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基于CRISPR/Cas9基因编辑系统建立WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系
1
作者 王楠 杜伟伟 +7 位作者 王婉洁 王悦 袁茂莎 聂雨欣 孙亚茹 刘志国 吴添文 牟玉莲 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第5期1966-1976,共11页
【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因... 【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)基因与精子活力显著相关的位点g.37536832 C>A突变的猪睾丸(swine testis,ST)细胞系,为在细胞层面上进一步探讨WIP 1基因与公猪精液品质性状之间的关系奠定基础。【方法】利用CRISPOR在线网站在猪WIP 1基因g.37536832 C>A位点附近区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX458-GFP载体;通过T7E1酶切试验检测3条sgRNA活性,选择效率较高的sgRNA。构建Donor载体,并将其与sgRNA载体共同转染至ST细胞,采用流式细胞术将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的阳性细胞进行富集和单克隆细胞筛选,并对筛选出的单克隆细胞进行基因型鉴定。【结果】质粒测序结果表明,成功将3条sgRNA连接至pX458-GFP载体上;T7E1酶切结果显示,转染pX458-GFP-sgRNA1和pX458-GFP-sgRNA2质粒组产生了切割,效率分别为24%和27%,而转染pX458-GFP-sgRNA3质粒组未检测到切割,因此选择pX458-GFP-sgRNA2质粒进行试验。成功构建Donor载体,并将pX458-GFP-sgRNA2和Donor载体共转染至ST细胞。基因型鉴定结果显示,获得的269株单克隆中有205株细胞发生了基因编辑,基因编辑效率为76%,其中9株为WIP 1基因g.37536832 C>A位点纯合突变的ST细胞,精确突变效率为3%。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了WIP 1基因g.37536832 C>A位点突变的ST细胞系,为深入研究WIP 1基因对公猪精液品质的影响提供了良好的细胞模型。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 WIP 1基因 ST细胞系
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DOT1L敲除的鸡胚成纤维细胞系构建及其对ALV-J复制和细胞信号通路的影响
2
作者 余莫涵 王鑫妍 +4 位作者 蔡清清 王佳兴 高琦 常国斌 陈世豪 《中国家禽》 北大核心 2025年第8期1-10,共10页
研究旨在通过CRISPR-Cas9技术构建DOT1L基因敲除的鸡胚成纤维细胞系(DF-1),并分析DOT1L基因敲除对J亚群禽白血病病毒(ALV-J)复制及其细胞信号通路的影响,也为后续进一步研究DOT1L的生物学功能提供生物材料。研究首先利用CRISPR/Cas9基... 研究旨在通过CRISPR-Cas9技术构建DOT1L基因敲除的鸡胚成纤维细胞系(DF-1),并分析DOT1L基因敲除对J亚群禽白血病病毒(ALV-J)复制及其细胞信号通路的影响,也为后续进一步研究DOT1L的生物学功能提供生物材料。研究首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建DOT1L基因敲除的DF-1细胞系,分析野生型和敲除细胞对ALV-J复制的影响,再通过转录组测序技术对敲除细胞与野生型细胞的基因表达谱进行了差异分析。结果显示:设计的sgRNA均具有T7E1酶切割活性且sgRNA-1切割活性最高。DNA测序显示,筛选DOT1L敲除的阳性细胞外显子区域分别缺失2个和4个碱基,导致移码突变产生。Western blot验证DOT1L基因敲除的单克隆细胞的H3K79me2水平显著降低(P<0.05),并且DOT1L敲除显著抑制ALV-J复制。RNA-Seq结果显示,与野生细胞系相比DOT1L敲除细胞系的差异表达基因(DEGs)共有2821个,其中上调基因1384个,下调基因1437个。DEGs的GO功能注释主要与细胞成长代谢和生物过程的调节相关;KEGG通路富集分析主要集中在细胞黏附、ECM受体和Wnt途径等信号通路。综上,研究首次成功构建了DOT1L基因敲除的鸡胚成纤维细胞系,并通过转录组测序分析和筛选DOT1L基因敲除细胞系的差异基因表达谱,这有助于理解DOT1L基因在鸡胚成纤维细胞中的潜在作用,还为进一步探究鸡DOT1L的抗病毒天然免疫调控功能提供重要的生物材料。 展开更多
关键词 DOT1L基因 鸡胚成纤维细胞系 CRISPR-Cas9 ALV-J 转录组测序
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巨噬细胞特异性胶原β(1-O)半乳糖基转移酶1基因敲除小鼠模型的构建与鉴定
3
作者 仇培培 孙晓娇 +4 位作者 王蕾 王祉祺 衣楚潇 刘振明 张继国 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第8期1214-1222,共9页
