A型牛轮状病毒(BRV-A)是引起牛腹泻的重要病原之一,对养牛业危害最大。为建立一种针对BRV-A的快速、高通量、低成本检测方法,根据BRV-A的VP6基因保守区设计特异性引物,建立了检测BRV-A的SYBR Green I RT-qPCR方法。该方法对浓度梯度为4....A型牛轮状病毒(BRV-A)是引起牛腹泻的重要病原之一,对养牛业危害最大。为建立一种针对BRV-A的快速、高通量、低成本检测方法,根据BRV-A的VP6基因保守区设计特异性引物,建立了检测BRV-A的SYBR Green I RT-qPCR方法。该方法对浓度梯度为4.41×10^(8)~4.41×10^(2) copies/μL质粒标准品的扩增Ct值与拷贝数浓度呈良好的线性关系,熔解曲线为单峰;与其他引起牛腹泻的常见病原无交叉反应,最低检测限为4.41×10^(1) copies/μL,批内、批间重复性试验Ct值变异系数均低于1%;对临床粪便样品的阳性检出率高于地方标准中的PCR方法,且检测结果符合性较好。综上,本研究建立的BRV-A SYBR Green I RT-qPCR检测方法灵敏、特异、稳定,且操作简单、成本低,为临床样品的大规模BRV-A检测及其感染的早期诊断提供了技术支撑。展开更多
为建立牛副流感病毒5型(BPIV5)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增BPIV5 L基因的保守片段,构建重组质粒p MD18-T-BPIV5,并经PCR、双酶切与测序鉴定正确后作为标准品,经各反应条件优化后初步建立检测BPIV5的qPCR...为建立牛副流感病毒5型(BPIV5)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增BPIV5 L基因的保守片段,构建重组质粒p MD18-T-BPIV5,并经PCR、双酶切与测序鉴定正确后作为标准品,经各反应条件优化后初步建立检测BPIV5的qPCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品作为模板,利用优化的qPCR扩增,建立该方法的标准曲线,结果显示,重组质粒标准品的拷贝数与其Ct值呈良好的线性关系,相关系数为0.998,扩增效率为1.09。以BPIV5、牛肠道病毒(BEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺如病毒(BNOV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛冠状病毒(BCOV)的cDNA作为模板,采用该qPCR扩增,评估该方法的特异性;以10倍倍比稀释的重组质粒标准品pMD18-T-BPIV5作为模板,利用本研究建立的qPCR方法扩增,评估该方法的敏感性;以3种不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的qPCR方法在同一时间和不同时间分别进行批内和批间重复性试验。结果显示,该方法仅能特异性扩增BPIV5,其他相关病毒均为阴性结果;对质粒标准品的检测限为6.43拷贝/μL;批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。利用该方法和已发表的qPCR方法分别检测采自内蒙古东部部分牛场的80份鼻拭子样品,结果显示,两种方法对样品的阳性检测率均为10%(8/80),阴性样品的检测率均为90%(72/80),二者的阳性符合率和总符合率均达100%。本研究建立的检测BPIV5的qPCR方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,可以用于临床样品的检测,为BPIV5的检测和流行病学调查提供了一种新的检测手段。展开更多
为建立检测禽流感病毒(AIV)的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞,收集感染6、12、24、48、72 h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基...为建立检测禽流感病毒(AIV)的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞,收集感染6、12、24、48、72 h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基因进行检测,试图建立快速检测AIV的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,并与普通RT-PCR方法和传统的病毒滴定方法进行比较。结果表明:此次建立的检测AIV的SYBRGreen I荧光RT-PCR方法能检测到感染MDCK细胞后72 h的AIV,对169份泄殖腔拭子和咽喉拭子中的AIV检出率为5.33%(9/169),而普通RT-PCR方法检出率为6.51%(11/169),病毒滴定检出率为5.62(9/160)。对其他病毒(NDVI、BDVI、BV、VA)则未检测到,且整个检测过程只需4 h,表明该方法特异、准确、快速。展开更多
金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳...金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml。展开更多
目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性...目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。展开更多
为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、...为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×101拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。展开更多
