期刊文献+
任意字段
题名或关键词
题名
关键词
文摘
作者
第一作者
机构
刊名
分类号
参考文献
作者简介
基金资助
栏目信息
共找到76篇文章
< 1 2 … 4 >
每页显示 20 50 100
已选择0条
导出题录 引用分析
参考文献
引证文献
 统计分析
检索结果
已选文献
显示方式：
利用改良SOE-PCR技术定点突变TuMVC4-VPg基因 被引量：3
1
作者 李国亮 钱伟 +7 位作者 张淑江 李菲 章时蕃 张慧 谢露露 武剑 王晓武 孙日飞 《中国蔬菜》 北大核心 2017年第10期39-44,共6页
芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是白菜类蔬菜生产上的重要病害,其中Tu MV VPg基因在Tu MV侵染白菜类蔬菜的过程中起着至关重要的作用,且不同Tu MV株系的致病性不同。本试验采用改良的重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术,以Tu MV C4-VP... 芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是白菜类蔬菜生产上的重要病害,其中Tu MV VPg基因在Tu MV侵染白菜类蔬菜的过程中起着至关重要的作用,且不同Tu MV株系的致病性不同。本试验采用改良的重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术,以Tu MV C4-VPg基因序列为模板,定点突变Tu MV C4-VPg与Tu MV CDN1-VPg基因间5个差异核苷酸位点(决定5个氨基酸差异)。结果表明:通过SOE-PCR技术获得了5个Tu MV C4-VPg基因的单点突变体,即Tu MV C4-VPg-Ⅰ、Tu MV C4-VPg-Ⅱ、Tu MV C4-VPg-Ⅲ、Tu MV C4-VPg-Ⅳ和Tu MV C4-VPg-Ⅴ。 展开更多
关键词 白菜类蔬菜 芜菁花叶病毒 VPg基因 重叠延伸pcr技术 单点突变
在线阅读 下载PDF
利用交错延伸剪接PCR技术扩增油菜花粉育性基因MS2 Bnap全长cDNA序列 被引量：3
2
作者 李德谋 罗小英 +3 位作者 侯磊 裴炎 方卫国 杨光伟 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期553-555,共3页
交错延伸剪接PCR是一种用于分子进化研究的DNA改组技术。本实验利用其原理 ,将已获得的油菜花粉育性基因MS2Bnap有部分序列重叠的三段PCR产物作为模板进行扩增 ,获得了花粉育性基因MS2Bnap的全长cD NA序列。
关键词 交错延伸剪接pcr 花粉育性基因MS2Bnap 全长CDNA序列 油菜 植物
在线阅读 下载PDF
降落-重叠PCR法四重融合构建平菇同源重组片段 被引量：10
3
作者 柴冉 孙强 邱立友 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期375-379,共5页
对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法.本文提出一种新的融合PCR策略,即在常规的重叠PCR的第1步和第2步均增加1个降落PCR程序,减少不适当的退火温度和PCR产物3'端额外碱基A对片段融合、扩增的影响,提高正确融合与扩增的效率... 对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法.本文提出一种新的融合PCR策略,即在常规的重叠PCR的第1步和第2步均增加1个降落PCR程序,减少不适当的退火温度和PCR产物3'端额外碱基A对片段融合、扩增的影响,提高正确融合与扩增的效率.结果表明,为构建平菇葡聚糖合成酶启动子的同源重组序列,在4个长度分别是1 015 bp、2 822 bp、2 206 bp和1 008 bp的片段进行融合时,在重叠PCR的第1步加上退火温度61.5℃～57.5℃、每降落0.5℃进行1个循环的降落PCR程序,在重叠PCR的第2步加上退火温度60℃～56℃、每降落0.5℃进行1个循环的降落PCR程序,经过1次PCR即获得顺序正确的全长融合片段.测序结果与4个片段序列的一致性达到98.5%,降落-重叠PCR法对多个长片段的基因融合具有较高的应用价值. 展开更多
关键词 基因融合 重叠pcr 降落pcr 同源重组
在线阅读 下载PDF
重叠延伸PCR克隆拟南芥ACCase基因和植物表达载体构建 被引量：5
