【目的】将改良版叠氮溴化丙锭(improved propidium monoazide,PMAxx)与微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术相结合,建立一种针对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)活菌的检测方法。【方法】对PMAxx终浓度...【目的】将改良版叠氮溴化丙锭(improved propidium monoazide,PMAxx)与微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术相结合,建立一种针对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)活菌的检测方法。【方法】对PMAxx终浓度、暗处理时间及曝光时间进行优化,建立最佳的PMAxx-ddPCR检测体系,并用不同体积比的LM活菌验证其准确性,考察PMAxx-ddPCR检测方法的特异性、灵敏性和重复性。用不同浓度LM活菌与死菌对奶酪棒样品进行人工污染,比较传统的平板计数法和作者建立的PMAxx-ddPCR检测方法的结果;进一步对市售金针菇和火腿肠进行检测,评估PMAxx-ddPCR检测方法的实际效果。【结果】在PMAxx终浓度为10μmol/L、暗处理时间和曝光时间均为10 min时,PMAxx可显著抑制死菌DNA扩增,但对活菌DNA扩增没有显著影响。建立的PMAxx-ddPCR检测方法仅对LM产生特异性扩增,定量限为147 CFU/mL,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于20%,重复性较好。人工污染奶酪棒试验结果表明,平板计数法和PMAxx-ddPCR检测方法对LM的定量结果差异不显著(P>0.05)。进一步分析17份金针菇和16份火腿肠样品检测结果,PMAxx-ddPCR检测法和平板计数法均从7份金针菇样品中检出LM,且2种方法定量结果没有显著差异(P>0.05)。【结论】作者建立的LM活菌的PMAxx-ddPCR检测方法可对食品中LM活菌进行特异性定量检测。展开更多
建立一种荧光染料叠氮溴化丙锭(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的技术,同时利用羟基萘酚蓝(HNB)染料对婴儿配方奶粉中沙门氏菌活菌进行快速可视化检测。以沙门氏菌siiA基因为靶点,设计特异性引物,利用PMA抑制死菌DNA的扩增反应,反应...建立一种荧光染料叠氮溴化丙锭(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的技术,同时利用羟基萘酚蓝(HNB)染料对婴儿配方奶粉中沙门氏菌活菌进行快速可视化检测。以沙门氏菌siiA基因为靶点,设计特异性引物,利用PMA抑制死菌DNA的扩增反应,反应前向体系中加入HNB染料,通过颜色变化对目标菌进行快速检测。结果表明,PMA的最佳处理浓度为3μg/mL,体系中HNB的最优浓度为150μmol/L,所构建的PMA-LAMP-HNB方法对沙门氏菌纯培养物的检测灵敏度为4.6×10^1CFU/mL,对人工污染婴儿配方奶粉中该菌的检测灵敏度为6.3×10^1CFU/g,是传统PCR方法的100倍,且总检测时间不超过1 h 30 min。展开更多
实时监测发酵过程中的微生物动态对葡萄酒的质量控制至关重要。开发了一种将荧光染料叠氮溴化丙啶(propidium monoazide,PMA)与CELL-qPCR相结合的方法,不需要提取DNA,即可以高效、快速地检测葡萄酒发酵过程中酿酒酵母的动态变化。针对...实时监测发酵过程中的微生物动态对葡萄酒的质量控制至关重要。开发了一种将荧光染料叠氮溴化丙啶(propidium monoazide,PMA)与CELL-qPCR相结合的方法,不需要提取DNA,即可以高效、快速地检测葡萄酒发酵过程中酿酒酵母的动态变化。针对酿酒酵母开发的PMA-CELL-qPCR计数方法对葡萄酒环境下的细胞破壁处理、PMA处理浓度、PMA检测灵敏度和样品预处理等多种条件进行了优化,结果表明,优化后的方法可以准确定量目标菌株10~3~10~7CFU/mL;当体系中死菌与活菌的浓度比例高于10000∶1时,检测结果存在0.5 lg CFU/mL的误差;用优化的PMA-CELL-qPCR方法监测赤霞珠葡萄酒发酵过程中酿酒酵母的动态变化,结果与平板计数法一致。研究开发的PMA-CELL-qPCR对酿酒酵母的活菌定量方法具有定量准确、操作简单等优势,可以作为准确监测葡萄酒和其他果酒中微生物动态变化的手段。展开更多
