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CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立 被引量：1
1
作者 王俊政 李艳如 +7 位作者 赵丽华 刘曼菱 张曼玲 金永 陈俏羽 王晨宇 尤志欢 李荣凤 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期143-148,共6页
目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模... 目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330-sg RNA1和PX330-sg RNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(p CMV-td Tomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sg RNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/-Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。 展开更多
关键词 猪 CRISPR/Cas9 six1基因敲除细胞系 six1/six4基因敲除细胞系
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NB4细胞系诱导分化过程中WT1基因表达的变化 被引量：4
2
作者 王玲 陈子兴 +2 位作者 傅建新 岑建农 王玮 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2001年第2期128-131,共4页
为了研究WT1基因的表达与NB4细胞诱导分化的关系 ,应用基因重组技术建立了竞争性RT PCR定量检测WT1基因表达的方法 ,并用间接免疫荧光标记法检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化。结果发现 ,随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因表达迅速下降 ... 为了研究WT1基因的表达与NB4细胞诱导分化的关系 ,应用基因重组技术建立了竞争性RT PCR定量检测WT1基因表达的方法 ,并用间接免疫荧光标记法检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化。结果发现 ,随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因表达迅速下降 ,全反式维甲酸(ATRA)作用 0 ,12 ,2 4小时后每 μg总RNA中WT1基因的分子数分别为 4× 10 6,1.5 6× 10 6和0 .4× 10 6,与CD11b的变化情况相一致。结论提示 ,WT1基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关 。 展开更多
关键词 NB4细胞系 WT1基因 诱导分化 白血病 竞争性逆转录-聚合酶链反应
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利用CRISPR/Cpf1系统构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的293T细胞株 被引量：2
3
作者 覃鸿妮 谢钰珍 +1 位作者 马傲 蔡一林 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第4期741-750,共10页
【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子... 【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子的sgRNA序列,分别克隆到AsCpf1和LbCpf1的载体上。将测序验证正确的重组质粒转染到HEK293T细胞中,T7E1酶切和测序验证敲除效率,对敲除成功的293T细胞利用有限稀释法筛选获得基因双突变的敲除细胞株,对其基因组进行PCR扩增并双向测序验证编辑结果,选择有正确编辑结果的PCR产物进行TA克隆,进而测序验证单克隆细胞株编辑效率。【结果】结果获得敲除ABCG1和ABCG4基因的稳定细胞株各1株(AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1)。【结论】通过利用新型基因编辑技术CRISPR/Cpf1系统,获得了永久性敲除目的细胞靶基因的细胞株,可为进一步探索和证实ABCG1和ABCG4在细胞中胆固醇代谢和调节作用提供帮助。 展开更多
关键词 CRISPR/Cpf1 ABCG1 ABCG4 基因敲除 稳定细胞株
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TLR4^-/- DF1细胞系感染NDV后免疫机制的初步研究 被引量：1
4
作者 王辉 鲁国涛 +6 位作者 许曼 曾为俊 邵玉乐 赵丽丽 陈洪岩 刘建华 孟庆文 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1244-1250,共7页
