目的探讨泛素蛋白连接酶E3A(ubiquitin protein ligase E3A,UBE3A)与泛素特异性蛋白酶25(ubiquitin specific protease 25,USP25)在乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性,并分析UBE3A与USP25在乳腺癌泛素蛋白酶体系统中的关系。...目的探讨泛素蛋白连接酶E3A(ubiquitin protein ligase E3A,UBE3A)与泛素特异性蛋白酶25(ubiquitin specific protease 25,USP25)在乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性,并分析UBE3A与USP25在乳腺癌泛素蛋白酶体系统中的关系。方法采用免疫组织化学染色检测50例乳腺癌组织及癌旁相对正常组织石蜡标本中UBE3A与USP25的表达情况,并分析它们与乳腺癌患者临床病理特征的关系;shRNA-UBE3A慢病毒转染乳腺癌MCF-7细胞,通过荧光定量PCR与Western Blot检测UBE3A基因及蛋白的敲减水平,然后观察敲减UBE3A后USP25的表达水平。结果UBE3A与USP25在乳腺癌组织中的阳性表达率分别为64%、72%,而在邻近相对正常组织中的表达均为阴性,两者在乳腺癌组织与相对正常组织中的表达差异具有统计学意义(P<0.001);UBE3A的表达与淋巴结转移(P=0.001)、Ki-67的表达(P<0.001)相关,USP25的表达与组织学分级(P=0.046)、淋巴结转移(P=0.041)、Ki-67的表达(P=0.029)相关;shRNA-UBE3A慢病毒转染乳腺癌MCF-7细胞后,UBE3A蛋白及mRNA的表达均明显降低(P<0.001),且敲减UBE3A后USP25的蛋白及mRNA的表达明显降低(P<0.001)。结论UBE3A与USP25和乳腺癌细胞的增殖、转移等生物学行为相关,在乳腺癌泛素蛋白酶体系统中UBE3A与USP25功能作用明显增强且保持动态平衡,它们可能共同作用促进乳腺癌的的发生发展。展开更多
既往研究发现,SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1)通过其E3泛素连接酶活性介导自噬进程,然而SMURF1的泛素化底物蛋白质仍有待进一步挖掘。本文利用免疫共沉淀(Co-IP)联合蛋白质谱分析捕...既往研究发现,SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1)通过其E3泛素连接酶活性介导自噬进程,然而SMURF1的泛素化底物蛋白质仍有待进一步挖掘。本文利用免疫共沉淀(Co-IP)联合蛋白质谱分析捕获并鉴定THP-1细胞中SMURF1的相互作用蛋白质集合物,发现在THP-1细胞中SMURF1可与222种蛋白质物理性结合,RNA腺苷脱氨酶1(adenosine deaminase acting on RNA 1,ADAR1)具有较高的肽段结合分数。构建SMURF1过表达载体并转染到HEK-293T细胞中,Co-IP和Western印迹检测验证外源性SMURF1与内源性ADAR1存在相互作用。qRT-PCR和Western印迹检测结果显示,在HEK-293T细胞中过表达SMURF1后ADAR 1 mRNA水平差异无统计学意义、蛋白质水平明显降低(P<0.05)。用放线菌酮(CHX)分别处理正常和过表达SMURF1的HEK-293T细胞,Western印迹检测显示,过表达SMURF1后ADAR1的半衰期缩短(P<0.05)。进一步在HEK-293T细胞中共转染泛素(Ub)过表达载体和SMURF1过表达载体,通过Co-IP和Western印迹检测结果证实,过表达SMURF1后ADAR1的多聚泛素化水平显著增加(P<0.05)。在蛋白酶体抑制剂(MG132)作用后,Western印迹检测结果表明,蛋白酶体降解途径受抑制后SMURF1对ADAR1的负调控作用减弱(P<0.05)。本研究表明,SMURF1可以与ADAR1相互作用,催化ADAR1的多聚泛素化修饰并介导其蛋白酶体途径降解,为探索SMURF1通过影响ADAR1蛋白质稳定性而具备的多种生物学功能提供理论基础。展开更多
文摘目的探讨泛素蛋白连接酶E3A(ubiquitin protein ligase E3A,UBE3A)与泛素特异性蛋白酶25(ubiquitin specific protease 25,USP25)在乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性,并分析UBE3A与USP25在乳腺癌泛素蛋白酶体系统中的关系。方法采用免疫组织化学染色检测50例乳腺癌组织及癌旁相对正常组织石蜡标本中UBE3A与USP25的表达情况,并分析它们与乳腺癌患者临床病理特征的关系;shRNA-UBE3A慢病毒转染乳腺癌MCF-7细胞,通过荧光定量PCR与Western Blot检测UBE3A基因及蛋白的敲减水平,然后观察敲减UBE3A后USP25的表达水平。结果UBE3A与USP25在乳腺癌组织中的阳性表达率分别为64%、72%,而在邻近相对正常组织中的表达均为阴性,两者在乳腺癌组织与相对正常组织中的表达差异具有统计学意义(P<0.001);UBE3A的表达与淋巴结转移(P=0.001)、Ki-67的表达(P<0.001)相关,USP25的表达与组织学分级(P=0.046)、淋巴结转移(P=0.041)、Ki-67的表达(P=0.029)相关;shRNA-UBE3A慢病毒转染乳腺癌MCF-7细胞后,UBE3A蛋白及mRNA的表达均明显降低(P<0.001),且敲减UBE3A后USP25的蛋白及mRNA的表达明显降低(P<0.001)。结论UBE3A与USP25和乳腺癌细胞的增殖、转移等生物学行为相关,在乳腺癌泛素蛋白酶体系统中UBE3A与USP25功能作用明显增强且保持动态平衡,它们可能共同作用促进乳腺癌的的发生发展。
文摘既往研究发现,SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1)通过其E3泛素连接酶活性介导自噬进程,然而SMURF1的泛素化底物蛋白质仍有待进一步挖掘。本文利用免疫共沉淀(Co-IP)联合蛋白质谱分析捕获并鉴定THP-1细胞中SMURF1的相互作用蛋白质集合物,发现在THP-1细胞中SMURF1可与222种蛋白质物理性结合,RNA腺苷脱氨酶1(adenosine deaminase acting on RNA 1,ADAR1)具有较高的肽段结合分数。构建SMURF1过表达载体并转染到HEK-293T细胞中,Co-IP和Western印迹检测验证外源性SMURF1与内源性ADAR1存在相互作用。qRT-PCR和Western印迹检测结果显示,在HEK-293T细胞中过表达SMURF1后ADAR 1 mRNA水平差异无统计学意义、蛋白质水平明显降低(P<0.05)。用放线菌酮(CHX)分别处理正常和过表达SMURF1的HEK-293T细胞,Western印迹检测显示,过表达SMURF1后ADAR1的半衰期缩短(P<0.05)。进一步在HEK-293T细胞中共转染泛素(Ub)过表达载体和SMURF1过表达载体,通过Co-IP和Western印迹检测结果证实,过表达SMURF1后ADAR1的多聚泛素化水平显著增加(P<0.05)。在蛋白酶体抑制剂(MG132)作用后,Western印迹检测结果表明,蛋白酶体降解途径受抑制后SMURF1对ADAR1的负调控作用减弱(P<0.05)。本研究表明,SMURF1可以与ADAR1相互作用,催化ADAR1的多聚泛素化修饰并介导其蛋白酶体途径降解,为探索SMURF1通过影响ADAR1蛋白质稳定性而具备的多种生物学功能提供理论基础。
