芝麻是八大类食物过敏原之一,快速准确识别芝麻过敏原对预防其过敏有重要意义。核酸适配体可以高效识别靶标过敏原,在过敏原检测中有良好的应用前景。为了获得芝麻主要过敏原Ses i 2的特异性核酸适体,本研究以Ses i 2为靶标,通过磁珠筛...芝麻是八大类食物过敏原之一,快速准确识别芝麻过敏原对预防其过敏有重要意义。核酸适配体可以高效识别靶标过敏原,在过敏原检测中有良好的应用前景。为了获得芝麻主要过敏原Ses i 2的特异性核酸适体,本研究以Ses i 2为靶标,通过磁珠筛选法(磁珠-SELEX)开展10轮筛选,经由高通量测序获得6条候补序列(S1~S6),并进行家族性、同源性分析及二级结构预测。结果表明,6条候选核酸适体的重复率可达46.38%,其自由能在-9.02到-2.47 kcal·moL^(-1)之间,根据自由能能量稳定原则,S1和S5吉布斯自由能最低最稳定,分别为-6.70和-9.02 kcal·moL^(-1)。利用ELISA试验进行亲和力测试,结果表明核酸适体S1和S2的亲和能力较强,S1:KD=67.02 nmol·L^(-1),R2=0.925 8,S2:KD=97.65 nmol·L^(-1),R2=0.795 1。核酸适体S1与过敏原Ses i 2的结合力和其他过敏原蛋白相比有显著差异,可视为具有特异性。本研究最终获得一条兼具良好亲和力和特异性的核酸适体S1,为芝麻过敏原快速检测提供了技术支撑。展开更多
从芝麻中提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应得到芝麻蛋白Ses i 3基因,构建pET-22b(+)质粒表达载体,转入BL21(DE3)感受态细胞宿主表达菌中诱导表达,经镍离子亲和层析柱获得纯品目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示目的...从芝麻中提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应得到芝麻蛋白Ses i 3基因,构建pET-22b(+)质粒表达载体,转入BL21(DE3)感受态细胞宿主表达菌中诱导表达,经镍离子亲和层析柱获得纯品目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示目的蛋白分子质量约为66 kDa。进而采用BALB/c小鼠过敏模型评价重组Ses i 3蛋白与天然Ses i 3蛋白诱发小鼠芝麻过敏反应的差别,通过测定相关过敏性指标(特异性抗体羊抗鼠免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)E、IgG1和IgG2a;细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-5、干扰素-γ和组胺)发现,重组蛋白Ses i 3诱发小鼠芝麻过敏的能力与天然Ses i 3蛋白相似。因此,本研究通过原核表达系统获得重组的芝麻重组蛋白Ses i 3,并证实其与天然Ses i 3蛋白具有相似的免疫活性,可以用于后续的芝麻致敏性研究。展开更多
文摘芝麻是八大类食物过敏原之一,快速准确识别芝麻过敏原对预防其过敏有重要意义。核酸适配体可以高效识别靶标过敏原,在过敏原检测中有良好的应用前景。为了获得芝麻主要过敏原Ses i 2的特异性核酸适体,本研究以Ses i 2为靶标,通过磁珠筛选法(磁珠-SELEX)开展10轮筛选,经由高通量测序获得6条候补序列(S1~S6),并进行家族性、同源性分析及二级结构预测。结果表明,6条候选核酸适体的重复率可达46.38%,其自由能在-9.02到-2.47 kcal·moL^(-1)之间,根据自由能能量稳定原则,S1和S5吉布斯自由能最低最稳定,分别为-6.70和-9.02 kcal·moL^(-1)。利用ELISA试验进行亲和力测试,结果表明核酸适体S1和S2的亲和能力较强,S1:KD=67.02 nmol·L^(-1),R2=0.925 8,S2:KD=97.65 nmol·L^(-1),R2=0.795 1。核酸适体S1与过敏原Ses i 2的结合力和其他过敏原蛋白相比有显著差异,可视为具有特异性。本研究最终获得一条兼具良好亲和力和特异性的核酸适体S1,为芝麻过敏原快速检测提供了技术支撑。
文摘从芝麻中提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应得到芝麻蛋白Ses i 3基因,构建pET-22b(+)质粒表达载体,转入BL21(DE3)感受态细胞宿主表达菌中诱导表达,经镍离子亲和层析柱获得纯品目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示目的蛋白分子质量约为66 kDa。进而采用BALB/c小鼠过敏模型评价重组Ses i 3蛋白与天然Ses i 3蛋白诱发小鼠芝麻过敏反应的差别,通过测定相关过敏性指标(特异性抗体羊抗鼠免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)E、IgG1和IgG2a;细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-5、干扰素-γ和组胺)发现,重组蛋白Ses i 3诱发小鼠芝麻过敏的能力与天然Ses i 3蛋白相似。因此,本研究通过原核表达系统获得重组的芝麻重组蛋白Ses i 3,并证实其与天然Ses i 3蛋白具有相似的免疫活性,可以用于后续的芝麻致敏性研究。
