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弓形虫SAG1单基因疫苗与SAG1-ROP2复合基因疫苗的免疫效果观察 被引量:15
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作者 杨婷婷 何深一 +5 位作者 张加勤 周怀瑜 丛华 古钦民 李瑛 赵群力 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第5期410-413,共4页
目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ... 目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ、IL4;流式细胞仪测定T细胞亚群;弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。结果获得pcDNA3.1SAG1、pcDNA3.1SAG1ROP2重组质粒;pcDNA3.1SAG1ROP2组小鼠IgG抗体(P<0.05)、IFNγ(P<0.01)及CD8+细胞比例(P<0.05)均高于pcDNA3.1SAG1组;实验组组均未测到IL4;复合基因组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫不同生活阶段的抗原基因复合疫苗较单基因疫苗具有更好的免疫保护性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 ROP2 复合基因 DNA疫苗 流式细胞术
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弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白的高效表达及免疫活性分析 被引量:9
2
作者 聂福旭 蒋蔚 +2 位作者 王权 陈永军 胡永浩 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期173-178,共6页
在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白,并对其免疫活性进行分析。应用PCR技术从刚地弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码SAG2的基因片段,亚克隆至原核表达载体pET32a(+),在大肠埃希菌(E.coli)BL21内表达,并对其表达... 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白,并对其免疫活性进行分析。应用PCR技术从刚地弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码SAG2的基因片段,亚克隆至原核表达载体pET32a(+),在大肠埃希菌(E.coli)BL21内表达,并对其表达条件进行优化,Western blotting和ELISA分析纯化蛋白的免疫原性;纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗,用间接免疫荧光试验(IFA)分析表达蛋白的免疫反应性。成功构建重组质粒pET32a(+)-tSAG2,所表达的融合蛋白大小约为38kD。在IPTG终浓度为0.1mmol/L、诱导时间4-6h和培养温度32℃条件下,重组SAG2蛋白主要以可溶性形式在大肠杆菌中高效表达,每升培养菌液约获得可溶性重组SAG2蛋白16mg。Western blotting及ELISA结果显示纯化蛋白具有良好的免疫原性。IFA显示重组蛋白的抗血清能够识别刚地弓形虫表面的SAG2天然蛋白,所表达蛋白具有良好的免疫反应性。截断的SAG2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白保持了天然蛋白的免疫活性,为进一步利用该重组蛋白进行弓形虫病免疫诊断及基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 sag2 蛋白表达 免疫活性
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截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定 被引量:14
3
作者 言慧 李华 +2 位作者 周晓红 吴昆 陈晓光 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2004年第4期412-414,共3页
目的在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段,并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法利用NcoⅠ、HindⅢ双酶切,从本室建立的pET-30a(+)-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段,并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET... 目的在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段,并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法利用NcoⅠ、HindⅢ双酶切,从本室建立的pET-30a(+)-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段,并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中,构建表达重组质粒pET-32a(+)-trSAG1。将重组质粒转入E.coliBL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni-NTA agarose纯化后, Western-blotting分析其免疫反应性。结果成功构建重组质粒pET-32a(+)-trSAG1 ,通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白,相对分子质量40 000,Western-blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性,ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段,表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别,有望成为一种有价值的诊断抗原。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1抗原 大肠杆菌 可溶性 表达 纯化 免疫反应性鉴定