4
作者 胡亚平 夏玉平 +4 位作者 吴刚 武玉花 肖玲 李均 卢长明 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期407-412,420,共7页
植物的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7 000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规PCR将... 植物的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7 000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规PCR将其cDNA分成八个重叠的片段分别扩增出来,再用重叠延伸PCR将得到的片段逐步拼接成长度为6 890bp的完整的基因序列,测序证实克隆序列正确无误,最后将其克隆到农杆菌转化植物的载体上。序列分析发现ACCase基因的开放阅读框长度为6 765bp,编码一个含2 254个氨基酸残基的多肽链,推测其分子量约为250kDa。ACCase基因的成功克隆为利用该基因调控油料作物的含油量奠定了良好基础,同时为克隆长度较大的基因提供了一种经济可行的方法。 展开更多
关键词 重叠延伸pcr 乙酰辅酶A羧化酶 基因克隆
在线阅读 下载PDF
兔出血症病毒2型的VP60基因保守区人工合成及RT-PCR检测方法初探 被引量：3
5
作者 杨泽晓 赵希仑 +6 位作者 李岩 王波 姚学萍 王印 耿毅 蒙正群 白瑜 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第10期1650-1656,共7页
为建立用于兔出血症病毒2型(RHDV2)的快速检测方法,根据Gen Bank已公布的RHDV和RHDV2VP60基因,设计合成2对特异性引物和10条末端重叠引物,通过重叠PCR人工合成RHDV2 VP60基因中保守区片段,构建重组质粒,并以其为模板,经过反应条件优化... 为建立用于兔出血症病毒2型(RHDV2)的快速检测方法,根据Gen Bank已公布的RHDV和RHDV2VP60基因,设计合成2对特异性引物和10条末端重叠引物,通过重叠PCR人工合成RHDV2 VP60基因中保守区片段,构建重组质粒,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和35份样品检测应用,初步建立RHDV2 RT-PCR检测方法。实验成功合成RHDV2 VP60基因的435 bp保守片段并构建了p MD-19T-RHDV2重组质粒,初步建立的RHDV2 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,RHDV2的检测限度可达到230个拷贝的靶基因片段,检测RHDV、p GM-T-EBHSV(已构建)、兔巴氏杆菌、兔源大肠埃希菌和沙门氏菌均无特异性扩增,样品检测结果显示样品中RHDV2核酸阴性。该研究为中国及时进行RHDV2的防控提供技术储备。 展开更多
关键词 兔病毒性出血症 RHDV2 RT-pcr 重叠pcr
在线阅读 下载PDF
PCR重叠延伸法结合分段克隆技术构建高GC含量基因突变载体 被引量：3
6
作者 赵炜 崔红晶 +5 位作者 方炳雄 袁源 刘玢 刘宝华 周中军 刘新光 《海南医学院学报》 CAS 2012年第10期1349-1352,1356,共5页
目的:构建人类KAP-1基因定点突变载体,为研究该基因的功能奠定基础。方法:综合运用PCR重叠延伸法和分段定向克隆技术。结果:DNA测序结果表明定点突变载体构建成功。结论:成功构建高GC含量(局部高达80.50%),全长为2 500bp的人类KAP-1基... 目的:构建人类KAP-1基因定点突变载体,为研究该基因的功能奠定基础。方法:综合运用PCR重叠延伸法和分段定向克隆技术。结果:DNA测序结果表明定点突变载体构建成功。结论:成功构建高GC含量(局部高达80.50%),全长为2 500bp的人类KAP-1基因定点突变载体pCMV6-En-try-KAP-1,为全面深入研究KAP-1基因的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 pcr 高GC含量 重叠延伸 分段克隆
在线阅读 下载PDF
重叠延伸PCR法构建小菜蛾化学感受蛋白1基因突变体研究 被引量：3
7