Colgalt1异常表达与肿瘤发生、发展密切相关,但其调控巨噬细胞影响肿瘤发展的机制尚不明确。本研究旨在构建巨噬细胞特异性Colgalt 1基因敲除小鼠模型,以深入探究Colgalt1调控巨噬细胞功能进而影响肿瘤相关疾病发生和发展的机制。首先,... Colgalt1异常表达与肿瘤发生、发展密切相关,但其调控巨噬细胞影响肿瘤发展的机制尚不明确。本研究旨在构建巨噬细胞特异性Colgalt 1基因敲除小鼠模型,以深入探究Colgalt1调控巨噬细胞功能进而影响肿瘤相关疾病发生和发展的机制。首先,利用基因编辑构建了Colgalt1^(flox+)小鼠,随后将其与髓细胞系(包括单核细胞、成熟巨噬细胞)组织特异性表达的Lyz2-Cre^(+)小鼠进行杂交。通过这一策略,成功获得基因型为Colgalt1^(-/-)Lyz2-Cre^(+)的小鼠,实现了巨噬细胞中Colgalt 1基因的条件性敲除,以Colgalt1 flox/flox Lyz2-Cre^(-)小鼠作为对照组。通过PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对敲除小鼠的Flox及Cre基因型进行鉴定。采用实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹技术,检测敲除小鼠骨髓来源巨噬细胞中Colgalt1的表达水平。Western印迹结果显示,与对照组相比,敲除小鼠骨髓来源的巨噬细胞中Colgalt1的表达水平显著下调(P<0.01);RT-qPCR结果显示,与对照组相比,敲除小鼠骨髓来源的巨噬细胞中Colgalt 1在mRNA水平显著下调(P<0.001),而在小鼠的肝、肺和脾等组织中,Colgalt 1基因的mRNA表达无明显差异。此外,采用免疫组织化学方法检测肝内特异性巨噬细胞中Colgalt1的表达,结果显示,在敲除小鼠肝的巨噬细胞中未观察到Colgalt1阳性表达。通过苏木精-伊红染色观察2组小鼠肝组织内细胞形态,结果显示,2组小鼠肝组织内细胞形态无明显差异,且组织器官未发现明显病变,小鼠整体生存亦未受到影响,最后,通过RT-qPCR检测了巨噬细胞相关炎性因子在2组小鼠BMDMs中的表达,结果表明,与对照组相比,敲除组小鼠BMDMs中TNF-α表达显著下调(P<0.05),而IL-10(P<0.01)、精氨酸酶1(arginase1)(P<0.001)和CD206(P<0.001)表达显著上调,表明巨噬细胞敲除Colgalt 1后呈现抗炎趋势并向M2极化。综上所述,本研究成功构建了巨噬细胞特异性Colgalt 1基因敲除小鼠,为深入探究Colgalt1在巨噬细胞功能调控以及肿瘤疾病发生机制中的具体作用,提供了更为可靠的实验动物模型,有望为肿瘤等疾病的治疗提供新的靶点和思路。 展开更多
关键词 胶原β(1-O)半乳糖基转移酶1 条件性基因敲除 巨噬细胞 Cre-LoxP重组酶系统 动物模型
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利用CRISPR/Cas9技术构建ST细胞Beclin1基因敲除稳定细胞株
4
作者 俞晖 陈海恩 +3 位作者 苏绮玲 黄怡丹 吴江 康恺 《现代畜牧兽医》 2025年第6期18-22,共5页
试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除猪睾丸(swine testis,ST)细胞系Beclin1基因,构建自噬基因敲除细胞株,为后续研究自噬在ST细胞增殖过程中与其他生理功能之间的关系奠定基础。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性靶向Beclin... 试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除猪睾丸(swine testis,ST)细胞系Beclin1基因,构建自噬基因敲除细胞株,为后续研究自噬在ST细胞增殖过程中与其他生理功能之间的关系奠定基础。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性靶向Beclin1基因第1个外显子相关序列的sgRNA,构建pLV3-U6-MCS-sgRNA重组质粒。测序鉴定后将重组质粒转染至ST细胞中,使用嘌呤霉素筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,采用Western blot法鉴定细胞Beclin1敲除效果。结果显示,经过CRISPR/Cas9系统处理后,筛选获得了ST敲除Beclin1稳定细胞株。与原始ST细胞株相比,B组敲除Beclin1稳定细胞株中未检出Beclin1蛋白质的表达。研究表明,试验成功构建了Beclin1敲除的ST细胞株,为Beclin1功能研究提供了有力工具。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 BECLIN1 ST细胞 基因敲除
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尖孢镰刀菌亚麻专化型FolSid1基因敲除及功能分析
5
作者 高芳 侯占铭 《华北农学报》 北大核心 2025年第1期189-198,共10页