为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4^-/- DF... 为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4^-/- DF1细胞系;利用新城疫病毒(NDV)感染TLR4^-/- DF1细胞系,采用绝对荧光定量PCR检测NDV拷贝数,相对荧光定量PCR检测TLR4下游接头蛋白、细胞因子及干扰素基因的转录水平。结果显示:与野生型DF1细胞相比,NDV感染6 h、16 h和36 h的TLR4^-/- DF1细胞中病毒基因拷贝数显著升高(p<0.05),16 h升高了2.95倍,感染6 h、16 h和24 h下游接头蛋白MyD88基因转录水平下降,感染16 h促炎因子IL-1β下降了48.5%(p<0.01),IL-8下降了62.5%(p<0.01),I型干扰素转录水平下降。以上结果表明:NDV感染诱导的天然免疫应答可能是通过MyD88途径诱导高水平促炎性因子和I型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达,从而抑制NDV的增殖,TLR4在NDV感染引起的天然免疫应答和疾病防控研究中具有重要意义。同时,本研究TLR4^-/- DF1细胞系的建立可用于病毒引起的炎性因子风暴及天然免疫抗病毒作用的探究。 展开更多
关键词 TLR4 CRISPR/Cas9系统 DF1 基因敲除 NDV
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稳定表达hSOD1^(G93A)基因的肌萎缩侧索硬化体外细胞培养模型的建立与鉴定
5
作者 高文超 樊东升 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2013年第3期12-15,I0003,共5页
目的建立并鉴定稳定表达G93A型突变人超氧化物歧化酶(hSOD1G93A)基因的肌萎缩侧索硬化体外细胞培养模型。方法利用活化的树突状聚合物将空质粒、hSOD1WT、hSOD1G93A基因转染入VSC4.1细胞内,G418抗性筛选,从而建立稳定的肌萎缩侧索硬化... 目的建立并鉴定稳定表达G93A型突变人超氧化物歧化酶(hSOD1G93A)基因的肌萎缩侧索硬化体外细胞培养模型。方法利用活化的树突状聚合物将空质粒、hSOD1WT、hSOD1G93A基因转染入VSC4.1细胞内,G418抗性筛选,从而建立稳定的肌萎缩侧索硬化体外细胞模型。用免疫荧光技术检测VSC4.1细胞系运动神经元标志物。蛋白印迹实验鉴定hSOD1WT蛋白、hSOD1G93A蛋白的表达。MTT法检测细胞模型生长曲线。结果VSC4.1细胞分化前表达ClassⅢβ-Tubulin、MNR2,分化后表达ClassⅢβ-Tubulin、MNR2、NF200、MAP2等运动神经元标志物。VSC4.1-hSOD1WT、VSC4.1-hSOD1G93A细胞均过表达人来源的SOD1,而VSC4.1-mock则不表达。与VSC4.1-mock、VSC4.1-hSOD1WT相比,VSC4.1-hSOD1G93A生长缓慢,在48、72 h细胞活力均低于VSC4.1-mock(P=0.031,P=0.000)、VSC4.1-hSOD1WT(P=0.001,P=0.000),其余时间点无明显差异(P>0.05)。结论成功建立稳定表达hSOD1WT、hSOD1G93A基因的VSC4.1细胞系,为进一步研究肌萎缩侧索硬化的发病与治疗奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 肌萎缩侧索硬化 超氧化物歧化酶 基因突变 VSC4 1细胞系 转染
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Wilms瘤基因WT1表达与急性白血病微小残留病的检测 被引量：3
6
作者 傅建新 王玲 +1 位作者 王玮 陈子兴 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2000年第3期211-215,共5页
近年来发现急性髓性白血病 (AML)有Wilms瘤抑制基因WT1的异常表达 ,且表达水平与预后呈负相关 ,提示其可作为一种新的白血病标志。为探讨WT1能否作为急性白血病微小残留病 (minimalresidualdisease ,MRD)的标志 ,我们采用巢式逆转录聚... 近年来发现急性髓性白血病 (AML)有Wilms瘤抑制基因WT1的异常表达 ,且表达水平与预后呈负相关 ,提示其可作为一种新的白血病标志。为探讨WT1能否作为急性白血病微小残留病 (minimalresidualdisease ,MRD)的标志 ,我们采用巢式逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)测定了WT1基因的灵敏度 ,并与肿瘤特异性标志基因进行比较。所有样本RNA的质量均用内对照c abl基因证实。以两轮RT PCR扩增WT1和肿瘤特异性融合基因检测白血病细胞的极限在NB4细胞分别为 10 -4 和 10 -5,而在K5 62细胞分别为 10 -3- 10 -4 和高于 10 -6 ;在 2 9例供血员的外周血单个核细胞 (MNC)均未检测到WT1基因表达 ,但在 2 1例非恶性疾病患者骨髓MNC中有 8例呈WT1基因阳性 (38.1% )。本研究提示 ,监测WT1表达可用于AML的疗效评价及MRD随访 。 展开更多
关键词 WT1基因 NB4细胞系 微小残留病 白血病
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香蕉枯萎病菌内源报告基因比卡菌素聚酮合酶编码基因Bik1的鉴定及应用 被引量：3
7
作者 王艳玮 曾凡云 +4 位作者 漆艳香 丁兆建 谢艺贤 张欣 彭军 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2022年第3期473-483,共11页