作者 任珍珍 刘晶晶 +3 位作者 柳晓磊 陈永 李珣 胡美英 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2011年第1期119-125,共7页
【目的】探索重叠延伸PCR法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用,研究半胱氨酸(Cys32)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟PlxyCSP1上Cys32突变前后的蛋白三级结构以及与... 【目的】探索重叠延伸PCR法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用,研究半胱氨酸(Cys32)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟PlxyCSP1上Cys32突变前后的蛋白三级结构以及与配体化合物的结合情况,确定点突变位点。根据扩增得到的PlxyCSP1序列设计并合成重叠引物,利用重叠延伸PCR法,将PlxyCSP1上的Cys32突变成色氨酸(Trp32),获得突变体PlxyCSP1-M。将突变后的基因与载体pET-32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】分子对接图显示,配体可以顺利进入PlxyCSP1的结合口袋,而无法进入PlxyCSP1-M的结合口袋。结合能预测显示,配体化合物与PlxyCSP1的结合能均为正值,与PlxyCSP1-M的结合能均为0。突变后的重组质粒测序结果表明,Cys32(TGC)已突变为Trp32(TGG),经IPTG诱导,该菌表达了分子质量约为36 ku的融合蛋白。【结论】Cys32是影响PlxyCSP1结构和功能的重要氨基酸残基。Cys32突变为Trp32后,PlxyCSP1-M结合特性发生了变化,不能与配体化合物正常结合。 展开更多
关键词 小菜蛾 化学感受蛋白1 重叠延伸pcr 原核表达 同源建模 分子对接
在线阅读 下载PDF
TAT PTD-Tachyplesin融合基因的重叠延伸PCR法合成 被引量：6
8
作者 邱道寿 刘晓津 +1 位作者 王军 苏永全 《安徽农业科学》 CAS 2013年第4期1438-1441,共4页
为探讨HIV-Tat蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)对中国鲎抗菌肽tachyplesin的协同作用,试验以经毕赤酵母密码子优化后的tachyplesin成熟肽(54 aa)加TAT PTD(11 aa)的cDNA序列为参考模板,设计了6条单链寡核苷酸片段,首尾引物... 为探讨HIV-Tat蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)对中国鲎抗菌肽tachyplesin的协同作用,试验以经毕赤酵母密码子优化后的tachyplesin成熟肽(54 aa)加TAT PTD(11 aa)的cDNA序列为参考模板,设计了6条单链寡核苷酸片段,首尾引物的5'端分别引入EcoR I和Xba I酶切位点,通过重叠延伸PCR方法成功合成了TAT PTD+Tachyplesin序列,序列全长219 bp,为其后续功能与协同作用研究奠定了基础。 展开更多
关键词 PTD TAT 鲎素 重叠延伸pcr
在线阅读 下载PDF
重叠延伸PCR法体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ 被引量：2
9
作者 李新生 闫若潜 +5 位作者 高风山 方勤美 郝惠芳 李云岗 陈红英 夏春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期1047-1052,共6页
本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(MHCⅠ)重链(α链)胞外区与轻链(β2m)成熟肽的重组嵌合分子。采用RT-PCR法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列;采用重叠延伸PCR(Splicing overlap extension PCR method,... 本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(MHCⅠ)重链(α链)胞外区与轻链(β2m)成熟肽的重组嵌合分子。