通过克隆尖孢镰刀菌亚麻专化型FolSid1基因,确定该基因在镰刀菌中的生物学功能以及蛋白定位。通过与尖孢镰刀菌近缘菌同源比对,克隆得到FolSid1的基因序列,基于同源重组原理,使用Split Marker法构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒... 通过克隆尖孢镰刀菌亚麻专化型FolSid1基因,确定该基因在镰刀菌中的生物学功能以及蛋白定位。通过与尖孢镰刀菌近缘菌同源比对,克隆得到FolSid1的基因序列,基于同源重组原理,使用Split Marker法构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒,通过PEG介导法转入野生型原生质体中,获得基因敲除突变体(ΔFolSid1),对突变菌株做表型鉴定和致病力分析,分析该基因在尖孢镰刀菌亚麻专化型中的功能。构建含有FolSid1基因的绿色荧光表达载体pZESH1,对FolSid1-EGFP融合蛋白进行亚细胞定位。结果表明,FolSid1基因序列全长5 392 bp,含有3个内含子。与野生型和外插入突变体相比,尽管敲除突变体ΔFolSid1分生孢子形态和大小没有不同,但产量显著下降;形态学观察发现,敲除突变体的生长速度明显减慢;亚麻试验显示,缺失突变体的致病力明显降低;基因的亚细胞定位试验显示,FolSid1蛋白主要定位于菌丝细胞的细胞膜上。FolSid1基因能够调控尖孢镰刀菌亚麻专化型的菌丝营养生长、分生孢子发生且对亚麻具有致病性。 展开更多
关键词 尖孢镰刀菌亚麻专化型 FolSid1 Split Marker 基因敲除
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CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立 被引量：1
6
作者 王俊政 李艳如 +7 位作者 赵丽华 刘曼菱 张曼玲 金永 陈俏羽 王晨宇 尤志欢 李荣凤 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期143-148,共6页
目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模... 目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330-sg RNA1和PX330-sg RNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(p CMV-td Tomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sg RNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/-Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。 展开更多
关键词 猪 CRISPR/Cas9 six1基因敲除细胞系 six1/Six4基因敲除细胞系
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敲除β珠蛋白β^(maj)及β^(min)基因的C129小鼠ES-D3细胞系建立 被引量：1
7
作者 韦相才 马芸 +3 位作者 邓新燕 卢丽 黄冰 陈系古 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期2257-2263,共7页
目的通过构建C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因打靶载体,建立C129小鼠敲除β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因ES-D3细胞系,为制作基因敲除嵌合体小鼠提供稳定的胚胎干细胞系。方法根据C129系小鼠β珠蛋白基... 目的通过构建C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因打靶载体,建立C129小鼠敲除β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因ES-D3细胞系,为制作基因敲除嵌合体小鼠提供稳定的胚胎干细胞系。方法根据C129系小鼠β珠蛋白基因分子结构基础,用基因克隆方法在βmaj和及βmin两个同源序列两侧分别将1.7kb和7.0kb的片段插入pNTK质粒中,构建置换型打靶载体β-pNTK,用新霉素抗性基因(Neo)和单疱病毒腺苷激酶(TK)抗性基因作为正负筛选标记。用SalⅠ酶切将打靶载体β-pNTK线性化,采用电穿孔法在ES-D3细胞水平进行打靶,通过G418和GAN进行正负筛选,获得生长良好的胚胎干细胞克隆;用PCR和Southern印迹杂交方法鉴定阳性克隆基因组DNA整合结果,用碱性磷酸酶实验、体外胚体形成实验以及畸胎瘤成瘤实验鉴定细胞生物学特性。结果构建了C129系小鼠置换型打靶载体,经Neo-Major鉴定引物PCR扩增、BamHⅠ及EcoRⅠ酶切及部分测序分析,所插入方向正确,结构合理,达到所预期的目的;获得了8个阳性克隆珠,阳性克隆细胞株经PCR和South-ern印迹杂交方法鉴定外源基因整合到ES细胞基因组DNA中;经胚胎干细胞特性鉴定所获细胞具有良好的未分化特性和多能性。结论构建了C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因置换型打靶载体;该载体在胚胎干细胞水平进行基因打靶后,获得了稳定的敲除β珠蛋白内源性珠蛋白βmaj及βmin基因的胚胎干细胞系,为制作基因敲除嵌合体小鼠奠定了基础。 展开更多
关键词 基因敲除 基因 β^maj及β^min 珠蛋白 ES—D3细胞系 干细胞
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小鼠MYSM1基因稳定敲除的间充质干细胞系C3H10T 1/2的建立及其体外免疫调节作用 被引量：6
8
作者 刘宇 朱恒 +6 位作者 江小霞 张斌 廖丽 刘元林 张毅 陈虎 毛宁 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期549-554,共6页
