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兔抗小鼠含SET结构域(赖氨酸甲基转移酶)8(Setd8)多克隆抗体制备和应用 被引量:8
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作者 马海涛 郭佳倩 +4 位作者 夏静 牛长敏 申雪沂 孙红亚 郑英 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期246-251,共6页
目的在大肠杆菌表达小鼠含SET结构域(赖氨酸甲基转移酶)8(Setd8)蛋白并制备兔抗Setd8多克隆抗体。方法将p GADT7-Setd8质粒和p ET-30a载体分别双酶切后连接、转化和鉴定,构建p ET-30a-Setd8原核表达质粒。将p ET-30a-Setd8质粒转化到E.c... 目的在大肠杆菌表达小鼠含SET结构域(赖氨酸甲基转移酶)8(Setd8)蛋白并制备兔抗Setd8多克隆抗体。方法将p GADT7-Setd8质粒和p ET-30a载体分别双酶切后连接、转化和鉴定,构建p ET-30a-Setd8原核表达质粒。将p ET-30a-Setd8质粒转化到E.coli BL21中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,通过镍亲和层析柱进行蛋白纯化。应用纯化的Setd8蛋白免疫新西兰大白兔,获得Setd8多克隆抗体。利用ELISA、Western blot法及免疫组织化学染色法对所得多克隆抗体进行效价测定及特异性鉴定。结果应用限制性内切酶双酶切后电泳及序列测定法,成功构建的p ET-30a-Setd8重组质粒在大肠杆菌中IPTG诱导下能够高效表达重组Setd8蛋白。免疫获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶1 000 000,Western blot法结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别细胞和组织中的Setd8蛋白,免疫组织化学染色法显示多克隆抗体识别的Setd8主要表达于成年小鼠睾丸组织中的精原细胞。结论成功获得较高纯度Setd8蛋白,制备的Setd8多克隆抗体具有较高反应性和特异性。 展开更多
关键词 setd8 多克隆抗体 鉴定
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SET7对Ang Ⅱ介导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及其机制 被引量:1
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作者 马会军 《中南大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期135-141,共7页
目的:沉默含SET结构域赖氨酸甲基转移酶7(SET domain containing lysine methyltransferase 7,SET7)基因可改善缺血再灌注介导的心肌组织损伤,但是SET7对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)介导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响... 目的:沉默含SET结构域赖氨酸甲基转移酶7(SET domain containing lysine methyltransferase 7,SET7)基因可改善缺血再灌注介导的心肌组织损伤,但是SET7对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)介导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响尚不明确。本研究旨在探讨SET7对心肌成纤维细胞增殖以及胶原合成的影响及其可能机制。方法:分离心肌成纤维细胞,采用免疫荧光法鉴定心肌成纤维细胞。将心肌成纤维细胞随机分为4组:对照组,正常培养细胞;Ang Ⅱ组,给予100 nmol/L Ang Ⅱ处理细胞24 h;siCtrl组,细胞转染siCtrl后给予100 nmol/L的Ang Ⅱ处理24 h;siSET7组,细胞转染siSET7后给予100 nmol/L的Ang Ⅱ处理24 h。采用CCK-8法和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)法检测细胞增殖情况;real-time PCR检测SET7、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)mRNA的表达;蛋白质印迹法检测SET7、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、音猬因子(sonic hedgehog,Shh)、跨膜蛋白patched1(Ptch1)、胶质瘤相关癌基因1(glioma-associated oncogene homolog 1,Gli1)和α-SMA蛋白质的表达。结果:在荧光显微镜下可见vimentin染色呈阳性,心肌成纤维细胞状态良好。与对照组比较,Ang Ⅱ组SET7 mRNA和蛋白质表达水平均显著上调,细胞增殖率和EdU荧光强度显著增加,collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和α-SMA mRNA和蛋白质表达水平显著上调(均P<0.05);与siCtrl组比较,siSET7组SET7 mRNA表达水平显著下调,细胞增殖率和EdU荧光强度显著下降,collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和α-SMA mRNA和蛋白质表达水平显著下调(均P<0.05)。结论:沉默SET7基因可抑制Ang Ⅱ介导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成,Shh信号通路可能参与这一过程。 展开更多