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弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1在大肠杆菌中表达的初步研究 被引量:11
4
作者 陈海峰 陈观今 +2 位作者 郭虹 郑焕钦 王又红 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第2期8-10,共3页
目的 构建含弓形虫主要表面抗原基因SAG1和棒状体蛋白ROP1复合基因重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达 ,检测复合基因表达产物的免疫活性。方法 用亚克隆技术分别把SAG1与ROP1基因克隆至 pET2 8aRT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细... 目的 构建含弓形虫主要表面抗原基因SAG1和棒状体蛋白ROP1复合基因重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达 ,检测复合基因表达产物的免疫活性。方法 用亚克隆技术分别把SAG1与ROP1基因克隆至 pET2 8aRT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE及Western -Blot分析。结果 获得pET2 8-SAG1/ROP1重组表达载体 ;SDS -PAGE及Western -Blot印迹显示SAG1/ROP1复合基因表达蛋白产物分子量约为 6 6kD ,具有一定的免疫活性。结论 弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1可在大肠杆菌中表达 ,表达产物具有免疫活性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 ROP1 基因表达 抗原基因 大肠杆菌
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弓形虫表面抗原SAG2基因片段的克隆与原核表达 被引量:7
5
作者 龙彩虹 吴少庭 +4 位作者 翁亚彪 高世同 张仁利 林敏 周爱琴 《中国人兽共患病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期42-45,共4页
目的 扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法 设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX... 目的 扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法 设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX - 4T - 2 ,经PCR和双酶切筛选 ,测序验证后 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并用SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果 从弓形虫核酸提取物中扩增出约 477bp的SAG2基因 ,构建成功了重组质粒 pGEX - 4T - 2 -SAG2 ;SAG2基因在大肠杆菌中得到高效表达。SDS -PAGE电泳 pGEX - 4T - 2 -SAG2的融合蛋白条带的分子量约为 42kD ,Westen -blot显示融合蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论 GST融合表达载体的构建和SAG2基因片段成功表达 ,为进一步为SAG2重组疫苗及重组诊断抗原的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫表面抗原 sag2基因片段 克隆 原核表达 免疫印迹
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弓形虫SAG1的高密度发酵表达、纯化及免疫反应性鉴定 被引量:2
6
作者 李华 言慧 +2 位作者 陈白虹 刘敏 陈晓光 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期1180-1183,共4页
目的探讨弓形虫SAG1在大肠杆菌中的高密度发酵表达及其批量制备流程。方法利用高密度发酵大肠杆菌批量表达rSAG1,经Ni-NTA、SephadexG-75及切胶等纯化工艺对重组蛋白进行纯化,用Westernblotting鉴定其免疫反应性,ELISA验证rSAG1检测弓... 目的探讨弓形虫SAG1在大肠杆菌中的高密度发酵表达及其批量制备流程。方法利用高密度发酵大肠杆菌批量表达rSAG1,经Ni-NTA、SephadexG-75及切胶等纯化工艺对重组蛋白进行纯化,用Westernblotting鉴定其免疫反应性,ELISA验证rSAG1检测弓形虫抗体的敏感性与特异性。结果高密度发酵诱导4h后工程菌液的OD600达到20.21;平均每升发酵液可收获工程菌26.10g;目标蛋白的表达量占菌体蛋白的25.82%;经Ni-NTA、Ni-NTA联合SephadexG-75及Ni-NTA联合切胶纯化的rSAG1蛋白纯度分别为72.36%、98.54%和97.39%;Westernblotting结果显示联合纯化的rSAG1与弓形虫免疫兔血清呈单一反应条带,与正常兔血清未出现反应带;Ni-NTA联合Sephadex-G75纯化的rSAG1对25例感染小鼠血清和38例抗体阳性患者血清的检出率分别为96%和94.7%。结论利用高密度发酵技术高效表达、Ni-NTA联合SephadexG-75纯化的rSAG1具有较高纯度和良好的免疫反应性,该工艺可以用于rSAG1抗原的批量生产。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 发酵 表达 纯化