目的:本研究旨在构建小鼠组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1基因敲除的间充质干细胞系(mesenchymal stem cells,MSC),并初步探讨MYSM1基因敲除后MSC免疫学特性的变化。方法:通过CRISPR-Cas9技术对小鼠间充质干细胞系(C3H10T 1/2)MYSM1基因进行... 目的:本研究旨在构建小鼠组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1基因敲除的间充质干细胞系(mesenchymal stem cells,MSC),并初步探讨MYSM1基因敲除后MSC免疫学特性的变化。方法:通过CRISPR-Cas9技术对小鼠间充质干细胞系(C3H10T 1/2)MYSM1基因进行特异性基因敲除,再采用流式细胞术、定量PCR和蛋白印迹(Western blot)技术检测基因敲除情况。为检测MYSM1敲除对MSC免疫调节能力的影响,将MYSM1基因敲除的MSC上清加入脾脏淋巴细胞培养体系中,在镜下观察其对淋巴细胞增殖的调节作用,并进一步采用定量PCR检测淋巴细胞内炎性因子白介素4,干扰素γ、白介素17A和Foxp3的表达情况。结果:流式细胞术、定量PCR及Western blot的鉴定结果表明,CRISPR-Cas9技术稳定敲除了MSC细胞系内MYSM1基因。敲除了MYSM1基因之后的MSC上清显著抑制刀豆蛋白A诱导的淋巴细胞增殖及炎性因子分泌(P<0.05)。结论:本研究成功地构建了小鼠MYSM1稳定敲除的间充质干细胞系,同时发现MYSM1敲除后MSC体外免疫抑制作用增强,此相关发现为深入研究MYSM1基因的功能,探索基因修饰MSC对免疫相关性疾病的治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1 间充质干细胞 CRISPR-Cas9 基因敲除
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利用CRISPR/Cas9系统构建Lrtm1基因敲除的C2C12细胞系 被引量：4
9
作者 李浩可 何衍佶 +5 位作者 时迎旭 杨丹 尹凤 高彦飞 聂茂 邓忠良 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1127-1133,共7页
目的:利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除Lrtm1(leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1)基因的C2C12细胞系,为研究Lrtm1基因的作用提供实验基础。方法:设计3对针对Lrtm1基因的向导RNA(sgRNA),将sgRNA插入载体pCRISPRLvSG06中... 目的:利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除Lrtm1(leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1)基因的C2C12细胞系,为研究Lrtm1基因的作用提供实验基础。方法:设计3对针对Lrtm1基因的向导RNA(sgRNA),将sgRNA插入载体pCRISPRLvSG06中;利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pCRISPR-LvSG06;将病毒感染C2C12细胞,并加入嘌呤霉素筛选,将筛选嘌呤霉素阳性的细胞提取RNA,逆转录成c DNA;设计Cas9引物,利用cDNA为模版,PCR验证C2C12细胞中Cas9的表达,确认慢病毒成功感染C2C12细胞;利用96孔板挑选单克隆细胞的方法筛选得到单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序Lrtm1基因相关序列并与野生型Lrtm1基因进行对比,确认敲除成功的克隆细胞株;诱导敲除Lrtm1稳定细胞株成肌分化,检测成肌分化标志因子Myosin的蛋白表达,RT-PCR检测转录因子PAX7的mRNA表达,Western blot检测H3K27me3蛋白水平。结果:测序结果显示向导RNA(sgRNA)成功插入载体质粒;将单克隆细胞DNA测序结果显示A和C克隆成功敲除Lrtm1基因;敲除Lrtm1基因后成肌分化标志因子Myosin蛋白表达降低,成肌转录因子PAX7 mRNA的表达降低,在分化72和96 h组,H3K27me3蛋白水平较野生型组增高。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功敲除Lrtm1基因,稳定敲除Lrtm1基因的C2C12细胞系构建成功;敲除Lrtm1后能抑制C2C12细胞成肌分化,并且抑制成肌转录因子PAX7的m RNA表达,PAX7mRNA表达降低的原因可能为H3K27me3水平增高。 展开更多
关键词 Lrtm1 CRISPR/cas9 基因敲除 C2C12
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成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1小鼠的制备 被引量：6
10
作者 李福兵 赵玲 +6 位作者 鲁秀敏 余瑛 何启芬 陈锚锚 段亚琪 戚华兵 陈林 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期280-283,共4页
