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Split-GFP双分子荧光互补技术在鸡MSTN基因RNAi检测中的应用
1
作者
杨磊
朱正
+4 位作者
王博永
梁谦学
吴文德
李恭贺
郑喜邦
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第8期2444-2453,共10页
【目的】以Split-GFP双荧光互补技术检测鸡肌肉生长抑制素基因(MSTN)RNA干涉(RNAi)效果,并与其他常用检测方法比较,以验证Split-GFP双分子荧光互补技术在RNAi效果评估中的有效性和可行性。【方法】将合成的3个shRNA慢病毒载体(shRNA-a、...
【目的】以Split-GFP双荧光互补技术检测鸡肌肉生长抑制素基因(MSTN)RNA干涉(RNAi)效果,并与其他常用检测方法比较,以验证Split-GFP双分子荧光互补技术在RNAi效果评估中的有效性和可行性。【方法】将合成的3个shRNA慢病毒载体(shRNA-a、shRNA-b和shRNA-c)分别转染稳定表达GFP11-MSTN融合蛋白的HEK 293TGFP11-MSTN细胞,经实时荧光定量PCR筛选出最佳shRNA慢病毒载体并包装为慢病毒,然后以慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞,采用潮霉素B筛选mCherry阳性(mCherry+)细胞,再以实时荧光定量PCR和Western blotting检测RNAi效果;得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,通过荧光显微镜观察和流式细胞术评估RNAi效果。【结果】3个shRNA慢病毒载体对MSTN基因表达均有极显著的抑制作用(P<0.01,下同),其中又以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒载体的干涉效果最佳。Anti-MSTN shRNA-a慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞的最适MOI=3,该条件下MSTN基因相对表达量及GFP11-MSTN融合蛋白表达量均受到抑制;得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,荧光显微镜观察和流式细胞术检测结果表明,GFP+细胞数量明显减少,GFP+细胞百分率由31.1%降至11.5%。Split-GFP检测结果与实时荧光定量PCR及Western blotting检测结果相符,说明Anti-MSTN shRNA-a慢病毒能有效抑制GFP11-MSTN融合蛋白表达,发挥了RNAi作用。【结论】以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒对MSTN基因的干涉效果最佳,其感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞后MSTN基因表达极显著下调,且再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒后细胞中的GFP+细胞百分率明显下降,与实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果相符,证实Slipt-GFP双分子荧光互补技术是一种可靠的可视化RNAi检测方法。
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关键词
肌肉生长抑制素(MSTN)
RNA干涉(RNAi)
shRNA
慢病毒
Split-GFP双分子荧光互补技术
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职称材料
题名
Split-GFP双分子荧光互补技术在鸡MSTN基因RNAi检测中的应用
1
作者
杨磊
朱正
王博永
梁谦学
吴文德
李恭贺
郑喜邦
机构
广西大学动物科学技术学院
出处
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第8期2444-2453,共10页
基金
国家自然科学基金项目(32060738,31660653)
广西自然科学基金重点项目(2018GXNSFDA281026)
广西重点研发计划项目(桂科AB16380098)。
文摘
【目的】以Split-GFP双荧光互补技术检测鸡肌肉生长抑制素基因(MSTN)RNA干涉(RNAi)效果,并与其他常用检测方法比较,以验证Split-GFP双分子荧光互补技术在RNAi效果评估中的有效性和可行性。【方法】将合成的3个shRNA慢病毒载体(shRNA-a、shRNA-b和shRNA-c)分别转染稳定表达GFP11-MSTN融合蛋白的HEK 293TGFP11-MSTN细胞,经实时荧光定量PCR筛选出最佳shRNA慢病毒载体并包装为慢病毒,然后以慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞,采用潮霉素B筛选mCherry阳性(mCherry+)细胞,再以实时荧光定量PCR和Western blotting检测RNAi效果;得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,通过荧光显微镜观察和流式细胞术评估RNAi效果。【结果】3个shRNA慢病毒载体对MSTN基因表达均有极显著的抑制作用(P<0.01,下同),其中又以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒载体的干涉效果最佳。Anti-MSTN shRNA-a慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞的最适MOI=3,该条件下MSTN基因相对表达量及GFP11-MSTN融合蛋白表达量均受到抑制;得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,荧光显微镜观察和流式细胞术检测结果表明,GFP+细胞数量明显减少,GFP+细胞百分率由31.1%降至11.5%。Split-GFP检测结果与实时荧光定量PCR及Western blotting检测结果相符,说明Anti-MSTN shRNA-a慢病毒能有效抑制GFP11-MSTN融合蛋白表达,发挥了RNAi作用。【结论】以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒对MSTN基因的干涉效果最佳,其感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞后MSTN基因表达极显著下调,且再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒后细胞中的GFP+细胞百分率明显下降,与实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果相符,证实Slipt-GFP双分子荧光互补技术是一种可靠的可视化RNAi检测方法。
关键词
肌肉生长抑制素(MSTN)
RNA干涉(RNAi)
shRNA
慢病毒
Split-GFP双分子荧光互补技术
Keywords
myostatin(MSTN)
RNA interference(RNAi)
shRNA
lentivirus
split-gfpbimolecular fluorescence complementary technique
分类号
S814.8 [农业科学—畜牧学]
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作者
出处
发文年
被引量
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1
Split-GFP双分子荧光互补技术在鸡MSTN基因RNAi检测中的应用
杨磊
朱正
王博永
梁谦学
吴文德
李恭贺
郑喜邦
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023
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