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柔嫩艾美耳球虫SAG2基因的克隆及其在卡介苗中表达 被引量:6
7
作者 曹利利 姚新华 +4 位作者 郭衍冰 王英贺 任科研 魏峰 苑淑贤 《动物医学进展》 北大核心 2015年第9期13-17,共5页
为获得柔嫩艾美耳球虫SAG2的克隆株并在卡介苗中表达该蛋白,根据柔嫩艾美耳球虫SAG2基因序列和表达载体图谱设计特异性引物,引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,RT-PCR扩增SAG2基因,连接到pMD18-T载体。双酶切后,将SAG2基因插入到大肠埃希菌-... 为获得柔嫩艾美耳球虫SAG2的克隆株并在卡介苗中表达该蛋白,根据柔嫩艾美耳球虫SAG2基因序列和表达载体图谱设计特异性引物,引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,RT-PCR扩增SAG2基因,连接到pMD18-T载体。双酶切后,将SAG2基因插入到大肠埃希菌-分支杆菌整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pMV361-SAG2,经电穿孔转染到卡介苗中,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析。结果成功构建了重组质粒pMD18-T-SAG2和pMV361-SAG2,SAG2在卡介苗中高效表达,表达产物能够被柔嫩艾美耳球虫阳性血清识别,表明具有良好的免疫原性,为下一步重组卡介苗对鸡球虫病的免疫保护研究奠定了基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 sag2基因 卡介苗 表达
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弓形虫SAG1和GRA4基因的原核表达及其重组猫疱疹病毒Ⅰ型转移载体的构建 被引量:5
8
作者 高洋 程子英 +3 位作者 王铭 郑君 贾洪林 鲁承 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期886-890,共5页
为构建表达弓形虫抗原的重组猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)转移载体,本研究以pBluesciptⅡ-SK(-)为骨架载体,分别插入FHV-1 TK基因的5'(2 000 bp)和3'(1 700 bp)同源臂、pCAGGs载体中含有启动子和终止信号的表达盒以及弓形虫RH株SAG1或... 为构建表达弓形虫抗原的重组猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)转移载体,本研究以pBluesciptⅡ-SK(-)为骨架载体,分别插入FHV-1 TK基因的5'(2 000 bp)和3'(1 700 bp)同源臂、pCAGGs载体中含有启动子和终止信号的表达盒以及弓形虫RH株SAG1或GRA4基因,构建重组FHV-1的转移载体pBS-TK-SAG1和pBS-TK-GRA4。将其分别转染于293T细胞,通过原核细胞表达的截短SAG1和GRA4重组蛋白制备的鼠多克隆抗体进行western blot鉴定。结果显示,制备的弓形虫SAG1和GRA4多克隆抗体能够特异性识别重组表达和虫体表达的天然的SAG1和GRA4两种弓形虫蛋白,分子量一致,分别为35 ku和45 ku。本研究为表达弓形虫RH株SAG1和GRA4基因的猫重组疱疹病毒Ⅰ型载体疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 GRA4 猫疱疹病毒I型 转移载体
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柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因的克隆与序列分析 被引量:5
9
作者 曹利利 姚新华 +2 位作者 侯洪烈 苑淑贤 任科研 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第12期115-120,共6页
根据已发表的柔嫩艾美耳球虫(Houghton株)基因序列,设计一对特异性引物,通过RT-PCR扩增柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因,将扩增的片段连入pMD18T载体,筛选阳性克隆进行测序和序列分析。结果表明,成功克隆了柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因,... 根据已发表的柔嫩艾美耳球虫(Houghton株)基因序列,设计一对特异性引物,通过RT-PCR扩增柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因,将扩增的片段连入pMD18T载体,筛选阳性克隆进行测序和序列分析。结果表明,成功克隆了柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因,测得ORF全长813bp;与GenBank中收录的Houghton株柔嫩艾美耳球虫的SAG2基因序列相比,有4个碱基发生变异,两者的核苷酸序列同源性为99.50%;柔嫩艾美耳球虫长春株SAG2基因的推导氨基酸序列同源性为99.63%,其中,A185G变异导致了编码氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸(E62G),A247T变异导致了编码氨基酸由蛋氨酸变为亮氨酸(M83L),而其他核苷酸的突变为无义突变;SAG2抗原的N端和C端疏水性较强,并且N端前23个氨基酸为跨膜信号肽区,而中间有许多亲水性区域,且显示很强的抗原性。柔嫩艾美耳球虫长春株与Houghton株的SAG2基因编码蛋白相似性很高,具有很强的抗原性,可以作为球虫疫苗的候选抗原来进一步研究。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫长春株 sag2基因 克隆 序列分析
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弓形虫SAG1基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测 被引量:7