目的制备在成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1的特定细胞阶段性基因敲除小鼠。方法从美国NIH引进SPF级fgfr1条件性基因敲除(fgfr1flox/flox)小鼠,进行饲养、繁殖和PCR鉴定;fgfr1flox/flox小鼠与在成熟成骨细胞表达Cre重组酶的OC-Cre小鼠交配... 目的制备在成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1的特定细胞阶段性基因敲除小鼠。方法从美国NIH引进SPF级fgfr1条件性基因敲除(fgfr1flox/flox)小鼠,进行饲养、繁殖和PCR鉴定;fgfr1flox/flox小鼠与在成熟成骨细胞表达Cre重组酶的OC-Cre小鼠交配,获得在成熟成骨细胞中敲除一个基因拷贝的杂合子小鼠;杂合子小鼠之间交配,或者杂合子小鼠与fgfr1flox/flox小鼠交配,可以获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1基因的小鼠fgfr1△/△/OC-CreTG/+。结果成功制备在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的细胞特异性敲除小鼠。结论成功引进fgfr1flox/flox小鼠,应用合理的基因条件性敲除繁殖策略,获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的基因敲除小鼠。 展开更多
关键词 FGFR1 条件性基因敲除 小鼠 骨骼发育
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HSF1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化 被引量：6
11
作者 刘梅冬 张华莉 +4 位作者 龚环宇 陈广文 王慷慨 鄂顺梅 肖献忠 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期174-177,共4页
目的:建立HSF1-/-,HSF1+/+两种基因型小鼠胚胎成纤维永生化细胞系,为HSF1的功能研究提供实验模型。方法:用脂质体介导的基因转染法将pSV 3 neo质粒导入HSF1-/-,HSF1+/+两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞,经G 4 1 8筛选,抗性克隆扩大培养,建... 目的:建立HSF1-/-,HSF1+/+两种基因型小鼠胚胎成纤维永生化细胞系,为HSF1的功能研究提供实验模型。方法:用脂质体介导的基因转染法将pSV 3 neo质粒导入HSF1-/-,HSF1+/+两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞,经G 4 1 8筛选,抗性克隆扩大培养,建立永生化细胞系;用PCR检测两种细胞株中目的基因的整合,用RT-PCR法鉴定SV 4 0T基因在转染细胞中的表达;用W estern b lot检测所建细胞株的诱导型热休克蛋白7 0的表达情况。结果:有3个细胞克隆已扩大培养稳定传代达6个月,经鉴定SV 4 0 T抗原已整合到两种细胞中且稳定表达,HSF1-/-胚胎成纤维细胞热休克蛋白7 0的诱导表达消失。结论:成功建立永生化HSF1-/-,HSF1+/+两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞。 展开更多
关键词 HSF1 基因敲除 胚胎成纤维细胞 永生化 SV40 T抗原
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应用辐射杂种细胞系对猪CACNA1S基因的定位研究 被引量：7
12
作者 方晓敏 赵晓枫 +1 位作者 郭晓令 徐宁迎 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期309-312,共4页
CACNA1S是钙离子通道α1亚单位的编码基因,该基因突变会导致人低钾性周期性麻痹和猪恶性高温综合征。根据人CACNA1S基因3′端非翻译区序列设计引物,对猪基因组DNA进行PCR扩增、测序,与人相应序列作同源性比较;然后采用IMpRHpanel将CACN... CACNA1S是钙离子通道α1亚单位的编码基因,该基因突变会导致人低钾性周期性麻痹和猪恶性高温综合征。根据人CACNA1S基因3′端非翻译区序列设计引物,对猪基因组DNA进行PCR扩增、测序,与人相应序列作同源性比较;然后采用IMpRHpanel将CACNA1S基因定位于猪10p11-12。 展开更多
关键词 钙离子通道 CACNA1S 辐射杂种细胞系 基因定位
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利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系
13
作者 乔延召 刘凯 +3 位作者 李清华 黄建豪 卫恒习 张守全 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期1-8,共8页
