多克隆抗体制备和定位分析

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作者 包杰 宁梓健 +1 位作者 丰程程 姜宏波 《中国渔业质量与标准》 2022年第6期1-8,共8页

孢壁作为微孢子虫最外层的结构,是连接微孢子虫与外界环境的桥梁。因此,研究孢壁蛋白对阐明宿主-微孢子虫相互作用的机制具有重要意义。本研究以虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)孢壁蛋白7(spore wall protein 7,SWP7)为研... 孢壁作为微孢子虫最外层的结构,是连接微孢子虫与外界环境的桥梁。因此,研究孢壁蛋白对阐明宿主-微孢子虫相互作用的机制具有重要意义。本研究以虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)孢壁蛋白7(spore wall protein 7,SWP7)为研究对象,首先通过生物信息学分析其序列基本特征,然后合成该基因序列、构建原核表达载体、诱导蛋白表达并纯化,最后制备多克隆抗体。通过Western blotting验证该抗体的特异性后,利用间接免疫荧光技术观察和分析该蛋白在成熟孢子上的定位情况。结果表明,SWP7的N末端存在信号肽序列,且无跨膜域和GPI锚定位点,可能作为分泌蛋白发挥功能。同时,预测到SWP7有多个磷酸化修饰位点,可能参与肝肠胞虫信号转导、免疫应答、受体激活等功能。间接免疫荧光结果显示SWP7均匀地表达于成熟EHP孢壁上,且可能参与到萌发过程中。研究结果可为明确SWP7在肝肠胞虫入侵宿主中的功能及其机制提供理论基础。 展开更多

关键词 虾肝肠胞虫 孢壁蛋白 多克隆抗体 间接免疫荧光

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