采用RT-PCR法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列;采用重叠延伸PCR(Splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR)把通过45个碱基的链连接的鸡MHCⅠ重链胞外区基因和轻链成熟肽基因重组到可溶性表达质粒pMAL-p2X进行可溶性表达。经琼脂糖凝胶电泳证明RT-PCR可分别扩增出鸡MHCⅠα链胞外区基因和β2m成熟肽基因,大小符合预期。采用MHCⅠα链胞外区序列的反义引物与β2m成熟肽基因正义引物有15个碱基重叠的两对引物,以MHCⅠα链胞外区序列与β2m成熟肽序列PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸获得了预期大小的连接片段;测序显示重组质粒上MHCⅠα链胞外区序列与轻链β2m成熟肽基因的靶序列由一柔性的linker相连,阅读框正确且无移码。本研究表明SOE-PCR是体外重构鸡MHCⅠ的一种简捷可行方法。 展开更多
关键词 鸡 主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ) 重链 轻链 重叠延伸pcr
在线阅读 下载PDF
利用重叠延伸PCR定点突变衰退病P23基因 被引量：2
10
作者 阳佳位 王淼 +2 位作者 程春振 魏召新 陈凤娟 《西南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期43-47,共5页
分析已知柑桔衰退病强毒系基因组并克隆CTV中一个重要的基因P23.利用重叠延伸PCR法的原理,成功的将P23基因保守序列第206位碱基由C突变成T,由此该位点成为限制性酶(SacI)的识别位点.把改良后的P23基因插入到T载体中,测序发现成功地突变... 分析已知柑桔衰退病强毒系基因组并克隆CTV中一个重要的基因P23.利用重叠延伸PCR法的原理,成功的将P23基因保守序列第206位碱基由C突变成T,由此该位点成为限制性酶(SacI)的识别位点.把改良后的P23基因插入到T载体中,测序发现成功地突变掉目的位点.为进一步利用分子生物学手段研究CTV病毒,克隆突变CTV序列奠定了基础. 展开更多
关键词 定点突变 重叠延伸pcr 柑桔 CTV病毒
在线阅读 下载PDF
利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究 被引量：12
11
作者 雒丽娜 王盛 王玉炯 《安徽农业科学》 CAS 2012年第10期5779-5781,共3页
[目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[... [目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[结果]测序结果表明3个位点的突变结果与预期完全一致,即第10位引入单个碱基A、第137位碱基C突变为G以及第686位碱基G突变为A,通过重叠延伸PCR技术一次引入3个突变碱基,100%的实现目的位点的定点突变。[结论]该研究成功实现目的位点的定点突变,为rPA基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。 展开更多
关键词 重叠延伸pcr技术 定点突变 rPA基因
在线阅读 下载PDF
重叠延伸PCR技术构建β-环糊精葡糖基转移酶基因的定点突变原核表达载体 被引量：2
12
作者 王华 文一 +4 位作者 于寒松 朴春红 王玉华 刘俊梅 胡耀辉 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2013年第19期145-147,151,共4页
采用重叠延伸PCR技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经PCR鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21(DE3)中含有插入的突变基因重组质粒... 采用重叠延伸PCR技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经PCR鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21(DE3)中含有插入的突变基因重组质粒,结果表明成功构建了Y127F、R254F二个突变基因的重组表达载体。 展开更多
