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人periostin干扰载体的构建及其对成纤维细胞目的基因表达的影响 被引量：6
1
作者 刘畅 宋振华 秦泽莲 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期503-508,共6页
目的:为了研究人成骨细胞特异因子-2(periostin,POSTN)基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响,构建shRNA质粒和慢病毒载体,观察其对293T细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞的POSNT基因表达的抑制作用,检测shRNA慢病毒载体对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖... 目的:为了研究人成骨细胞特异因子-2(periostin,POSTN)基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响,构建shRNA质粒和慢病毒载体,观察其对293T细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞的POSNT基因表达的抑制作用,检测shRNA慢病毒载体对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响。方法:设计特异性干扰人POSTN基因的小发卡RNA序列,合成含有干扰序列的双链DNAoligo,与经双酶切后的质粒连接,转化感受态大肠杆菌DH5α并对阳性克隆进行PCR扩增测序鉴定。将构建的质粒采用脂质体共转染入293T细胞,36～48h后采用Westernblot的方法检测目的蛋白的表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果。将干扰效果最好的序列包装shRNA质粒和慢病毒载体,利用生成的POSTNshRNA质粒和慢病毒分别感染293T细胞和原代瘢痕疙瘩成纤维细胞,检测两种细胞目的基因、蛋白的表达,进而观察基因干扰后瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖变化。结果:转染干扰质粒原代瘢痕疙瘩成纤维细胞、感染空质粒阴性对照细胞和正常皮肤成纤维细胞的POSTNmRNA表达分别为1.98±0.03、1.12±0.03和1.08±0.03,实验组对比阴性对照组细胞的敲减率为43%(F=688.291,P<0.001)。感染干扰慢病毒原代瘢痕疙瘩成纤维细胞、感染空病毒阴性对照细胞和正常皮肤成纤维细胞的POSTNmRNA表达分别为0.44±0.09、0.81±0.07和0.37±0.05,实验组对比阴性对照组细胞的敲减率为46%(F=90.06,P<0.001)。实验组POSTN蛋白表达水平(0.29±0.04)比阴性对照组细胞(0.53±0.09)的表达降低45%(F=33.43,P<0.001),正常皮肤成纤维细胞POSTN蛋白的表达水平为0.23±0.02。感染干扰质粒和慢病毒的原代瘢痕疙瘩成纤维细胞与空质粒转染的对照细胞相比,POSTN蛋白和mRNA的表达水平亦明显降低,并趋近正常皮肤成纤维细胞的表达。从感染慢病毒48h开始,干扰组瘢痕疙瘩成纤维细胞与空质粒转染的对照组细胞相比增殖明显减慢,抑制率达19%。结论:本方法构建的POSTN基因干扰质粒和慢病毒构建成功,其能显著降低POSTN基因和蛋白在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达,干扰POSTN基因表达抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。POSTN基因干扰质粒和慢病毒的构建成功为进一步研究POSTN基因的功能奠定了研究基础。 展开更多
关键词 periostin 成纤维细胞 rna干扰 瘢痕疙瘩 慢病毒属
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SiRNA-Smad3沉默人瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad3对纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原表达的影响 被引量：6
2
作者 刘波 果磊 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期522-526,共5页
目的:探讨SiRNA-Smad3沉默人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid fibroblast,KFB)内Smad3基因后,对KFB细胞内纤维接蛋白及Ⅰ型胶原表达水平的影响。方法:分别用针对人Smad3 mRNA基因的特异性干扰片段和无关干扰片段转染体外原培养的人KFB,经RT-... 目的:探讨SiRNA-Smad3沉默人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid fibroblast,KFB)内Smad3基因后,对KFB细胞内纤维接蛋白及Ⅰ型胶原表达水平的影响。方法:分别用针对人Smad3 mRNA基因的特异性干扰片段和无关干扰片段转染体外原培养的人KFB,经RT-PCR、Western blot、免疫组化、免疫荧光方法检测纤维连接蛋白(fibronectin)及Ⅰ型胶原(CollagenⅠ,Col等KFB细胞外基质的合成和分泌情况。结果:75nmol/L Smad3-siRNA特异性干扰片段转染KFB48h后KFB细胞内ColⅠ及合成和分泌较非特异性对照组及空白对照组明显降低。结论:Smad3-siRNA可特异性抑制KFB细胞中Smad3基因表达,并效抑制体外培养的人原代KFB合成和分泌ColⅠ及纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)。 展开更多
关键词 rna干扰 SMAD3 瘢痕疙瘩 成纤维细胞
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转化生长因子β型受体Ⅰ基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在人胚肺成纤维细胞中的表达 被引量：2
3