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作者 陈晓光 杨培梁 +2 位作者 李华 龚娅 冯明钊 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2001年第8期561-564,共4页
目的 在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染。方法 将截短的SAG1基因经PCR扩增后,定向亚克隆入原核表达载体pET-30a(+),酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确,将重组质粒转化大肠杆菌BL2... 目的 在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染。方法 将截短的SAG1基因经PCR扩增后,定向亚克隆入原核表达载体pET-30a(+),酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达, 对融合的表达产物进行纯化和复性,通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性。结果 成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31.58%。经过简易的纯化和复性过程,该重组抗原(rSAG1)能被弓形虫感染的人血清所识别。用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性。结论 截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化和复性后,能有效检测弓形虫的感染,可用于构建弓形虫病检测试剂盒。 展开更多
关键词 弓形虫感染 基因表达 寄生虫学 大肠杆菌 重组抗原 sag1基因
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弓形虫表面抗原SAG1 DNA疫苗的构建 被引量:4
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作者 黄达娜 吴少庭 +6 位作者 袁仕善 高世同 张仁利 雷明军 潘晖榕 林琦萍 秦莉 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第2期128-131,共4页
目的 构建真核重组表达质粒 pVAX1-SAG1,并探讨其诱导的体液免疫应答。 方法 采用多聚酶链反应技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断 ,并克隆至载体pMD18-T ,经菌落PCR鉴定和测序分析后 ,亚克隆至真核表达载体 pVA... 目的 构建真核重组表达质粒 pVAX1-SAG1,并探讨其诱导的体液免疫应答。 方法 采用多聚酶链反应技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断 ,并克隆至载体pMD18-T ,经菌落PCR鉴定和测序分析后 ,亚克隆至真核表达载体 pVAX1,构建重组真核表达质粒pVAX1-SAG1,并予菌落PCR和双酶切鉴定。以此为疫苗候选分子免疫小鼠 ,检测其诱导产生的抗体。结果 PCR扩增出SAG1基因的截短型片段 ,其大小约 780bp ;测序的阳性TA克隆除两处发生同义突变外 ,其余序列与原序列一致 ;TA克隆的插入片段被亚克隆到真核表达载体 pVAX1,构建了重组表达质粒pVAX1-SAG1;该质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。 结论 成功构建了弓形虫表面抗原SAG1的DNA疫苗。 展开更多
关键词 弓形虫 表面抗原 sag1 DNA疫苗 免疫应答 多聚酶链反应技术
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应用核酸原位分子杂交法检测弓形虫SAG1抗原基因在免疫小鼠体内的表达 被引量:5
12
作者 陈海峰 陈观今 +2 位作者 王又红 郑焕钦 郭虹 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第3期13-15,共3页
PCR扩增RH株弓形虫抗原基因SAG1编码序列 ,构建pcDNA3 -SAG1重组表达质粒。DNA免疫接种小鼠 ,3周后处死动物 ,取注射部位肌肉作冰冻切片 ,用原位分子杂交方法检测弓形虫 pcDNA3 -SAG1重组质粒在免疫小鼠肌肉内的表达。结果PCR扩增出SAG... PCR扩增RH株弓形虫抗原基因SAG1编码序列 ,构建pcDNA3 -SAG1重组表达质粒。DNA免疫接种小鼠 ,3周后处死动物 ,取注射部位肌肉作冰冻切片 ,用原位分子杂交方法检测弓形虫 pcDNA3 -SAG1重组质粒在免疫小鼠肌肉内的表达。结果PCR扩增出SAG1编码区目的基因 ,片段大小为 10 2 0bp。测序、酶切分析表明构建的 pcDNA3 -SAG1重组表达质粒含有扩增的基因。利用原位分子杂交在免疫接种 pcDNA3-SAG1的小鼠骨骼肌中检测到紫蓝色的阳性杂交信号 ,提示局部肌肉有目的基因mRNA转录的发生。 展开更多
关键词 弓形虫 基因免疫 sag1抗原 原位分子杂交 PCR DNA免疫
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弓形虫表面抗原蛋白基因SAG1在骨骼肌中的表达 被引量:5
13
作者 陈海峰 陈观今 +2 位作者 王又红 郑焕钦 郭虹 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第6期89-91,共3页
构建弓形虫速殖子表面抗原蛋白SAG1的真核表达载体 ,直接注入小鼠骨骼肌 ,观察该基因的表达程度和表达定位 ,研究利用骨骼肌异源表达SAG1,探讨发展一种简易、有效和安全的基因免疫途径的可能性。免疫组化结果显示 ,直接肌肉注射重组真... 构建弓形虫速殖子表面抗原蛋白SAG1的真核表达载体 ,直接注入小鼠骨骼肌 ,观察该基因的表达程度和表达定位 ,研究利用骨骼肌异源表达SAG1,探讨发展一种简易、有效和安全的基因免疫途径的可能性。免疫组化结果显示 ,直接肌肉注射重组真核表达载体pcDAN3-SAG1可使SAG1在免疫小鼠骨骼肌中表达 。 展开更多
关键词 弓形虫 表面抗原蛋白 免疫组织化学 sag1 骨骼肌
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弓形虫SAG2基因体外扩增、克隆及在耻垢分支杆菌中的表达 被引量:2