【目的】将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。【方法】分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行2... 【目的】将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。【方法】分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2AGFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。【结果】建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLVsgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。【结论】利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。 展开更多
关键词 猪 Tet-on系统 CRISPR/Cas9系统 Sohlh1 基因敲除
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敲除BMAL1基因促进HL-60细胞凋亡并抑制增殖 被引量：3
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作者 牟佼 戴进前 +4 位作者 刘明莉 倪庆仁 张韵洁 温静 宋艳萍 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期1027-1032,共6页
目的:运用CRISPR/Cas9技术敲除节律基因BMAL1的HL-60细胞系,探讨BMAL1分子在人急性髓系白血病中的生物学功能。方法:针对BMAL1基因设计2条sg RNA,构建含有sg RNA的PX459敲除载体;应用T7核酸内切酶I检测设计的sg RNA活性;应用打靶载体瞬... 目的:运用CRISPR/Cas9技术敲除节律基因BMAL1的HL-60细胞系,探讨BMAL1分子在人急性髓系白血病中的生物学功能。方法:针对BMAL1基因设计2条sg RNA,构建含有sg RNA的PX459敲除载体;应用T7核酸内切酶I检测设计的sg RNA活性;应用打靶载体瞬时转染HL-60细胞构建BMAL1敲除细胞系,应用Western blot检测BMAL1蛋白的表达,应用流式细胞仪检测敲除细胞系的凋亡水平,应用CCK-8试剂盒检测敲除细胞系的增殖能力。结果:成功构建了针对BMAL1的PX459-sg RNA载体;并筛选得到了活性较高的打靶载体。Western blot实验在敲除细胞中未检测到BMAL1蛋白的表达。进一步实验发现,BMAL1敲除的HL-60细胞凋亡水平明显升高,细胞增殖能力明显减弱。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了BMAL1基因敲除的HL-60细胞系,并发现BMAL1敲除可以促进HL-60细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖,初步揭示了BMAL1生物节律基因在急性髓系白血病中的生物学作用。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 BMAL1 基因敲除 急性髓系白血病
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建立高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系的研究 被引量：2
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作者 李雅慧 黎怀星 +2 位作者 吴丹 蔡东联 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第8期892-894,共3页
目的:建立一个组成性地高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系。方法:(1)采用重组DNA技术将小鼠Retn基因的全长cDNA克隆到质粒pcDNA3的CMV启动子下面而获得一个能在真核细胞内组成性表达小鼠Resistin蛋白的表达载体pcDNA3-mRetn。(2)用电穿... 目的:建立一个组成性地高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系。方法:(1)采用重组DNA技术将小鼠Retn基因的全长cDNA克隆到质粒pcDNA3的CMV启动子下面而获得一个能在真核细胞内组成性表达小鼠Resistin蛋白的表达载体pcDNA3-mRetn。(2)用电穿孔转染和G418筛选等方法建立能组成性地高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系。(3)诱导细胞分化为脂肪细胞,并用实时荧光RT-PCR法分析这些脂肪细胞内Retn基因mRNA的水平。结果:构建了一个能在真核细胞内表达小鼠Retn基因的表达载体;建立了一个携带有pcDNA3-mRetn载体并组成性地高表达小鼠Retn基因的细胞系。结论:成功地建立了一个组成性地高表达小鼠Retn基因细胞系,为进一步研究Retn基因的功能和小鼠Resistin蛋白的获得奠定了基础。 展开更多
关键词 Resistin蛋白 Retn基因 基因表达 3T3-L1细胞系
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利用CRISPR/Cas9系统建立叉头框G1基因敲除的人胚胎干细胞系
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作者 袁媛 张冠宇 +3 位作者 孙平新 章越凡 李铁军 李文林 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期513-519,共7页