作者 林时辉 付娟 +1 位作者 王川江 刘琼 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期915-922,共8页
目的:构建转化生长因子β型受体Ⅰ(transforming growth factor beta receptorⅠ,TGFβRⅠ)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体并在人胚肺成纤维细胞株MRC-5上鉴定其沉默效应。方法:构建4种针对人TGFβRⅠ基因不同干扰靶点... 目的:构建转化生长因子β型受体Ⅰ(transforming growth factor beta receptorⅠ,TGFβRⅠ)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体并在人胚肺成纤维细胞株MRC-5上鉴定其沉默效应。方法:构建4种针对人TGFβRⅠ基因不同干扰靶点的慢病毒干扰载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,将筛选出的4种有效重组慢病毒干扰载体和其它辅助质粒一起共转染293T细胞并测定病毒滴度。最后将4种重组的慢病毒干扰载体分别感染MRC-5细胞,采用Real-time PCR和Western blot检测它们对靶基因的沉默效率。结果:经双酶切鉴定和DNA测序,证实短发夹RNA正确插入慢病毒载体且插入的序列正确。4种重组慢病毒干扰载体经293T细胞成功包装后,其病毒滴度分别为:si RNA-1 6.37×107 TU/ml、si RNA-2 1.65×108 TU/ml、si RNA-3 4.50×108TU/ml、si RNA-4 2.31×108TU/ml,阴性对照组载体包装后的病毒滴度为:1.79×109 TU/ml。4种重组慢病毒干扰载体感染MRC-5细胞的效率均为93%左右。与正常对照组和阴性对照组比较,在感染4种重组慢病毒干扰载体(si RNA-1~4)后,MRC-5细胞内TGFβRⅠm RNA表达水平均明显下降(P=0.000),其中TGFβRⅠ-si RNA-2下降最明显,沉默效率最好。Western blot结果与q RT-PCR结果一致,4种重组慢病毒干扰载体均能使MRC-5细胞内TGFβRⅠ蛋白表达明显下降(P=0.000),且TGFβRⅠ-si RNA-2干扰效率最大。结论:筛选并构建了能有效沉默TGFβRⅠ基因的最佳RNAi重组慢病毒载体——TGFβR-si RNA-2,从而为后续研究奠定基础。 展开更多
关键词 rna干扰 慢病毒载体 转化生长因子βⅠ型受体 人胚肺成纤维细胞
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shRNA抑制Smad3基因的表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7表达的影响 被引量：1
4
作者 但洋 沈为民 果磊 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1172-1176,共5页
目的构建抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast,KFB)Smad3基因表达的shRNA真核表达载体。研究Smad3 shRNA对KFB Smad7表达的影响。方法用前期实验筛选出的1对最有效siRNA重组构建Smad3 shRNA表达质粒。通过脂质体介导的方法,将Smad... 目的构建抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast,KFB)Smad3基因表达的shRNA真核表达载体。研究Smad3 shRNA对KFB Smad7表达的影响。方法用前期实验筛选出的1对最有效siRNA重组构建Smad3 shRNA表达质粒。通过脂质体介导的方法,将Smad3 shRNA转染到KFB,用RT-PCR及Western blot的方法检测Smad3、Smad7在不同时间点(0～9d)表达的变化。结果①RT-PCR和Western blot的结果证实Smad3 shRNA载体构建成功。②转染Smad3 shRNA后,随着时间的延长,KFB中Smad3的mRNA与蛋白表达都显著减低,到72h作用最强。光密度分析与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Smad7的mRNA与蛋白表达都明显升高(P<0.05)。结论体外构建的shRNA-Smad3 RNAi真核表达载体能显著抑制KFB Smad3的表达。Smad3可能对Smad7起反向调节的作用。 展开更多
关键词 瘢痕疙瘩 成纤维细胞 SMAD3 SMAD7 rna干扰 SHrna
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shRNA对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3及Ⅰ型胶原表达的影响 被引量：2
5
作者 但洋 沈为民 《激光杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期78-80,共3页
目的:构建抑制瘢痕成纤维细胞(keloid fibroblast,KFB)Smad3基因表达的shRNA真核表达载体。研究Smad3 shRNA对KFBSmad3及I型胶原(type I collagen,COL1A2)表达的影响。方法:用前期实验筛选出的1对最有效SiRNA重组构建Smad3shRNA表达质... 目的:构建抑制瘢痕成纤维细胞(keloid fibroblast,KFB)Smad3基因表达的shRNA真核表达载体。研究Smad3 shRNA对KFBSmad3及I型胶原(type I collagen,COL1A2)表达的影响。方法:用前期实验筛选出的1对最有效SiRNA重组构建Smad3shRNA表达质粒。通过脂质体介导的方法,将Smad3 shRNA转染到KFB,用RT-PCR及Western blot的方法检测Smad3、COLlA2在不同时间点(0d至9d)表达的变化。结果:①重组质粒经酶切鉴定和测序、RT-PCR和Western blot的结果均证实Smad3 shRNA载体构建成功。②转染Smad3 shRNA后,随着时间的延长,KFB中Smad3的mRNA与蛋白表达都显著减低,到72h作用最强。光密度分析与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。COLlA2的mRNA与蛋白表达都明显下降(P<0.05)。结论:体外构建的shRNA-Smad3 RNAi真核表达载体能显著抑制KFBSmad3的表达。并使其I型胶原mRNA和蛋白水平表达出现相同的变化,提示Smad3 shRNA可能是改善皮肤创面愈合和抑制瘢痕增生一个新的治疗方向。 展开更多