关键词 β-环糊精葡糖糖基转移酶 重叠延伸pcr 定点突变 原核表达载体 构建
在线阅读 下载PDF
降落和重叠延伸PCR构建靶向肿瘤干细胞腺病毒载体及感染实验 被引量：1
13
作者 张超 刘国炳 +2 位作者 田平阁 周春平 李学农 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1513-1517,共5页
目的应用降落和重叠延伸PCR法构建对肿瘤干细胞有特异靶向性的高效载体-复制缺陷型腺病毒载体,观察其对CD133+人大肠癌细胞株SW480的感染效率。方法利用重叠延伸PCR技术扩增5型腺病毒纤毛球端HI环两端的基因序列,定向插入真核表达质粒pE... 目的应用降落和重叠延伸PCR法构建对肿瘤干细胞有特异靶向性的高效载体-复制缺陷型腺病毒载体,观察其对CD133+人大肠癌细胞株SW480的感染效率。方法利用重叠延伸PCR技术扩增5型腺病毒纤毛球端HI环两端的基因序列,定向插入真核表达质粒pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1.KNOB△HI,同时在缺失HI环部位引入EcoRV限制性酶切位点。在此基础上,用降落PCR克隆纤毛基因全长编码区序列,构建出腺病毒穿梭质粒pNEB-F5。利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性。再与pAdEasy-1,pShuttle-GFP在E.coli BJ5183中同源重组,得腺病毒载体Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP。用Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP分别感染CD133+人大肠癌细胞株SW480,通过荧光显微镜观察感染效率。结果降落PCR和重叠延伸PCR都扩增出特异性条带,测序结果与预期相符。与Ad5-GFP相比,Ad5FHI-GFP对CD133+人大肠癌细胞株SW480有显著提高。结论利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,其对CD133+人大肠癌细胞株SW480实验显示Ad5FHI-GFP组感染效率明显强于Ad5-GFP组。 展开更多
关键词 降落pcr 重叠延伸pcr 肿瘤干细胞 复制缺陷型腺病毒 穿梭质粒
在线阅读 下载PDF
米黑根毛霉脂肪酶基因密码子优化及重叠延伸PCR合成 被引量：1
14
作者 苗长林 罗文 +3 位作者 吕鹏梅 李惠文 杨玲梅 袁振宏 《安徽农业科学》 CAS 2013年第1期47-48,112,共3页
[目的]对米黑根毛霉脂肪酶基因的密码子进行优化,并采用重叠延伸PCR合成设计的基因序列。[方法]根据毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子使用偏好性,对米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因进行全面密码子优化,根据优化后的氨基酸编码序列设计合成30... [目的]对米黑根毛霉脂肪酶基因的密码子进行优化,并采用重叠延伸PCR合成设计的基因序列。[方法]根据毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子使用偏好性,对米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因进行全面密码子优化,根据优化后的氨基酸编码序列设计合成30条长度约为48 bp的寡核苷酸片段,并采用重叠延伸PCR法扩增合成全长基因序列。[结果]经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析表明,合成的目的基因与设计的序列相一致。[结论]该研究为脂肪酶基因在毕赤酵母中的构建及后续表达奠定了基础。 展开更多
关键词 米黑根毛霉脂肪酶 密码子优化 重叠延伸pcr 克隆
在线阅读 下载PDF
重叠延伸PCR法扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因及生物信息学分析
15
作者 张毅 周淑艳 +2 位作者 陈锐 孙业红 李体远 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期173-178,共6页
