生乳易受沙门氏菌污染,并大量繁殖;经加工的乳制品细菌数大大减少,但仍存在沙门氏菌污染的风险。试验按生乳及乳制品沙门氏菌污染水平研究样品前处理方法,采用煮沸裂解法快速提取总DNA,针对沙门氏菌invA基因建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PC...生乳易受沙门氏菌污染,并大量繁殖;经加工的乳制品细菌数大大减少,但仍存在沙门氏菌污染的风险。试验按生乳及乳制品沙门氏菌污染水平研究样品前处理方法,采用煮沸裂解法快速提取总DNA,针对沙门氏菌invA基因建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR快速检测技术。建立的方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,其中生乳沙门氏菌检出限为102cfu.mL-1,方法的检测线性范围为102～108cfu.mL-1,相关系数(R2)为0.999,扩增效率为103%;乳制品沙门氏菌经16 h增菌后检出限达到1 cfu.[25 g(mL)]-1。该技术可用于生乳中沙门氏菌的高效筛查及定量检测,检测一个样品仅需3 h;同时,可用于乳制品的准确定性检测,检测周期为1 d;且方法重复性好、准确度高、操作简单,为乳制品企业快速检测沙门氏菌提供了有效的技术手段。展开更多
为了建立转基因产品新型检测技术,采用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术和三对特异引物,检测抗虫转基因水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)。结果表明,利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到转Cry1Ab/c基因...为了建立转基因产品新型检测技术,采用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术和三对特异引物,检测抗虫转基因水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)。结果表明,利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到转Cry1Ab/c基因抗虫水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)扩增所产生的荧光信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体。SYBR Green Ⅰ实时PCR技术是转基因成分检测的一种新方法。展开更多
本研究根据赤羽病毒(AKAV)的S基因序列设计合成了引物,RT-PCR扩增得到目的基因片段并克隆到PGM-T载体得到质粒标准品。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测AKAV的方法。该方法的检测敏感性达到926拷贝...本研究根据赤羽病毒(AKAV)的S基因序列设计合成了引物,RT-PCR扩增得到目的基因片段并克隆到PGM-T载体得到质粒标准品。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测AKAV的方法。该方法的检测敏感性达到926拷贝/25μL,并具有较好的重复性和特异性。本试验方法的建立对于加强进出口牛AKAV的检验检疫具有十分重要的意义。展开更多
猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2(开放阅读框2)基因编码其核衣壳蛋白,它含有导致病毒致病性的多个抗原决定簇位点。根据ORF2基因序列设计特异性引物,以感染PCV-2的Dulac细胞冻融上清为模板,克隆该开放阅读框的全基因序列。然后以该重组质粒为...猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2(开放阅读框2)基因编码其核衣壳蛋白,它含有导致病毒致病性的多个抗原决定簇位点。根据ORF2基因序列设计特异性引物,以感染PCV-2的Dulac细胞冻融上清为模板,克隆该开放阅读框的全基因序列。然后以该重组质粒为模板,选择其异于PCV-1的保守序列,设计PCR引物,采用两步法,建立了检测PCV-2快速简捷的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。多次试验证明,该方法具有良好的重复性。同时针对与PCV-2共感染的其它病毒进行特异性检测,进一步证明该方法可以快速、特异、灵敏地检测PCV-2。展开更多
根据Gen Bank中柱状黄杆菌16S r RNA序列,设计1对特异性引物,PCR扩增获得16S r RNA基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了黄杆菌的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法 ,以...根据Gen Bank中柱状黄杆菌16S r RNA序列,设计1对特异性引物,PCR扩增获得16S r RNA基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了黄杆菌的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法 ,以此为基础研制试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、迟缓爱德华、弗氏柠檬酸杆菌均无阳性信号扩增,重复性好,灵敏度可达12拷贝/μL。结果表明,研制的柱状黄杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等特征,适合于大鲵临床样品的检测。展开更多
根据GenBank猪细小病毒(PPV)的NS1基因序列,设计一对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立实时定量PCR检测方法,构建了检测PPV的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准质粒DNA模板在7.8×101～7.8×108拷贝/μl浓度范围...根据GenBank猪细小病毒(PPV)的NS1基因序列,设计一对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立实时定量PCR检测方法,构建了检测PPV的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准质粒DNA模板在7.8×101～7.8×108拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997。该方法用于猪细小病毒的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪细小病毒的快速检测。展开更多
文摘为了建立转基因产品新型检测技术,采用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术和三对特异引物,检测抗虫转基因水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)。结果表明,利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到转Cry1Ab/c基因抗虫水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)扩增所产生的荧光信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体。SYBR Green Ⅰ实时PCR技术是转基因成分检测的一种新方法。
文摘本研究根据赤羽病毒(AKAV)的S基因序列设计合成了引物,RT-PCR扩增得到目的基因片段并克隆到PGM-T载体得到质粒标准品。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测AKAV的方法。该方法的检测敏感性达到926拷贝/25μL,并具有较好的重复性和特异性。本试验方法的建立对于加强进出口牛AKAV的检验检疫具有十分重要的意义。
文摘猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2(开放阅读框2)基因编码其核衣壳蛋白,它含有导致病毒致病性的多个抗原决定簇位点。根据ORF2基因序列设计特异性引物,以感染PCV-2的Dulac细胞冻融上清为模板,克隆该开放阅读框的全基因序列。然后以该重组质粒为模板,选择其异于PCV-1的保守序列,设计PCR引物,采用两步法,建立了检测PCV-2快速简捷的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。多次试验证明,该方法具有良好的重复性。同时针对与PCV-2共感染的其它病毒进行特异性检测,进一步证明该方法可以快速、特异、灵敏地检测PCV-2。
文摘根据Gen Bank中柱状黄杆菌16S r RNA序列,设计1对特异性引物,PCR扩增获得16S r RNA基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了黄杆菌的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法 ,以此为基础研制试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、迟缓爱德华、弗氏柠檬酸杆菌均无阳性信号扩增,重复性好,灵敏度可达12拷贝/μL。结果表明,研制的柱状黄杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等特征,适合于大鲵临床样品的检测。
文摘根据GenBank猪细小病毒(PPV)的NS1基因序列,设计一对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立实时定量PCR检测方法,构建了检测PPV的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准质粒DNA模板在7.8×101～7.8×108拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997。该方法用于猪细小病毒的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪细小病毒的快速检测。