关键词 瘢痕成纤维细胞 SMAD3 Ⅰ型胶原 rna干扰 SHrna
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RNA干扰敲低GSK-3β对瘢痕疙瘩形成影响的体外研究 被引量：2
6
作者 蔡玉梅 朱世泽 +3 位作者 杨维群 潘明孟 王朝阳 吴文艺 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期154-160,共7页
目的:利用RNA干扰技术探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFB)的抑制效果。方法:将针对人GSK-3β基因设计合成的3对特异性小干扰RNA(siRNA)分别转染体外培养的人KFB,通过RT-PCR和Western blot... 目的:利用RNA干扰技术探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFB)的抑制效果。方法:将针对人GSK-3β基因设计合成的3对特异性小干扰RNA(siRNA)分别转染体外培养的人KFB,通过RT-PCR和Western blot筛选出干扰人KFB GSK-3β基因表达的最佳siRNA,进而转染人KFB,并用RT-PCR和Western blot检测GSK-3β及相关蛋白的m RNA和蛋白表达。结果:1434序列具有最佳的GSK-3βm RNA和蛋白抑制效率。转染GSK-3βsiRNA后,KFB的β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p-GSK-3β和Wnt2的蛋白水平下降,KFB活力下降,且随着培养时间的延长,细胞生长受抑制程度增大,细胞倍增时间明显延迟。结论:转染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低该基因在KFB内的表达,从而抑制了瘢痕疙瘩生长,具有潜在的治疗前景。 展开更多
关键词 糖原合成酶激酶3Β 瘢痕疙瘩 成纤维细胞 rna干扰
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人瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad2特异siRNA的制备和活性鉴定
7
作者 高中玉 林子豪 +6 位作者 汪滋民 江华 袁湘斌 赵耀忠 吴宏 史毅 金由辛 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期34-37,共4页
目的:探讨应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞内Smad2 基因表达,筛选高效特异性siRNA。方法:根据siRNA设计原则,针对人Smad2 基因序列特征设计Smad2 特异siRNA(1 3),转染瘢痕疙瘩成纤维细胞,RT ... 目的:探讨应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞内Smad2 基因表达,筛选高效特异性siRNA。方法:根据siRNA设计原则,针对人Smad2 基因序列特征设计Smad2 特异siRNA(1 3),转染瘢痕疙瘩成纤维细胞,RT PCR检测siRNA对Smad2 基因的抑制效果。结果:Smad2 siRNA 3 可有效抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad2 基因的表达。随siRNA 3 终浓度由50 nmol/L增加到100 nmol/L 及200 nmol/L,抑制效率逐渐增强(P<0.05);siRNA 3以终浓度200 nmol/L转染后24 h抑制效果最强,48 h 逐渐减弱,但仍明显抑制(P< 0. 05)。结论:应用RNA干扰技术可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad2 基因的表达,其抑制作用具有明显的时间、浓度依赖性。 展开更多
关键词 rna干扰 SMAD2 瘢痕疙瘩 成纤维细胞
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Myostatin基因沉默绵羊成纤维细胞系的建立 被引量：8
8
作者 唐大运 朱化彬 +5 位作者 吴健敏 杜卫华 王栋 赵学明 陈汉忠 林秀坤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1368-1373,共6页
旨在获得肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因沉默的成纤维细胞系,为进一步探索Myostatin的调控机理,获得Myostatin的基因沉默的转基因羊奠定基础。针对小尾寒羊Myostatin的基因序列,设计4条siRNA干扰序列,构建pSilencer干扰载体,转染... 旨在获得肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因沉默的成纤维细胞系,为进一步探索Myostatin的调控机理,获得Myostatin的基因沉默的转基因羊奠定基础。针对小尾寒羊Myostatin的基因序列,设计4条siRNA干扰序列,构建pSilencer干扰载体,转染成纤维细胞,采用RT-PCR进行筛选;构建慢病毒干扰载体,包装病毒,感染成纤维细胞,采用流式细胞技术分选阳性细胞,阳性细胞予以测序鉴定并检测沉默效果。结果,获得Myostatin基因沉默效率约90%的RNA干扰片段PSL1,包装病毒获得滴度为1×108的病毒颗粒,流式细胞技术分选得到纯度达99%的Myostatin基因沉默成纤维细胞系。采用慢病毒感染接合流式细胞术分选,能较快获得无抗性标记的转基因阳性细胞系,为培育Myostatin基因沉默的转基因羊及探索Myostatin的调控机理奠定基础。 展开更多
关键词 肌肉生长抑制素 rna干扰 慢病毒 绵羊成纤维细胞
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