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。本研究克隆鉴定Foc4比卡菌素聚酮合酶编码基因(bikaverin PKS-encodi... 香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。本研究克隆鉴定Foc4比卡菌素聚酮合酶编码基因(bikaverin PKS-encoding gene,Bik1)Foc4Bik1,编码一个由2036个氨基酸组成的多功能酶,具有I型PKS聚酮合酶的保守结构域,包含酰基转移酶功能域[acyl-carrier protein(ACP)transacylase,SAT],β-酮脂酰合成酶功能域(β-ketoacyl synthase,KS),丙二酰酰基转移酶功能域(acyltransferase,AT),脱氢酶(dehydratase,DH)以及硫酯酶(thioesterase,TE)等多个保守蛋白结构域。采用Split-marker同源重组技术获得基因敲除突变体ΔFoc4Bik1,通过比较突变体和野生菌株生长速度、产孢量、致病力等差异,证明ΔFoc4Bik1突变体仅影响次生代谢产物比卡菌素的生物合成,不影响病原菌的其他生理表型及致病力;其次,ΔFoc4Bik1突变体摇培后菌液呈白色,与野生型Foc4的暗红色形成鲜明对比,说明Foc4Bik1基因符合作为内源报告基因的条件。本研究以Foc4Bik1为内源靶标基因,利用水稻恶苗病菌(F.fujikuroi)的基因编辑载体pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph,尝试以质粒体内表达Cas9和sgRNA的方式探索Foc4中CRISPR/Cas9编辑的可行性。gRNA序列由在线网站设计,构建的sgRNA162导入质粒构建靶向Foc4Bik1的pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4Bik1基因编辑载体,与供体质粒pUC19-Foc4Bik1-HDR一起导入原生质体通过同源重组修复(homology directed repair,HDR)的方式进行基因编辑。经过潮霉素抗性筛选获得的ΔFoc4Bik1(HDR)基因编辑后的敲除转化子进行PCR检测和摇培,白色菌液表型与PCR检测阳性的敲除转化子相互对应,证实了Foc4基因编辑的可行性。此外,Foc4Bik1可作为香蕉枯萎菌Foc4内源报告基因并评估探索新的分子生物学技术在香蕉枯萎菌上应用的可能性。 展开更多
关键词 香蕉枯萎菌4号生理小种(Foc4) 比卡菌素聚酮合酶基因Bik1 基因敲除 表型分析 CRISPR/Cas9基因编辑
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精氨酸缺陷型菌株发酵生产反式-4-羟脯氨酸 被引量：2
8
作者 王晓姣 张震宇 +1 位作者 孙付保 于林 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期24-30,共7页
为了获得高产反式-4-羟脯氨酸的菌株,基于大肠杆菌的代谢网络模型的指导,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Δput A为出发菌株,通过基因敲除技术成功敲除arg B基因,阻断L-脯氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-脯氨酸合成的代谢流... 为了获得高产反式-4-羟脯氨酸的菌株,基于大肠杆菌的代谢网络模型的指导,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Δput A为出发菌株,通过基因敲除技术成功敲除arg B基因,阻断L-脯氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-脯氨酸合成的代谢流,构建了精氨酸缺陷型菌株E.coli BL21(DE3)Δput AΔarg B。同时转入表达质粒p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp,该质粒含有突变基因pro B2,该突变基因所编码的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反馈抑制作用显著降低。摇瓶发酵结果表明,在外源添加600 mg/L L-精氨酸时,该重组菌株产反式-4-羟脯氨酸的量达到312.67 mg/L,较菌株E.coli BL21(DE3)Δput A/p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp提高了25.29%。 展开更多
关键词 大肠杆菌1 反式-4-羟脯氨酸2 基因敲除3 脯氨酸4
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冰岛硫化叶菌xpb基因缺失突变体的构建及遗传学分析
9
作者 李素明 张昌毅 +2 位作者 彭楠 梁运祥 佘群新 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期28-33,共6页
为在体内研究古菌核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)机制,利用基因敲除的方法,对泉古菌核苷酸切除修复机制进行研究,构建了冰岛硫化叶菌编码真核生物NER解旋酶XPB同源蛋白的基因xpb1和xpb2单缺失突变体,从而在体内分析xpb... 为在体内研究古菌核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)机制,利用基因敲除的方法,对泉古菌核苷酸切除修复机制进行研究,构建了冰岛硫化叶菌编码真核生物NER解旋酶XPB同源蛋白的基因xpb1和xpb2单缺失突变体,从而在体内分析xpb1和xpb2基因的功能。结果表明:基因xpb1或xpb2不是冰岛硫化叶菌存活的必需基因。表型分析发现,xpb1和xpb2基因单缺失突变体相较野生型菌株REY15A,对DNA损伤试剂4-NQO 4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide,4-NQO)分别表现出轻微敏感性和不敏感性,暗示NER解旋酶功能在冰岛硫化叶菌体内存在多重冗余。 展开更多
关键词 核苷酸切除修复 超嗜热古菌 xpb基因 基因敲除 缺失突变体 4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)
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