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作者 李俊华 吴少庭 +2 位作者 翁亚彪 甘燕 刘洪波 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期124-127,共4页
目的体外扩增弓形虫RH株表面抗原2(SAG2)基因,并构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒ps3000-SAG2,构建重组耻垢分支杆菌,免疫接种小鼠,通过检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体,证明SAG2重组蛋白在耻垢分支杆菌中有表达。方法采用聚合酶链式反应(... 目的体外扩增弓形虫RH株表面抗原2(SAG2)基因,并构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒ps3000-SAG2,构建重组耻垢分支杆菌,免疫接种小鼠,通过检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体,证明SAG2重组蛋白在耻垢分支杆菌中有表达。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增弓形虫RH株的SAG2基因,克隆入pGEMT载体,然后构建亚克隆ps3000-SAG2大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将SAG2基因的穿梭质粒转化到耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatismc2155)中,用重组耻垢分支杆菌免疫小鼠,Western-blotting方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的SAG2基因;正确构建穿梭质粒ps3000-SAG2,免疫印迹分析,免疫小鼠血清能所识别SAG2重组蛋白。结论耻垢分支杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白SAG2,具有抗原性,刺激小鼠机体产生出了抗弓形虫的抗体,为下一步弓形虫重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫 sag2 耻垢分支杆菌 BCG
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减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达弓形虫SAG1基因 被引量:3
15
作者 曲道峰 王素华 +1 位作者 蔡渭明 杜爱芳 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期188-192,共5页
将PCR扩增获得的弓形虫SAG1基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建成pcDNA3-SAG1真核表达质粒,高压电转化入dam和phoP基因双突变的减毒沙门氏菌(ZJ111株)中,并直接转染Vero细胞,胰酶消化、收集细胞,SDS-PAGE和western blot可检测到30ku... 将PCR扩增获得的弓形虫SAG1基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建成pcDNA3-SAG1真核表达质粒,高压电转化入dam和phoP基因双突变的减毒沙门氏菌(ZJ111株)中,并直接转染Vero细胞,胰酶消化、收集细胞,SDS-PAGE和western blot可检测到30ku左右的蛋白条带和印迹带。结果表明减毒沙门氏菌能将外源基因呈递给Vero细胞并进行表达。 展开更多
关键词 sag1基因 PCDNA3.1 真核表达 VERO细胞
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小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体 被引量:1
16
作者 武楠 周丹秋 +2 位作者 阮卫 吴丽桂 张慧涨 《复旦学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期184-188,共5页
目的制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,用于早期弓形虫感染的抗原检测。方法用弓形虫RH株重组抗原SAG1进行常规免疫结合小鼠脾内免疫,杂交瘤技术制备单克隆抗体。ELISA法筛选阳性克隆,经亚克隆建株。诱生腹水法制备抗体,protein-... 目的制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,用于早期弓形虫感染的抗原检测。方法用弓形虫RH株重组抗原SAG1进行常规免疫结合小鼠脾内免疫,杂交瘤技术制备单克隆抗体。ELISA法筛选阳性克隆,经亚克隆建株。诱生腹水法制备抗体,protein-G亲合层析法进行纯化,测定其亚类、效价;Westernblot法分析其特异性;夹心-ELISA法检测抗体的敏感性及特异性;检测弓形虫感染小鼠血液循环抗原,同时用PCR法检测弓形虫B1基因并比较结果。结果获得2株抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体3B6、10C4,抗体均为IgG1,轻链均为κ链,Western blot显示2株单抗均能识别弓形虫天然的和重组的SAG1抗原。3B6、10C4敏感度分别为31.3ng和62.5ng,与血吸虫病、钩虫病及疟疾患者血清均无交叉反应。弓形虫早期感染检测PCR及ELISA法阳性检出率分别为63.2%、47.4%。结论成功制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,初步用于早期弓形虫感染诊断。 展开更多
关键词 重组sag1抗原 脾内免疫 单克隆抗体 夹心-ELISA 小鼠
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弓形虫表面抗原SAG1基因自杀性DNA疫苗的构建及免疫原性检测 被引量:1
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作者 郑丽娜 谭峰 潘长旺 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期885-888,892,共5页