文摘【目的】将改良版叠氮溴化丙锭(improved propidium monoazide,PMAxx)与微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术相结合,建立一种针对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)活菌的检测方法。【方法】对PMAxx终浓度、暗处理时间及曝光时间进行优化,建立最佳的PMAxx-ddPCR检测体系,并用不同体积比的LM活菌验证其准确性,考察PMAxx-ddPCR检测方法的特异性、灵敏性和重复性。用不同浓度LM活菌与死菌对奶酪棒样品进行人工污染,比较传统的平板计数法和作者建立的PMAxx-ddPCR检测方法的结果;进一步对市售金针菇和火腿肠进行检测,评估PMAxx-ddPCR检测方法的实际效果。【结果】在PMAxx终浓度为10μmol/L、暗处理时间和曝光时间均为10 min时,PMAxx可显著抑制死菌DNA扩增,但对活菌DNA扩增没有显著影响。建立的PMAxx-ddPCR检测方法仅对LM产生特异性扩增,定量限为147 CFU/mL,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于20%,重复性较好。人工污染奶酪棒试验结果表明,平板计数法和PMAxx-ddPCR检测方法对LM的定量结果差异不显著(P>0.05)。进一步分析17份金针菇和16份火腿肠样品检测结果,PMAxx-ddPCR检测法和平板计数法均从7份金针菇样品中检出LM,且2种方法定量结果没有显著差异(P>0.05)。【结论】作者建立的LM活菌的PMAxx-ddPCR检测方法可对食品中LM活菌进行特异性定量检测。
文摘建立一种荧光染料叠氮溴化丙锭(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的技术,同时利用羟基萘酚蓝(HNB)染料对婴儿配方奶粉中沙门氏菌活菌进行快速可视化检测。以沙门氏菌siiA基因为靶点,设计特异性引物,利用PMA抑制死菌DNA的扩增反应,反应前向体系中加入HNB染料,通过颜色变化对目标菌进行快速检测。结果表明,PMA的最佳处理浓度为3μg/mL,体系中HNB的最优浓度为150μmol/L,所构建的PMA-LAMP-HNB方法对沙门氏菌纯培养物的检测灵敏度为4.6×10^1CFU/mL,对人工污染婴儿配方奶粉中该菌的检测灵敏度为6.3×10^1CFU/g,是传统PCR方法的100倍,且总检测时间不超过1 h 30 min。
文摘实时监测发酵过程中的微生物动态对葡萄酒的质量控制至关重要。开发了一种将荧光染料叠氮溴化丙啶(propidium monoazide,PMA)与CELL-qPCR相结合的方法,不需要提取DNA,即可以高效、快速地检测葡萄酒发酵过程中酿酒酵母的动态变化。针对酿酒酵母开发的PMA-CELL-qPCR计数方法对葡萄酒环境下的细胞破壁处理、PMA处理浓度、PMA检测灵敏度和样品预处理等多种条件进行了优化,结果表明,优化后的方法可以准确定量目标菌株10~3~10~7CFU/mL;当体系中死菌与活菌的浓度比例高于10000∶1时,检测结果存在0.5 lg CFU/mL的误差;用优化的PMA-CELL-qPCR方法监测赤霞珠葡萄酒发酵过程中酿酒酵母的动态变化,结果与平板计数法一致。研究开发的PMA-CELL-qPCR对酿酒酵母的活菌定量方法具有定量准确、操作简单等优势,可以作为准确监测葡萄酒和其他果酒中微生物动态变化的手段。