利用重叠延伸PCR技术扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并进行了蛋白的诱导表达。通过序列测定和ORF软件分析,该融合基因含有1个1 005 bp的ORF,编码335个氨基酸。应用生物信息学方法,对该融合基... 利用重叠延伸PCR技术扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并进行了蛋白的诱导表达。通过序列测定和ORF软件分析,该融合基因含有1个1 005 bp的ORF,编码335个氨基酸。应用生物信息学方法,对该融合基因编码的蛋白ZtaN-p23从氨基酸组成、理化性质、信号肽、疏水性/亲水性、二级结构、亚细胞定位、功能域和高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明,该蛋白的预测分子量为46.2 kD,理论等电点约为8.97,是亲水性蛋白,推测它定位于细胞质中。序列分析表明,该蛋白可能具有信号转导、转录调控、免疫应答等功能。预测的二级结构及三级结构都表明该蛋白含有较多的不规则卷曲和α-螺旋,三级结构上呈对称形状。 展开更多
关键词 重叠延伸 pcr EB病毒 BZLF1N基因 BLRF2基因 生物信息学
在线阅读 下载PDF
OE-PCR快速合成基因的探索研究
16
作者 董冰雪 韩雪梅 +4 位作者 薜淑萍 耿三春 刘伟 李运会 詹慧莹 《湖北农业科学》 北大核心 2013年第12期2929-2933,共5页
根据GenBank中基因序列,利用DNAworks3.1软件,选择合适的参数优化设计引物。通过一步简单的重叠延伸PCR(OE-PCR),然后使用最外端的引物进行PCR扩增得到完整的基因序列。结果表明,利用该方法不但成功地合成了几个具有毕赤酵母密码子偏好... 根据GenBank中基因序列,利用DNAworks3.1软件,选择合适的参数优化设计引物。通过一步简单的重叠延伸PCR(OE-PCR),然后使用最外端的引物进行PCR扩增得到完整的基因序列。结果表明,利用该方法不但成功地合成了几个具有毕赤酵母密码子偏好性的基因,而且一次向野生型Cip基因里引入了12个点突变,并可以低成本、低错误率甚至是正确无误地合成1.5 kb以内的任何已知基因。 展开更多
关键词 基因合成 DNAworks3 1软件 重叠延伸pcr(OE-pcr)
在线阅读 下载PDF
一种改进后的重叠延伸PCR法对被孢霉重组载体的构建 被引量：2
17
作者 孟祥亮 王宁新 +3 位作者 牛丽华 李培光 李洋 黄大卫 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期62-67,共6页
为了提高DNA大片段的拼接效率,通过引入逐次退火的PCR的方法,改良了传统的重叠延伸PCR方法。逐次退火PCR法,一方面延长了重叠区的PCR引物长度;另一方面把原来在1个循环中1个退火温度改成若干个,逐次降低退火温度,适用于Tm值相差比较大... 为了提高DNA大片段的拼接效率,通过引入逐次退火的PCR的方法,改良了传统的重叠延伸PCR方法。逐次退火PCR法,一方面延长了重叠区的PCR引物长度;另一方面把原来在1个循环中1个退火温度改成若干个,逐次降低退火温度,适用于Tm值相差比较大的引物;相邻的退火温度之间相差3-6℃。结果显示,通过此种方法成功拼接了ω3(2)和HCT两个大片段;PCR产物电泳条带单一,克隆测序证实序列完全正确,可以直接应用于后续试验。这种改进后的方法可以有效减少非特异性扩增,提高灵敏度,把这种方法称之为逐次退火重叠延伸PCR。 展开更多
关键词 逐次退火 重叠区域pcr 突变 拼接
在线阅读 下载PDF
改进重叠延伸PCR克隆tau基因6种同工异构体 被引量：3
18
作者 李诺敏 刘可夫 +5 位作者 李灵芸 何放 顾文彬 董一名 邓玉林 庆宏 《北京理工大学学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第8期871-875,共5页
采用一种改进的重叠延伸PCR技术,通过2次PCR的方法,对人tau基因进行剪切和拼接,实现了tau基因的6种同工异构体的克隆;然后将6种tau基因克隆到真核载体pcDNA4上,通过western blot在蛋白水平验证了tau蛋白的表达.结果表明,这种改进重叠延... 采用一种改进的重叠延伸PCR技术,通过2次PCR的方法,对人tau基因进行剪切和拼接,实现了tau基因的6种同工异构体的克隆;然后将6种tau基因克隆到真核载体pcDNA4上,通过western blot在蛋白水平验证了tau蛋白的表达.结果表明,这种改进重叠延伸PCR方法能够对基因进行多个位置的剪切和连接,由于该法在基因重组过程中无需利用限制性内切酶,因此具有很大的灵活性和简便性. 展开更多