目的建立荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法。方法提取虫体基因组DNA、根据GenBank中美洲钩虫ITS-2序列设计特异引物,PCR扩增ITS-2序列、克隆、测序和比对。常规PCR检验引物特异性。将ITS-2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌...目的建立荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法。方法提取虫体基因组DNA、根据GenBank中美洲钩虫ITS-2序列设计特异引物,PCR扩增ITS-2序列、克隆、测序和比对。常规PCR检验引物特异性。将ITS-2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做灵敏性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线的吸收峰单一,实验重复性良好。结论成功构建了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法,可用于快速、准确、定量检测美洲钩虫。展开更多
文摘A型牛轮状病毒(BRV-A)是引起牛腹泻的重要病原之一,对养牛业危害最大。为建立一种针对BRV-A的快速、高通量、低成本检测方法,根据BRV-A的VP6基因保守区设计特异性引物,建立了检测BRV-A的SYBR Green I RT-qPCR方法。该方法对浓度梯度为4.41×10^(8)~4.41×10^(2) copies/μL质粒标准品的扩增Ct值与拷贝数浓度呈良好的线性关系,熔解曲线为单峰;与其他引起牛腹泻的常见病原无交叉反应,最低检测限为4.41×10^(1) copies/μL,批内、批间重复性试验Ct值变异系数均低于1%;对临床粪便样品的阳性检出率高于地方标准中的PCR方法,且检测结果符合性较好。综上,本研究建立的BRV-A SYBR Green I RT-qPCR检测方法灵敏、特异、稳定,且操作简单、成本低,为临床样品的大规模BRV-A检测及其感染的早期诊断提供了技术支撑。
文摘为建立牛副流感病毒5型(BPIV5)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增BPIV5 L基因的保守片段,构建重组质粒p MD18-T-BPIV5,并经PCR、双酶切与测序鉴定正确后作为标准品,经各反应条件优化后初步建立检测BPIV5的qPCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品作为模板,利用优化的qPCR扩增,建立该方法的标准曲线,结果显示,重组质粒标准品的拷贝数与其Ct值呈良好的线性关系,相关系数为0.998,扩增效率为1.09。以BPIV5、牛肠道病毒(BEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺如病毒(BNOV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛冠状病毒(BCOV)的cDNA作为模板,采用该qPCR扩增,评估该方法的特异性;以10倍倍比稀释的重组质粒标准品pMD18-T-BPIV5作为模板,利用本研究建立的qPCR方法扩增,评估该方法的敏感性;以3种不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的qPCR方法在同一时间和不同时间分别进行批内和批间重复性试验。结果显示,该方法仅能特异性扩增BPIV5,其他相关病毒均为阴性结果;对质粒标准品的检测限为6.43拷贝/μL;批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。利用该方法和已发表的qPCR方法分别检测采自内蒙古东部部分牛场的80份鼻拭子样品,结果显示,两种方法对样品的阳性检测率均为10%(8/80),阴性样品的检测率均为90%(72/80),二者的阳性符合率和总符合率均达100%。本研究建立的检测BPIV5的qPCR方法特异性较强、敏感性较高、重复性较好,可以用于临床样品的检测,为BPIV5的检测和流行病学调查提供了一种新的检测手段。
文摘为建立检测禽流感病毒(AIV)的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞,收集感染6、12、24、48、72 h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基因进行检测,试图建立快速检测AIV的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,并与普通RT-PCR方法和传统的病毒滴定方法进行比较。结果表明:此次建立的检测AIV的SYBRGreen I荧光RT-PCR方法能检测到感染MDCK细胞后72 h的AIV,对169份泄殖腔拭子和咽喉拭子中的AIV检出率为5.33%(9/169),而普通RT-PCR方法检出率为6.51%(11/169),病毒滴定检出率为5.62(9/160)。对其他病毒(NDVI、BDVI、BV、VA)则未检测到,且整个检测过程只需4 h,表明该方法特异、准确、快速。
文摘金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml。
文摘目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。
文摘为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×101拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。
文摘目的建立荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法。方法提取虫体基因组DNA、根据GenBank中美洲钩虫ITS-2序列设计特异引物,PCR扩增ITS-2序列、克隆、测序和比对。常规PCR检验引物特异性。将ITS-2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做灵敏性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线的吸收峰单一,实验重复性良好。结论成功构建了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法,可用于快速、准确、定量检测美洲钩虫。