目的构建表达弓形虫表面抗原SAG1的自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1并检测其免疫原性。方法以弓形虫RH株基因组DNA为模板,PCR扩增SAG1基因(GenBank No.HM776940.1),克隆至甲病毒复制子载体pDREP-eGFP中替换原有的eGFP基因,菌液PCR、双酶切及测... 目的构建表达弓形虫表面抗原SAG1的自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1并检测其免疫原性。方法以弓形虫RH株基因组DNA为模板,PCR扩增SAG1基因(GenBank No.HM776940.1),克隆至甲病毒复制子载体pDREP-eGFP中替换原有的eGFP基因,菌液PCR、双酶切及测序鉴定重组质粒。重组的自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1经股四头肌注射并联合瞬时电穿孔免疫BALB/c小鼠,同时以原质粒pDREP-eGFP作为对照组,间隔3周后以相同条件再免疫1次,收集小鼠血清,以弓形虫裂解抗原Western blotting检测其诱导产生的特异性抗体。结果从弓形虫基因组中PCR扩增得到1 011bp长度的SAG1基因,成功构建重组质粒pDREP-SAG1。Western blotting结果显示,重组质粒免疫的小鼠血清能特异性地识别虫体抗原中的SAG1抗原。结论成功构建了弓形虫自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1,能诱导小鼠产生特异性的抗体,具有免疫原性。 展开更多
关键词 弓形虫 sag1 自杀性DNA疫苗
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弓形虫截短SAG2基因的克隆表达与免疫活性分析 被引量:1
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作者 赵东岳 陈金锋 韦剑辉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2258-2263,共6页
构建截短的弓形虫表面抗原2(SAG2)原核表达系统,并探讨其抗原活性。PCR扩增去掉信号肽和C-末端的SAG2基因片段,插入原核表达载体pGEX-4T-3后转化到大肠杆菌DH5α,并用IPTG诱导。SDS-PAGE和Western blot鉴定重组SAG2t的表达及其免疫反应... 构建截短的弓形虫表面抗原2(SAG2)原核表达系统,并探讨其抗原活性。PCR扩增去掉信号肽和C-末端的SAG2基因片段,插入原核表达载体pGEX-4T-3后转化到大肠杆菌DH5α,并用IPTG诱导。SDS-PAGE和Western blot鉴定重组SAG2t的表达及其免疫反应原性。每升菌液约纯化出4mg rSAG2t蛋白;Western blot显示,ME49株感染的鼠血清和rSAG2t免疫的鼠血清均可强烈识别表达的截短SAG2蛋白。原核表达体系实现了截短的SAG2蛋白的可溶性表达,并具有良好的完全抗原活性。 展开更多
关键词 弓形虫RH株/ME49株 免疫印记 截短sag2基因
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柔嫩艾美尔球虫SAG_2基因重组卡介苗的抗球虫保护效果 被引量:2
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作者 郭衍冰 曹利利 +2 位作者 姚新华 任科研 苑淑贤 《吉林畜牧兽医》 2015年第2期22-25,共4页
本研究旨在通过动物试验,按设计以滴鼻、口服和颈部皮下注射的方式,将已构建的含有柔嫩艾美尔球虫SAG_2基因的卡介苗pMV361-SAG_2免疫雏鸡,通过检测鸡体液及细胞免疫水平、卵囊数、相对增重率、抗球虫指数等指标,对所构建的重组卡介苗... 本研究旨在通过动物试验,按设计以滴鼻、口服和颈部皮下注射的方式,将已构建的含有柔嫩艾美尔球虫SAG_2基因的卡介苗pMV361-SAG_2免疫雏鸡,通过检测鸡体液及细胞免疫水平、卵囊数、相对增重率、抗球虫指数等指标,对所构建的重组卡介苗的保护效果进行综合评价。结果显示,在实验室条件下重组卡介苗pMV361-SAG_2具有增强鸡抵抗柔嫩艾美尔球虫的免疫保护功效,且以滴鼻的方式进行免疫时效果最佳。本研究为抗球虫疫苗的研究提供试验依据。 展开更多
关键词 sag2基因 重组卡介苗 免疫保护
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刚地弓形虫抗原基因SAG2的克隆、表达和纯化 被引量:1
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作者 黄燕 徐梅倩 +1 位作者 崔立 何国声 《中国兽医寄生虫病》 2007年第6期8-12,共5页
目的克隆刚地弓形虫抗原基因SAG2,并在大肠杆菌中进行高效表达及纯化。方法设计引物从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列,构建pGEX-4T-SAG2重组质粒,双酶切鉴定后,在大肠杆菌中进行表达,并对其表达条件进行优化,所表达蛋白用GST亲和层... 目的克隆刚地弓形虫抗原基因SAG2,并在大肠杆菌中进行高效表达及纯化。方法设计引物从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列,构建pGEX-4T-SAG2重组质粒,双酶切鉴定后,在大肠杆菌中进行表达,并对其表达条件进行优化,所表达蛋白用GST亲和层析柱进行纯化。结果经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白约为41KD。Western-blotting表明该蛋白能与兔抗弓形虫血清特异性结合。培养基2×YTA,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间3 h,培养温度30℃,摇瓶转速220 r/min是GST-SAG2融合蛋白表达的最佳条件,且得到的是可溶性融合蛋白GST-SAG2。结论得到高效表达的SAG2抗原蛋白,为建立弓形虫病快速免疫诊断试剂盒打下基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 sag2 基因表达 纯化
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