关键词 set结构域赖氨酸甲基转移酶7 心肌成纤维细胞 细胞增殖 sonic hedgehog信号通路
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组蛋白甲基化转移酶SETD4对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响 被引量:1
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作者 封慕茵 郑阿秀 +4 位作者 白建荣 曾玉梅 罗泊涛 申志华 揭伟 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期259-268,共10页
目的:明确组蛋白甲基化转移酶含SET结构域蛋白4 (SET-domain-containing protein 4, SETD4)在临床鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)组织中的表达,分析SETD4对NPC细胞增殖和迁移的影响。方法:采用免疫组织化学法检测86例临床NPC标... 目的:明确组蛋白甲基化转移酶含SET结构域蛋白4 (SET-domain-containing protein 4, SETD4)在临床鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)组织中的表达,分析SETD4对NPC细胞增殖和迁移的影响。方法:采用免疫组织化学法检测86例临床NPC标本与对照组30例鼻咽黏膜慢性炎症(nasopharyngeal chronic inflammation,NPI)组织中SETD4蛋白的表达;基于CRISPR/Cas9技术敲除CNE2细胞中SETD4基因,DNA测序结合半定量RTPCR进行鉴定;以SETD4敲除前后的CNE2细胞为研究对象,于倒置显微镜下观察细胞形态,采用CCK-8实验分析细胞增殖活性、Transwell实验观察细胞迁移能力变化、Western blot检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞周期相关蛋白、上皮-间充质转化标志物和组蛋白赖氨酸甲基化的变化,并通过生物信息学富集SETD4相关联的功能和信号通路。结果:SETD4蛋白主要定位于NPC细胞核中,NPC组织中SETD4阳性表达率显著低于NPI对照组(P<0.01)。基于CRISPR/Cas9技术成功敲除了CNE2细胞的SETD4基因,获得基因敲除的纯合子细胞。与野生型(wild-type, WT)细胞株相比,SETD4敲除(knockout, KO)细胞株呈现更明显的梭形和多角形,增殖活性和迁移能力均显著增加(P<0.01),E-cadherin和p21蛋白表达显著下调(P<0.05),而cyclin D1、cyclin E1、Ncadherin和vimentin蛋白表达则显著上调(P<0.05)。此外,与WT组相比,SETD4KO组细胞中H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K27me3、H3K79me2和H4K20me2水平显著降低(P<0.05)。基因集富集结果显示,SETD4与细胞周期的功能和信号通路相关。结论:临床NPC组织中SETD4蛋白的表达减弱或缺失;SETD4表达减弱通过上调细胞周期相关蛋白促进NPC细胞增殖,通过诱导上皮-间充质转化而促进细胞迁移;SETD4影响NPC细胞中H3K4、H3K9、H3K27、H3K79和H4K20多个位点的甲基化。 展开更多
关键词 鼻咽癌 组蛋白甲基转移酶 set结构域蛋白4 细胞增殖 细胞迁移 基因集富集
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SMYD2对心脏成纤维细胞的增殖和胶原合成的影响 被引量:2
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作者 孙雪林 张亚同 +4 位作者 陈頔 朱愿超 梁良 赵紫楠 胡欣 《中国心血管杂志》 2020年第2期175-179,共5页
目的探讨组蛋白甲基转移酶SMYD2对心脏成纤维细胞(CFs)的增殖和胶原合成的影响。方法体外分离培养CFs,通过转染SMYD2干扰RNA(siRNA),在CFs中降低SMYD2的表达,利用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理各组细胞,检测以下指标:(1)噻唑蓝(MTT)法检测CF... 目的探讨组蛋白甲基转移酶SMYD2对心脏成纤维细胞(CFs)的增殖和胶原合成的影响。方法体外分离培养CFs,通过转染SMYD2干扰RNA(siRNA),在CFs中降低SMYD2的表达,利用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理各组细胞,检测以下指标:(1)噻唑蓝(MTT)法检测CFs增殖;(2)Western Blot和qPCR检测SMYD2、促进转化生长因子β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原等指标的表达。 展开更多
关键词 组蛋白甲基转移酶 SMYD2 成纤维细胞 胶原 细胞增殖
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