关键词 TAU蛋白 重叠延伸pcr 真核表达载体 TA克隆
在线阅读 下载PDF
通过重叠PCR构建2个增强型植物花特异双向启动子 被引量：2
19
作者 张雄飞 刘雅莉 +2 位作者 娄倩 祁银燕 杜灵娟 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期34-41,共8页
基于植物基因工程要求精确调控的目标,为转基因提供更多可供选择的启动子,使用重叠延伸PCR的方法设计并人工构建了2个增强型植物花特异双向启动子pPCHS-35Senhancer-pLCHS和pPCHS-OCS enhancer-pLCHS。实验中,用本实验室保存的矮牵牛花... 基于植物基因工程要求精确调控的目标,为转基因提供更多可供选择的启动子,使用重叠延伸PCR的方法设计并人工构建了2个增强型植物花特异双向启动子pPCHS-35Senhancer-pLCHS和pPCHS-OCS enhancer-pLCHS。实验中,用本实验室保存的矮牵牛花特异启动子核心序列pPCHS、百合花特异启动子核心序列pLCHS、CaMV 35S增强子序列(35Senhancer)、OCS增强子序列(OCS enhancer)为模板,根据重叠延伸PCR原理,设计并合成了10条引物,进行两轮PCR,产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,成功拼接出了与设计的双向启动子大小一致的2段序列。使用DAN回收试剂盒回收两段序列,克隆到pGEM-T Easy载体中并导入大肠埃希菌TOP10进行扩繁和保存,扩繁菌液进行测序分析,测序证实得到的两段序列与设计的双向启动子序列完全一致,成功获得2个增强型植物花特异双向启动子。本研究的结果能为今后利用多基因共转化的方法精确调控矮牵牛、百合等重要花卉的观赏性状提供有用的启动子。 展开更多
关键词 启动子 增强子 重叠延伸pcr
在线阅读 下载PDF
重叠延伸PCR法构建人肿瘤坏死因子前体水解酶系列突变重组体及稳定转染HeLa细胞株的建立
20
作者 闫媛 章杰 +2 位作者 杨渝珍 过健俐 李禹琼 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期1-4,共4页
目的构建人肿瘤坏死因子前体水解酶(TACE)系列真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染的HeLa细胞系。方法以THP1细胞cDNA为模板,PCR扩增人TACE基因的全长cDNA编码区序列,将其插入pMD18T载体中,构建出pMD18T-FL-TACE载体。在此基础上,... 目的构建人肿瘤坏死因子前体水解酶(TACE)系列真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染的HeLa细胞系。方法以THP1细胞cDNA为模板,PCR扩增人TACE基因的全长cDNA编码区序列,将其插入pMD18T载体中,构建出pMD18T-FL-TACE载体。在此基础上,应用重叠延伸PCR扩增出缺失解整合素区的TACE重组cDNA和缺失酶区的TACE重组cDNA,利用DNA重组技术将其分别定向插入真核表达载体pIRES2.0-EGFP中,同时TACE全长也构建入pIRES20.-EGFP。这3种真核表达载体经酶切和测序鉴定后,用脂质体法转染HeLa细胞,经过G418筛选,获得稳定转染的HeLa细胞株,采用RT-PCR、Westernblot及荧光法检测表达。结果成功构建了pIRES2.0-EG-FP/FL-TACE、pIRES20.-EGFP/disΔ-TACE、pIRES20.-EGFP/metΔ-TACE真核表达载体,并建立了稳定转染的HeLa细胞株,成功地表达了目的基因。结论真核表达载体的构建和稳定转染HeLa细胞株的建立为进一步研究TACE功能奠定了必要的实验基础。 展开更多
关键词 人肿瘤坏死因子前体水解酶 解整合素 真核表达载体 重叠延伸pcr 转染
在线阅读 下载PDF
已选择0条
导出题录 引用分析
参考文献
引证文献
 统计分析
检索结果
已选文献
上一页 1 2 … 4 下一页 到第 页
关于我们 | 版权声明 | 联系我们 | 帮助中心| 意见反馈
主办单位：上海市教育委员会
技术支持：重庆维普资讯有限公司
渝公网安备 50019002500403号
使用帮助 返回顶部