目的采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建叉头框G1(FOXG1)基因敲除的人胚胎干细胞系,研究FOXG1基因在人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的作用。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过转染2个... 目的采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建叉头框G1(FOXG1)基因敲除的人胚胎干细胞系,研究FOXG1基因在人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的作用。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过转染2个向导RNA(gRNA)诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除,经单克隆筛选、测序分析和蛋白质印迹分析验证获得FOXG1基因敲除的人胚胎干细胞;通过细胞免疫荧光染色、qRT-PCR检测FOXG1基因敲除前后细胞在早期神经诱导过程中关键标志物配对框基因6(PAX6)、性别决定区Y框蛋白2(SOX2)和正小齿同源物2(OTX2)的表达。结果利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得FOXG1基因大片段缺失的人胚胎干细胞,细胞免疫荧光染色、qRT-PCR结果均显示人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的关键标志物PAX6、SOX2和OTX2的表达并未受FOXG1缺失的影响。结论通过2个gRNA共转染可以快捷地诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除。FOXG1基因缺失并不影响人胚胎干细胞的早期神经诱导。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑 叉头框蛋白G1 基因敲除 人胚胎干细胞
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NB4细胞系诱导分化过程中WT1基因表达的变化 被引量：4
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作者 王玲 陈子兴 +2 位作者 傅建新 岑建农 王玮 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2001年第2期128-131,共4页
为了研究WT1基因的表达与NB4细胞诱导分化的关系 ,应用基因重组技术建立了竞争性RT PCR定量检测WT1基因表达的方法 ,并用间接免疫荧光标记法检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化。结果发现 ,随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因表达迅速下降 ... 为了研究WT1基因的表达与NB4细胞诱导分化的关系 ,应用基因重组技术建立了竞争性RT PCR定量检测WT1基因表达的方法 ,并用间接免疫荧光标记法检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化。结果发现 ,随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因表达迅速下降 ,全反式维甲酸(ATRA)作用 0 ,12 ,2 4小时后每 μg总RNA中WT1基因的分子数分别为 4× 10 6,1.5 6× 10 6和0 .4× 10 6,与CD11b的变化情况相一致。结论提示 ,WT1基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关 。 展开更多
关键词 NB4细胞系 WT1基因 诱导分化 白血病 竞争性逆转录-聚合酶链反应
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MST1敲除减弱丹酚酸B抑制pERK抗肾纤维化作用
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作者 李玉轩 王莹莹 +2 位作者 陶慧敏 江洁美 杨雁 《中国药理学通报》 北大核心 2025年第11期2046-2052,共7页
目的 探讨MST1敲除减弱丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)抑制pERK抗肾纤维化作用。方法 体外实验用XMU-XP-1(10μmol·L^(-1))抑制剂刺激人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2);体内实验用DEN/CCl_(4)/C_(2)H_(5)OH(DCC)诱导野生型(WT)... 目的 探讨MST1敲除减弱丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)抑制pERK抗肾纤维化作用。方法 体外实验用XMU-XP-1(10μmol·L^(-1))抑制剂刺激人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2);体内实验用DEN/CCl_(4)/C_(2)H_(5)OH(DCC)诱导野生型(WT)和MST1全身性基因敲除小鼠(MST1^(-/-))肾纤维化模型,用Sal B (15 mg·kg^(-1)·d^(-1),ig)干预。HE和Masson染色观察肾组织病理情况;Western blot检测α-SMA和pERK蛋白表达;免疫荧光法检测pERK蛋白表达。结果体外结果表明,Sal B可以抑制pERK蛋白表达。体内结果表明,Sal B可以改善DCC诱导的肾组织病理损伤,抑制α-SMA、pERK蛋白表达;MST1^(-/-)加重病理损伤,明显上调α-SMA、pERK蛋白的表达。结论 Sal B通过抑制ERK蛋白的磷酸化,降低XMU-MP-1对HK-2细胞的刺激作用;Sal B通过抑制α-SMA蛋白、ERK蛋白的磷酸化从而发挥抗肾纤维化的作用;并且MST1^(-/-),加重肾组织病理损伤,明显上调α-SMA、pERK蛋白的表达,进而减弱Sal B的抗肾纤维化作用。 展开更多
关键词 丹酚酸B HK-2 肾纤维化 MST1 基因敲除 MAPK/ERK
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应用CRISPR/Cas9系统敲除PD-1基因对人T淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ的影响 被引量：2
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作者 龚福生 许扬梅 +2 位作者 刘施佳 黄丽洁 郑秋红 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期656-661,共6页
目的:探讨应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除PD-1基因对人T细胞增殖及分泌IFN-γ的影响。方法:设计靶向PD-1基因的sgRNA序列,应用T7 RNA聚合酶体外分别合成PD-1-sgRNA和Cas9mRNA。利用核转染技术将PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA混合物转入激活的... 目的:探讨应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除PD-1基因对人T细胞增殖及分泌IFN-γ的影响。方法:设计靶向PD-1基因的sgRNA序列,应用T7 RNA聚合酶体外分别合成PD-1-sgRNA和Cas9mRNA。利用核转染技术将PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA混合物转入激活的人T淋巴细胞,测序确认基因敲除的效率。应用流式细胞术分析基因敲除后T淋巴细胞表型和PD-1的表达情况,锥虫蓝活细胞计数法检测T细胞增殖活力,ELISA检测T细胞分泌IFN-γ情况。结果:体外成功合成PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA。将PD-1-sgRNA和Cas9 m RNA核转染T淋巴细胞,测序证实PD-1基因序列编辑效率为58.3%。CRISPR/Cas9系统成功下调T淋巴细胞表面PD-1分子的表达水平[(9.6±1.85)%vs(16.2±2.05)%,P<0.05],PD-1基因敲除不影响T细胞的增殖活力和细胞表型(P>0.05);但PD-1-sgRNA组的效应T细胞分泌IFN-γ水平显著升高(P<0.01)。结论:CRISPR/Cas9基因编辑系统成功敲除人T淋巴细胞PD-1基因,降低PD-1分子表达可阻断PD-1/PD-L1负性调控从而增强T细胞的免疫活性,且促进效应T细胞分泌IFN-γ。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9系统 T淋巴细胞 核转染 PD-1 基因敲除 IFN-Γ
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一种快速获得Vav1基因敲除稳定细胞系的方法
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作者 郭果 李赛超 +3 位作者 王丽 刘璐 卢燎勋 黄蓉 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2018年第8期101-107,共7页
目的建立一种快速获得Vav1基因敲除稳定细胞系的方法。方法构建针对小鼠Vav1基因的特异性打靶载体,利用脂质体转染法转染B16小鼠黑色素瘤细胞,使用流式细胞仪对GFP阳性单细胞进行分选,对得到的GFP阳性单克隆细胞使用直接裂解法获取基因... 目的建立一种快速获得Vav1基因敲除稳定细胞系的方法。方法构建针对小鼠Vav1基因的特异性打靶载体,利用脂质体转染法转染B16小鼠黑色素瘤细胞,使用流式细胞仪对GFP阳性单细胞进行分选,对得到的GFP阳性单克隆细胞使用直接裂解法获取基因组DNA,将其用于荧光PCR,产物通过毛细管电泳和分析后即可快速获知其基因型。结果使用以上方法在短时间内得到了大量GFP阳性单克隆细胞,从中随机挑选16个,通过荧光PCR检测其基因型,结果表明敲除效率为87.5%;通过测序对部分荧光PCR结果进行验证,发现其基因型结果完全正确。结论将CRISPR/Cas9基因编辑系统、流式细胞仪单克隆分选、荧光PCR和大批量DNA样本处理技术结合,可以短时间内在B16小鼠黑色素瘤细胞中获得大量Vav1基因敲除稳定单克隆细胞。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因敲除 Vav1基因 流式细胞仪分选 荧光PCR
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